Summary
Ici, nous présentons un protocole pour détecter les bactéries productrices de sulfure d’hydrogène avec un protocole modifié utilisé pour la précipitation du sulfure de bismuth (BS). Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.
Abstract
Le sulfure d’hydrogène (H2S) est un gaz toxique produit par les bactéries dans la protéolyse des acides aminés et des protéines contenant du soufre qui joue un rôle important dans la santé humaine. Le test de production H2S est l’un des tests d’identification biochimique bactérienne importants. Les méthodes traditionnelles sont non seulement fastidieuses et chronophages, mais aussi sujettes à l’inhibition de la croissance bactérienne en raison de l’effet toxique des sels de métaux lourds dans un milieu contenant du soufre, ce qui conduit souvent à des résultats négatifs. Ici, nous avons établi une méthode simple et sensible pour détecterH2Sdans les bactéries. Cette méthode est une version modifiée de la précipitation du sulfure de bismuth (BS) qui utilise des plaques de microtitrage transparentes à 96 puits. La culture bactérienne a été combinée avec une solution de bismuth contenant de la L-cystéine et cultivée pendant 20 minutes, à la fin de laquelle un précipité noir a été observé. La limite de détection visuelle pour H 2 S était de0,2mM. Sur la base du changement de couleur visuel, la détection simple, à haut débit et rapide des bactéries productrices de H2S peut être réalisée. En résumé, cette méthode peut être utilisée pour identifier la production deH2Schez les bactéries.
Introduction
Les bactéries productrices de sulfure d’hydrogène peuvent utiliser des acides aminés et des protéines contenant du soufre pour produire du sulfure d’hydrogène (H2S). La production de H2S se produit généralement dans les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae à Gram négatif et aussi chez les membres de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. et Shewanella spp.1. Ces bactéries ont la capacité de réduire le sulfate en sulfure d’hydrogène (H2S) afin d’obtenir de l’énergie. Le sulfure d’hydrogène a été impliqué dans le développement de la résistance bactérienne aux médicaments. H2Sprotège les bactéries de la toxicité des espèces réactives de l’oxygène (ROS), antagonisant ainsi l’effet antibactérien des antibiotiques 2,3. H2S a également un effet physiologique important dans le maintien de l’homéostasie. Aux niveaux supraphysiologiques, H2S s’est avéré profondément toxique pour le corps. Dans le corps humain, H2S a un autre rôle en tant que molécule de signalisation de gaz impliquée dans une variété de processus physiologiques et pathologiques. H2Speut réguler la fonction systolique du cœur et joue un rôle physiologique important dans la relaxation des vaisseaux sanguins, l’inhibition du remodelage vasculaire, et la protection du myocarde 4,5. H2Sjoue également un rôle important dans la régulation du système nerveux et du tube digestif 6,7. Il a été constaté que, lorsqu’elles sont exposées à des antibiotiques bactéricides, les bactéries produisent des espèces réactives mortelles de l’oxygène (ROS) entraînant la mort cellulaire 8,9,10,11.
En tant que test biochimique courant dans les cours de laboratoire de microbiologie, le test au sulfure d’hydrogène est une expérience importante dans l’identification des bactéries, en particulier des bactéries de la famille des Enterobacteriaceae. À l’heure actuelle, le test de sulfure d’hydrogène est généralement effectué sur un grand nombre d’acides aminés contenant du soufre et un milieu d’acétate de plomb inoculé avec les bactéries à tester. Après une période d’incubation (2-3 jours), les résultats sont jugés en observant si le milieu de culture ou la bande de papier acétate de plomb est noirci en raison de la production d’acétate de plomb11. Cependant, ces méthodes traditionnelles sont non seulement fastidieuses et chronophages, mais aussi sujettes à l’inhibition de la croissance bactérienne en raison de l’effet toxique des sels de métaux lourds dans un milieu contenant du soufre, ce qui conduit souvent à des résultats négatifs. Une méthode basée sur le bismuth a été établie pour la détection de H2S12,13. H2S peut réagir avec le bismuth, formant une précipitation de sulfure de bismuth noir. Afin de mener une réforme pour ce test biochimique, une méthode simple et rapide sans effets secondaires sur la croissance bactérienne doit être établie. Ici, nous avons mis en place une méthode simple pour la détection des bactéries productrices de sulfure d’hydrogène cultivées dans un environnement in vitro en utilisant le sulfure de bismuth comme substrat dans un format de plaque de microtitrage à 96 puits.
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Protocol
1. Souches bactériennes
REMARQUE : Pour cette expérience, neuf souches standard ont été utilisées, dont Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris et Klebsiella pneumoniae (tableau 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa et Proteus vuigaris peuvent produire H2S, comme indiqué dans la littérature précédente1.
- Préparation de la culture bactérienne
- Transférer une colonie bactérienne de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 et Klebsiella pneumoniae d’une boîte de gélose Luria-Bertani (LB) à 100 mL de milieu LB et culture à 37 °C pendant 12-16 h jusqu’à ce que la concentration bactérienne soit d’environ 1 x 109 cellules/mL (comme indiqué par DO600 = 1).
- Transférer une colonie bactérienne de Fusobacterium nucleatum et de Proteus vuigaris à partir de plaques de gélose au bouillon de soja trypticase (BST) à 100 mL de milieu BST et culture en anaérobiose à 37 °C pendant 24 h jusqu’à ce que la concentration bactérienne soit d’environ 1 x 109 cellules/mL (comme indiqué par OD600 = 1).
