Summary
Hjernemetastase er en årsag til alvorlig sygelighed og dødelighed hos kræftpatienter. De fleste hjernemetastase musemodeller kompliceres af systemiske metastaser, der forvirrer analyse af dødelighed og terapeutiske interventionsresultater. Præsenteret her er en protokol for intern carotisinjektion af kræftceller, der producerer konsistente intrakranielle tumorer med minimale systemiske tumorer.
Abstract
Hjernemetastase er en årsag til alvorlig sygelighed og dødelighed hos kræftpatienter. Kritiske aspekter af metastatiske sygdomme, såsom det komplekse neurale mikromiljø og stromal celleinteraktion, kan ikke helt replikeres med in vitro-assays ; Dyremodeller er således afgørende for at undersøge og forstå virkningerne af terapeutisk intervention. Imidlertid producerer de fleste hjernetumor xenograferingsmetoder ikke hjernemetastaser konsekvent med hensyn til tidsrammen og tumorbyrden. Hjernemetastasemodeller genereret ved intrakardial injektion af kræftceller kan resultere i utilsigtet ekstrakraniel tumorbyrde og føre til ikke-hjernemetastatisk sygelighed og dødelighed. Selvom intrakraniel injektion af kræftceller kan begrænse ekstrakraniel tumordannelse, har den flere forbehold, såsom at de injicerede celler ofte danner en enestående tumormasse på injektionsstedet, høj leptomeningeal involvering og skade på hjernens vaskulatur under nåleindtrængning. Denne protokol beskriver en musemodel af hjernemetastase genereret ved intern carotisarterieinjektion. Denne metode producerer intrakranielle tumorer konsekvent uden involvering af andre organer, hvilket muliggør evaluering af terapeutiske midler til hjernemetastase.
Introduction
Hjernemetastase er en udbredt malignitet forbundet med en meget dårlig prognose 1,2. Standarden for pleje af hjernemetastasepatienter er multimodal, bestående af neurokirurgi, helhjernestrålebehandling og / eller stereotaktisk radiokirurgi afhængigt af patienternes generelle sundhedsstatus, ekstrakraniel sygdomsbyrde og antallet og placeringen af tumorer i hjernen 3,4. Patienter med op til tre intrakranielle læsioner er berettiget til kirurgisk resektion eller stereotaktisk radiokirurgi, mens helhjernestrålebehandling anbefales til patienter med flere læsioner for at undgå risikoen for kirurgisk relateret infektion og ødem5. Imidlertid kan hele hjernens strålebehandling forårsage skade på radiofølsomme hjernestrukturer, hvilket bidrager til dårlig livskvalitet6.
Systemisk terapi er en ikke-invasiv alternativ og logisk tilgang til behandling af patienter med flere læsioner7. Det overvejes dog mindre på grund af den mangeårige forestilling om, at systemiske terapier har dårlig effekt, fordi passiv levering af cytotoksiske lægemidler via blodbanen ikke kan opnå terapeutiske niveauer i hjernen uden risiko for usikker toksicitet8. Dette paradigme begynder at ændre sig med den nyligt godkendte systemiske behandling (tucatinib med trastuzumab og capecitabin indiceret til metastatisk HER2+ brystkræfthjernemetastase)9,10,11,12 og opdateringen i behandlingsretningslinjer til at omfatte overvejelse af systemiske behandlingsmuligheder for hjernemetastasepatienter13,14.
I denne sammenhæng kan udviklingen inden for molekylær målrettet terapi, immunterapi og alternative lægemiddelleveringssystemer, såsom en målrettet nano-lægemiddelbærer, potentielt overvinde udfordringerne ved hjernemetastasebehandling15,16,17,18. Derudover undersøges også kemiske og mekaniske tilgange til forbedring af lægemiddelafgivelse via permeabilisering af hjernetumorbarrieren19,20. For at studere og optimere sådanne tilgange til at være egnede til formålet er det afgørende at anvende prækliniske modeller, der ikke kun afspejler den komplekse fysiologi af hjernemetastase, men også giver mulighed for objektiv analyse af intrakranielt lægemiddelrespons.
Generelt involverer de nuværende tilgange til modelhjernemetastase in vivo intracardiac (venstre ventrikel), intravenøs (normalt halevene), intrakraniel eller intracarotis (almindelig halspulsåre) injektion af kræftceller hos mus 21,22,23,24,25,26,27 . Bortset fra tumor engraftment strategier, genetisk manipulerede musemodeller, hvor tumordannelse udløses ved fjernelse af tumor suppressor gener eller aktivering af onkogener er nyttige til tumor modellering. Imidlertid rapporteres kun få genetisk manipulerede musemodeller at producere sekundære tumorer og endnu færre, der pålideligt producerer hjernemetastaser28,29,30.
Engraftment metoder såsom intracardiac (venstre ventrikel) og intravenøs (normalt hale vene) injektion efterligne den systemiske spredning af kræft. Disse modeller producerer typisk læsioner i flere organer (f.eks. hjerne, lunger, lever, nyrer, milt) afhængigt af kapillærsengen, der fanger de fleste tumorceller under deres kredsløb 'første pas'31. Imidlertid vil inkonsekvente hjernetransplantationshastigheder kræve flere dyr for at opnå stikprøvestørrelsen for den ønskede statistiske effekt. Antallet af tumorceller, der til sidst bliver etableret i hjernen via disse intrakardiale og intravenøse injektionsmetoder, er variabelt. Derfor kan hjernemetastase tumorbyrde variere mellem dyr, og forskellen i progression kan gøre standardisering af den eksperimentelle tidslinje og fortolkning af resultater til en udfordring. Den ekstrakranielle tumorbyrde kan føre til ikke-hjernemetastasedødelighed, hvilket gør disse modeller uegnede til evaluering af intrakraniel effekt. Hjerne-tropiske cellelinjer er blevet etableret ved hjælp af kunstige klonale selektionsprocesser for at reducere ekstrakraniel etablering, men optagelseshastigheder har været inkonsekvente, og den klonale udvælgelsesproces kan reducere heterogeniteten, der normalt findes i humane tumorer32.
Hjernespecifikke engraftmentmetoder såsom intrakraniel og intracarotisinjektion giver mulighed for mere konsekvent og effektiv hjernemetastasemodellering. I den intrakranielle metode33 injiceres kræftceller typisk i den frontale hjernebark, som genererer hurtig og reproducerbar tumorudvækst med lav systemisk involvering. Mens proceduren tolereres godt med lav dødelighed33, er advarslerne, at det er en relativt rå tilgang, der hurtigt introducerer en (lokaliseret) bolus af celler i hjernen og ikke modellerer tidlig hjernemetastasepatogenese. Nålen beskadiger hjernevævsvaskulaturen, som derefter forårsager lokaliseret betændelse 5,34. Fra erfaring er der en tendens til, at tumorcelleinjektion til tilbagesvaling under fjernelse af nålen, hvilket fører til leptomeningeal involvering. Alternativt leverer intracarotismetoden celler ind i den fælles halspulsåre med hjernemikrovaskulatur som den første kapillærseng, der opstår, modellering af overlevelse i omløb, ekstravasation og kolonisering24. I overensstemmelse med andre25 fandt vores erfaring med denne metode, at den kan resultere i ansigtstumorer på grund af utilsigtet levering af kræftceller via den eksterne halspulsåre til kapillærsenge i disse væv (upublicerede data). Det er muligt at forhindre ansigtstumorer ved først at ligere den ydre halspulsåre før injektion af almindelig halspulsåre (figur 1). I resten af artiklen omtales denne metode som 'indre halspulsåreinjektion'. Fra erfaring genererer den interne halspulsåreinjektionsmetode konsekvent hjernemetastase med meget få systemiske hændelser og har haft succes med at generere hjernemetastasemodeller af forskellige primære kræftformer (fx melanom, bryst- og lungekræft) (figur 1). Ulemperne er, at det er teknisk udfordrende, tidskrævende, invasivt og kræver omhyggelig optimering af cellenumre og en overvågningstidslinje. Sammenfattende producerer både de intrakranielle og interne carotisarterieinjektionsmetoder musemodeller, der er egnede til evaluering af terapeutisk indvirkning på hjernetumorrelateret overlevelsesfordel.
Denne protokol beskriver den interne carotisarterieinjektionsmetode til fremstilling af en musemodel af hjernemetastase med næsten ingen systemisk involvering og derfor egnet til præklinisk evaluering af lægemiddelfordeling og effektivitet af eksperimentel terapi.