2. Essai de détection H2S
- Test de production de sulfure d’hydrogène
- Mélanger 100 μL de culture bactérienne avec 100 μL de solution de bismuth nouvellement préparée (pH 8,0; chlorure de bismuth (III) 10 mM, 0,4 M de triéthanolamine-HCl, 20 mM de pyridoxal 5-phosphate monohydraté, 20 mM d’EDTA et 40 mM de L-cystéine) dans les plaques de microtitrage à 96 puits et culture pendant 20 minutes à 37 °C. Pour chaque souche bactérienne, effectuer l’analyse en trois exemplaires.
- Après 20 min, vérifiez s’il y a un changement de couleur. Si la couleur de la solution passe du jaune clair au noir, cela indique que la bactérie est capable de produire H2S. Répétez cette mesure 3x.
- Sensibilité de la méthode
- Déterminer la sensibilité de la méthode en utilisant différentes concentrations d’hydrosulfure de sodium (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM et 0 mM, mélangé avec la solution BS 14.
- Déterminer la présence de HS−/S2− en observant la formation d’un précipité BS noir. Évaluez la couleur des puits à l’aide d’une échelle visuelle allant de la production sans couleur (-) à la production de couleur noire la plus foncée (++++++).
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Representative Results
Détection de bactéries productrices de sulfure d’hydrogène
L’efficacité de l’essai H2S a été étudiée à l’aide de cultures pures de souches bactériennes sélectionnées, comme indiqué dans le tableau 1. Les résultats ont indiqué que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa et Proteus vuigaris peuvent produire H2S avec précipité BS noir, tandis que Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila et Klebsiella pneumoniae n’ont montré aucun précipité noir. La production de H2S la plus rapide a été observée pour Fusobacterium nucleatum, atteignant la production maximale de couleur (Figure 1).
Sensibilité de la méthode
La sensibilité a été déterminée en mélangeant différentes concentrations d’hydrosulfure de sodium (NaHS) avec une solution de BS. L’inspection visuelle a révélé que la profondeur de couleur de la solution s’approfondissait avec une concentration croissante d’ions HS−/S 2− (Figure 2). La limite de détection deH2Spour la méthode est de 0,2 mM.
Figure 1 : Détection de bactéries productrices de sulfure d’hydrogène. La production deH2Sdans Fusobacterium nucleatum a été détectée par la formation de précipités noirs de BS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sensibilité de la méthode au sulfure de bismuth (BS). La sensibilité de la méthode BS pour la détection de H2S a été enregistrée comme aucune production de couleur (-) à la production de couleur noire la plus foncée (+++++). De gauche à droite, les concentrations de NaHS sont de 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM et 0 mM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Espèce | H2S production a | |
| Salmonella paratyphi Un | _ | |
| Salmonella paratyphi B | +++ | |
| Fusobacterium nucleatum | ++++ | |
| Enterococcus faecalis | + | |
| Staphylococcus aureus | _ | |
| Pseudomonas aeruginosa | ++ | |
| Aeromonas hydrophila | _ | |
| Proteus vuigaris | + | |
| Klebsiella pneumoniae | _ | |
Tableau 1 : Évaluation visuelle de la production deH2S. La production de sulfure d’hydrogène (H2S) par différentes souches bactériennes a été mesurée à l’aide de la méthode visuelle dans une plaque de microtitrage à 96 puits. a: Enregistré sous forme de précipitation de sulfure de bismuth noir (BS) de l’absence de production de couleur (-) à la production de couleur noire (+).
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Discussion
Le test de production de sulfure d’hydrogène est l’un des tests phénotypiques conventionnels pour l’identification et la différenciation des souches bactériennes. De nombreuses espèces bactériennes peuvent produire du sulfure d’hydrogène dans leur environnement naturel, comme l’eau aquatique. Ces espèces bactériennes comprennent Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., certaines souches de Klebsiella sp., Escherichia coli et certaines espèces de Clostridia anaérobies15,16. Cependant, la sensibilité de la méthode d’essai traditionnelle H2S est faible et la méthode prend beaucoupde temps 17,18. Le milieu d’essai traditionnel H2S contient du PbAc, qui a des effets toxiques sur la croissance des bactéries, et la culture est inoculée par perforation en gélose semi-solide. La teneur en oxygène dans la partie inférieure du milieu est faible, de sorte que les bactéries aérobies se développent mal. Par conséquent, cela conduit souvent à des résultats faussement négatifs.
Dans cette méthode, nous avons utilisé du bismuth (III) au lieu de plomb ou d’ions ferreux. Lorsqu’un isolat bactérien produisantH2Sest exposé au chlorure de bismuth (III), une réaction de substitution a lieu. Dans cette réaction, les positions d’échange d’ions chlorure et sulfure, produisant de l’acide chlorhydrique et du sulfure de bismuth (III); ce produit sulfuré de bismuth (III) précipite hors de la solution sous forme de solide noir. La profondeur de couleur du précipité noir peut être utilisée dans une certaine mesure pour déterminer la quantité deH2Sproduite par la souche bactérienne. Sur la base de la précipitation BS et de la reproductibilité, de la fiabilité et de la simplicité élevées, la méthode présentée dans l’étude a été établie comme un test de sulfure d’hydrogène pour la détection des bactéries productrices deH2S. L’étape critique de cette méthode est que la solution de bismuth doit être préparée fraîche. Par rapport à la méthode traditionnelle, il n’y a pas de toxicité des sels de métaux lourds dans la croissance des bactéries, et elle peut également gagner du temps pour la détection des bactéries aérobies productrices de sulfure d’hydrogène.
Dans cet article, basé sur la réaction du chlorure de bismuth (III) et deH 2 S, qui a produit la précipitation BS visblack, une méthode simple, sensible, peu coûteuse et à haut débit pour la détection des bactéries productrices de H2S est présentée. Cette méthode est utile pour la détection rapide d’échantillons contaminés.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD) et le projet de recherche sur la réforme de l’enseignement de l’Université pharmaceutique de Chine (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
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