Figur 1: Skematisk repræsentation af intern carotisarterieinjektionsprotokol for hjernemetastase. Intern halspulsåreinjektion med ekstern halspulsåreligation kan pålideligt producere en hjernemetastasemodel fra forskellige primære kræftformer. I denne protokol placeres tre ligaturer på halspulsåren (kommenteret som L1-L3 i figuren). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser blev udført inden for retningslinjerne fra Animal Ethics Committee ved University of Queensland (UQCCR / 186/19) og den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabeligt formål.
1. Forberedelse af kræftceller til injektion
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev den humane brystkræftcellelinje, BT-474 (BT474), anvendt. BT474 blev dyrket i komplet vækstmedium bestående af RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovin serum og 1% insulin. Cellerne blev opretholdt i en inkubator ved 37 ° C med 5% kuldioxid i luftatmosfæren. Godkendere cellelinjen ved hjælp af satellittandemgentagelser test35, bekræft ekspression af reporterproteinet (f.eks. luciferase), hvis nogen, og kontroller for mycoplasmainfektion.
- Frø BT474 kræftceller med en såtæthed på 2,0 x 106 celler i en T75-kolbe ved hjælp af 10 ml komplette vækstmedier og kultur (ved 37 ° C med 5% CO2) til 70% -80% sammenløb før injektion.
- På injektionsdagen kasseres vækstmedier og cellemonolaget vaskes med fosfatbufferet saltvand (PBS) to gange.
- Der tilsættes 5 ml forvarmet cellekulturdissociationsreagens (se materialetabel) og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter, eller indtil cellerne har løsnet sig. Efter 5 minutter skal du forsigtigt banke på kolben for at hjælpe celleløsrivelse.
- Tilsæt 5 ml komplet vækstmedie indeholdende 10% føtalt bovint serum for at slukke dissociationsreagensaktiviteten.
- Resuspender forsigtigt cellerne ved pipettering for at reducere celleklumper.
- Cellesuspensionen overføres til et 50 ml rør og centrifugeres ved 180 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Dekanter supernatanten og suspenderer cellepelleten i 10 ml af Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) uden calcium og magnesium for at minimere celleklumpning.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 180 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Dekanter supernatanten for at fjerne resterende serum/dissociationsreagens og resuspendere cellepelleten i 3 ml HBSS.
- Placer en 100 μm cellesi på et frisk 50 ml konisk rør og før cellesuspensionen igennem for at fjerne celleklumper.
BEMÆRK: En enkeltcellesuspension er afgørende for at minimere blodkarokklusion og risikoen for slagtilfælde ved injektion. - Beregn antallet af levedygtige celler ved hjælp af Trypan Blue-udelukkelse og et hæmocytometer med standardmetoder.
- Cellesuspensionen fortyndes med HBSS til en cellekoncentration på 2,5 x 106 celler/ml.
- Hold røret vandret på is, og vug forsigtigt røret med jævne mellemrum for at minimere klumpning. Cellesuspensionen kan opbevares på is i højst 6 timer.
BEMÆRK: Rocking blev udført manuelt, men dette kan også gøres ved hjælp af en shaker ved lave omdrejninger.
2. Forberedelse af musen til proceduren
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 4-5 uger gamle, kvindelige NOD scid mus brugt. Indfør blød diætgendannelsesmad (f.eks. Diætgel, hydrogel, moset musechow) til mus 3 dage før proceduren for at tilskynde til fodring efter proceduren.
- Autoklave kirurgiske værktøjer. Spray og tør det kirurgiske område og udstyr af med overfladedesinfektionsmiddel efterfulgt af 70% ethanol.
- Placer en dyrevarmemåtte under det kirurgiske bord for at forhindre hypotermi. Tænd for dette 30 minutter før operationen. Spray og tør det kirurgiske bord af med overfladedesinfektionsmiddel efterfulgt af 70% ethanol.
- Forbered et rent dyrehusbur og en varm varmepude til genopretning.
- Tag rent personligt beskyttelsesudstyr på (kjole, maske, hårnet og handsker). Oprethold sterilitet under hele proceduren ved hjælp af rene eksamenshandsker og en 'kun instrumenter tips' teknik.
- Anæstetiser musen med et bedøvelseskammer ved hjælp af 5% isofluran med en iltstrøm på 2 L/min, indtil musen mister pedalrefleksen.
- Tag dyret ud af kammeret og læg det i en næsekegle, der leverer 2% isofluran ved en iltstrøm på 2 l / min til den resterende kirurgiske procedure.
- Ørestansmus til identifikation og brug elektriske klippere til at barbere pelsen fra nakkeområdet. Rens overskydende hår fra udsat hud ved hjælp af tape.
- Vej musen til beregning af de nødvendige bedøvelses- og smertestillende lægemiddeldoser. Buprenorphin og meloxicam administreres ved henholdsvis 50 μg/kg og 1 mg/kg via subkutan injektion.
- Overfør musen til et varmt kirurgisk bord og fastgør næsekeglen med tape.
- Påfør okulært smøremiddel på øjnene for at forhindre tørring.
- Fastgør musen forsigtigt ved først at tilslutte de øvre fortændertænder ved hjælp af tråd, der er tapet til operationsbrættet, efterfulgt af tapning af for- og bagben. Dette trin udvider kroppen og holder nakken lige under proceduren.
- Udfør præoperativ hudforberedelse som beskrevet nedenfor.
- Tør nakken med topisk antiseptisk middel (povidon-jod) for at reducere hudens mikroflorabelastning og fjerne løst hår. Rengør fra midten af huden, arbejd udad for at forhindre rekontaminering af snitstedet. Gentag processen ved hjælp af 70% ethanol. Udfør tre skiftende runder jod og ethanol til desinfektion.
- Læg en kirurgisk drapering over dyret. Dette er skåret og formet af et stykke sterilt køkkenrulle eller autoklavepose.
- Læg sterile papirhåndklæder eller autoklaveposer til kirurgisk værktøj.
- Kontroller for refleks via 'Pinch test' for at sikre tilstrækkelig anæstesi, før du fortsætter med proceduren.
3. Intern carotisinjektion
BEMÆRK: I dette eksperiment blev en 31 G infusionskannyle og fodaktiveret sprøjtedriveropsætning brugt til at lette injektionsproceduren (supplerende figur 1). Denne opsætning er valgfri, og brugeren kan bruge en 31 G insulinsprøjte og springe trin 3.11 og 3.12 over. For at forberede infusionskanylen skal du trække og adskille nåledelen fra sprøjtemonteringsdelen af en 31 G-nål ved hjælp af to par suturklemmer. Fastgør derefter nåledelen til den ene ende af en fin infusionsslange, der er ca. 10 cm lang.
- Placer dissektionsmikroskopet over musen.
- Brug saks til at lave et lodret 15 mm snit langs midterlinjen ved nakkeområdet startende fra 5 mm under kæben til brystkassen.
- Brug to par vinklede tang, del huden og underliggende spytkirtler, og påfør retraktorer for at holde luftrøret udsat. Det næste trin vil udsætte halsbøtskappen, der ligger parallelt med luftrøret.
- Brug to par fint vinklede tang til at dissekere muskel- og fedtvævet ved siden af luftrøret for at udsætte den højre halsbæger. Halspulsåren er det fibrøse lag, der dækker den fælles halspulsåre, vene og vagusnerve, og dette bundt kan visualiseres af den lyse røde fælles halspulsåre. I denne undersøgelse blev injektionen udført på højre halspulsåre.
- Ryd et segment af den fælles halspulsåre kaudal til carotis bifurcation af den omgivende fascia og adskille den fra vagus nerve og vener.
- Isoler og ryd carotis bifurcation (krydset, der forbinder de ydre og indre halspulsårer) fra de omgivende nerver og fascia. Placer fine tang under den ydre halspulsåre og send en silkesutur (5-0 tykkelse) under arterien. Knude og stram suturen og skære overskydende linje.
BEMÆRK: Denne ligatur (L1) forhindrer injektion i at passere gennem den ydre halspulsåre. - Placer fine tang under den fælles halspulsåre og send en silkesutur (5-0 tykkelse) under arterien. Bind en knude og stram suturen i en position, der er proximal til det foreslåede injektionssted. Skær den overskydende sutur og efterlader ca. 10 mm linje.
BEMÆRK: Denne anden ligatur (L2) vil begrænse blodgennemstrømningen og blødningen efter injektion. Det bruges også til at placere og holde halspulsåren under injektionen. - Skær og fugt en strimmel (autoklaverede) engangsviskerner med lav fnug (se Materialetabel) ca. 10 mm x 5 mm. Fold strimlen i 4 mm x 5 mm, 2-3 mm tyk, og læg den under halspulsåren på det foreslåede injektionssted. Dette vil understøtte beholderen under injektionen.
- På den fælles halspulsåre rostral til det foreslåede injektionssted placeres en tredje ligering (L3) med en løs knude. Dette strammes først efter injektionen (ved trin 3.16).
- Omrør forsigtigt cellesuspensionen og træk 200 μL cellesuspension ind i en insulinsprøjte (med 31 G nål).
- Læg sprøjten i sprøjtedriveren, der er tilsluttet en aktiverende fodpedal.
- Fastgør en fin kanyle med en 31 G nål til sprøjten og prime linjen.
- Kontroller, om halspulsåren er godt placeret og under tryk.
- Ved hjælp af to fine vinklede tang, den ene forsigtigt spændt på enden af den første ligatur og den anden holder 31 G-nålen, skal du langsomt indsætte nålen med skrå op i blodkarets lumen og passe på ikke at punktere den.
- Injicer langsomt 100 μL cellesuspension (fra trin 1.13) i den fælles halspulsåre ved 10 μL/s. Dette vil levere 2,5 x 105 celler ind i blodkarret. Vellykket injektion visualiseres via rensning af blod fra carotisblodkarret.
- Løft og stram forsigtigt den løse ligatur (L3) (fra trin 3.9) umiddelbart efter tilbagetrækning af nålen for at forhindre tilbageløb og blødning. Trim overskydende sutur.
BEMÆRK: Det er normalt at observere en lille mængde blodsprøjtning efter tilbagetrækning af nålen. Der må dog ikke være nogen aktiv blødning, efter at den tredje ligatur er strammet. - Fjern stykket af fugtede engangsviskere med lav fnug.
- Brug en P200-pipette til at skylle operationshulen to gange med 150-200 μL sterilt vand eller saltvand.
- Kontroller igen for blødning, og fjern derefter retraktorerne.
- Replacer det bløde væv, spytkirtler og hud over halspulsåren og luftrøret.
- Luk snittets hudlag ved hjælp af en suturnålholder, tang og en absorberbar eller ikke-absorberbar 6/0 monofilamentsutur i et kontinuerligt mønster.
- Kassér kanylenålssprøjten, og forbered en ny opsætning til den næste mus. Brug af en ny sprøjte vil sikre, at antallet af celler, der injiceres i hver mus, er konsistent.
BEMÆRK: Repræsentative øjebliksbilleder af proceduren findes i supplerende figur 2. Hvis beholderen punkteres eller rives af nålen, indikeret ved lækage af injektion eller blødning, anses proceduren for mislykket. Herefter skal nålen trækkes tilbage, og den tredje ligatur skal straks strammes for at forhindre yderligere blødning. Hvis blødningen er vedvarende efter stramning af suturen, skal dyret aflives med pentobarbital.
4. Gendannelse efter injektion
- Buprenorphin (50 μg/kg) og meloxicam (1 mg/kg) injiceres via subkutan injektion som smertelindring efter operationen.
- Flyt dyret til et varmt og rent bur for at komme sig efter anæstesi. Det er normalt, at et dyr har dæmpet aktivitet (sammenkrøbet og inaktiv eller bevæger sig langsomt rundt) efter at have vågnet op.
- Efter 30-45 minutter overføres mus til et langsigtet holdinganlæg.
- Giv mus en blød kost (diætgel, hydrogel, mos) i mindst en uge efter operationen og kontroller fysisk status dagligt med særlig opmærksomhed for tegn på slagtilfælde, infektion, blødning omkring sårstedet.
- To dage efter operationen er det typisk for dyret at have nedsat aktivitet, mild flæset pels og tabt 15% af præoperativ kropsvægt. Administrer smertestillende (meloxicam) dagligt i 2-3 dage efter operationen for at håndtere smerte og hjælpe genopretning.
- Fra dag 3 og fremefter skal dyrene have genvundet aktivitet, øget i fodrings- og plejefrekvens og genvundet vægt. Aflive dyr med vedvarende fysiske tilstandsunderskud (smerte, sammenkrøbne, inaktive, vægttab) efter 4 dage efter operationen ved at injicere natriumpentobarbital ved 200 mg/kg via intraperitoneal injektion.
- Tumor engraftment og progression kan overvåges ved hjælp af anæstesi og billeddannelsesmodalitet efter eget valg, såsom bioluminescerende billeddannelse, MR eller PET / MR. Kravet om og evnen til at foretage en sådan billeddannelse vil i sagens natur afhænge af de enkelte projektmål og anlæg, inden for hvilke den udføres, og afhængigt af typen af indberetter af de anvendte cellelinjer, tilgængelighed af relevante radiokemiske og nukleare billeddannelsesanlæg36,37
BEMÆRK: Nogle dyr reagerer muligvis ikke godt og oplever et slagtilfælde på trods af en vellykket procedure. Efter proceduren skal dyr, der præsenterer symptomer på neurologisk nød (dreje hovedet og trække til den ene side, cirkle adfærd, rulle, slå, tab af motorisk funktion) straks aflives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning af almindelig carotisarterieinjektion med eller uden ekstern halspulsåreligation
Når kræftceller blev injiceret via den fælles halspulsåre uden først at ligere den ydre halspulsåre24, blev der fundet ansigtstumorer hos 77,8% af de podede mus (n = 7/9 dyr). Et eksempel på ansigtstumor er illustreret i supplerende figur 3. Metoden beskrevet i denne protokol forhindrer utilsigtet ansigtsmetastase ved at ligere den ydre halspulsåre før den fælles halspulsåre.
For at sammenligne de to metoder blev lectin injiceret i den fælles halspulsåre hos aflivede mus med eller uden ekstern halspulsåreligation. Derefter blev ansigtsvævet og hjernen fikset, behandlet og observeret under fluorescerende mikroskop. En reduktion i lektin blev observeret ved immunfluorescensanalyse i kindvævene, når den ydre halspulsåre blev ligeret (figur 2A-B). Resultaterne viser også, at ekstern halspulsåreligation ikke påvirkede hjernens levering, fordi lektin kan observeres i hjernevævet hos mus, der gennemgik almindelig halspulsåreinjektion med ekstern halspulsåreligation (figur 2C-D). Derfor kan dette ekstra trin lede leveringen af kræftceller via den indre halspulsåre ind i hjernen med minimal såning til ansigtsvæv.
Figur 2: Intracarotis transplantatlevering med og uden ekstern halspulsåreligation. Fluorescerende billeddannelse af højre kindmuskel (A, B) og hjerner (C, D) af mus med lectin (grøn) leveret i den fælles halspulsåre, enten med (A, C) eller uden (B, D) ekstern carotisligation. Kind og hjerne blev afbildet ved 20x og 5x forstørrelse og skala søjler repræsenterer henholdsvis 50 og 200 μm. Kerner (blå) blev farvet med DAPI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Bioluminescerende overvågning
En HER2-forstærket brystkræftcellelinje, BT474, der var genetisk modificeret til at udtrykke luciferase, blev brugt i denne undersøgelse til at muliggøre ugentlig overvågning af tumorprogression ved at administrere luciferin og udføre in vivo bioluminescerende billeddannelse. I denne BT474 hjernemetastasemodel kan bioluminescerende signaler observeres fra uge 5 efter intern carotisinjektion og gradvist vokse i intensitet over tid (figur 3).
Figur 3: Bioluminescerende overvågning og kvantificering af bioluminescenssignal. Repræsentative ugentlige bioluminescerende billeder fra uge 0 til uge 7, der viser stigende intensitet fra hovedet. Grafen viser kvantificeringen af bioluminescerende signaler hos mus. Data er midler ± standardfejl (n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)
Hjernemetastasedyremodellen blev afbildet ved hjælp af T2-vægtet MR i uge 2, 5 og 8 for at vurdere intrakraniel tumorprogression. Fra uge 5 til uge 8 kan der observeres en region med heterogen signalintensitet, hvilket indikerer en intrakraniel tumor med kompleks væskeperfusion, formodentlig fra forstyrret tumorvaskulatur (figur 4A). Blod-hjerne-barrieren i hjernemetastasemodellen forstyrres og ligner den kliniske hjernemetastase. Dette blev evalueret ved hjælp af gadoliniumkontrastforbedring efterfulgt af en T1-vægtet MR-sekvens. Gadoliniumkoncentrationen i tumorområdet øges, da den lækker fra blodcirkulationen til tumorvæv. Dette illustreres af det mørke område, der repræsenterer forkortelsen af T1-afslapningstiden (figur 4B). Data opnået kan bruges til at korrelere lægemiddeladgang til blod-hjerne-barrierepermeabilitet. Derudover kan intrakranielt tumorvolumen og overfladeareal udledes ved at udføre volumetrisk segmentering ved hjælp af 3D Slicer-billedanalysesoftwaren (figur 4C). Dette kan plottes på en graf mod tiden for at spore hjernetumorvækst.
Figur 4: Karakterisering af hjernemetastase dyremodel ved hjælp af magnetisk resonansbilleddannelse . (A) T2-vægtede tværgående, koronale og sagittale scanninger af modellen i uge 1, 5 og 8. I uge 5 kan man se et svagt ujævnt område på sagittalvisningen (rød pil), som udviklede sig til et hyperintenst og heterogent område i uge 8. (B) Dynamisk kontrastforstærket T1-vægtet MR, der viser en hjernetumor (region i rødt) før og efter injektion af gadoliniumkontrastforbedringsmiddel (CE). Mørke områder indikerer gadoliniumlækage og optagelse. (C) Tumor visualiseret på koronale, tværgående og sagittale planer blev kommenteret og segmenteret ved hjælp af 3D Slicer-billedanalysesoftwaren til at udlede intrakranielt tumorvolumen. Klik her for at se en større version af denne figur.
PET/MR-billeddannelse til bestemmelse af biodistributionen af nanomedicin
Kombinationen af forstyrret blod-hjerne-barriere og den utætte tumorvaskulatur letter den passive optagelse og akkumulering af nanoskala terapi via forbedret permeabilitet og retentionseffekt36,37. Da BT474-hjernemetastasemodellen overudtrykker HER2, blev hjernens optagelse af en zirconium-89-mærket HER2-målrettet nanomedicin ved hjælp af positronemissionstomografi / magnetisk resonans (PET / MR) billeddannelse udført (figur 5). I en kohorte af BT474 BM-mus var nanomedicinen påvist i tumorområdet højere end i ikke-involverede hjerneområder, hvilket bekræftede akkumuleringen af nanomedicin i hjernemetastaser.
Figur 5: Repræsentativt PET/MR-billede af zirconium-89 mærket HER2-målrettet nanomedicin (89Zr-HER2-NM) i BT474 hjernemetastasemus. (A) Det venstre billede viser T2-vægt MR (koronal visning), der viser hjernetumor (rød region) og ikke-involveret hjerne (blå region). De to tilstødende billeder viser MR-billeder (koronal og tværgående visning) overlejret med PET-overlejring. Den farvede PET-overlejring viser, at tumorregionen har højere optagelse af nanomedicinen (hvid, rød, gul) sammenlignet med de ikke-involverede regioner (blå / grøn). (B) Grafen illustrerer stigningen i PET-signalintensitet og optagelse af nanomedicin (injiceret dosis pr. gram, ID/g) i hjernetumorer i forhold til den ikke-involverede hjerne (n = 12). Klik her for at se en større version af denne figur.
BM-modellernes overlevelse og fysiske status
BT474 hjernemetastasemodellen overlevede en median på 9 uger efter injektion (figur 6). Efterhånden som hjernemetastaserne skred frem, begyndte dyrene at tabe op til 20% kropsvægt, som derefter krævede eutanasi (mellem uge 6-9). I hjernemetastaser i sen fase omfatter de almindelige præsentationer flæset pels og svulmende og kuplede kranier. Dyrene var ofte inaktive, sammenkrøbne og viste funktionelle underskud i motorik og styrke.
Figur 6: Kaplan Meier-kurven for BT474 hjernemetastase musemodel. Medianoverlevelsen var 9 uger efter injektionen (n = 18). Klik her for at se en større version af denne figur.
Histologi
Efter eutanasi blev dyrene perfunderet med en 4% paraformaldehydopløsning for at bevare hjernens histologiarkitektur40. Derefter blev hjerner og andre organer behandlet, snittet og farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E). I denne hjernemetastasemodel var tumorerne placeret ensidigt og matchede siden af carotisinjektion (figur 7A). BT474-tumorerne optrådte for det meste som solide ensomme masser, i nogle tilfælde involverede næsten halvdelen af hjernehalvkuglen (figur 7B). Lommer af tomme rum blev ofte observeret og bestod af nekrotiske celler (figur 7C). Mindre udvækster var også til stede hos nogle dyr (figur 7E). Immunohistokemi farvning viser, at BT474 hjernemetastaser udtrykker stærke HER2 og HER3, hvilket tyder på, at denne model er egnet til HER2- og HER3-målrettede terapier (figur 7F).
Figur 7: Hjernehistologi af BT474 hjernemetastasemodel. (A) repræsentativ hjernesektion af en BT474 BM-mus; farvede kasser markeret forstørrede områder af interesse. Skalabar = 2 mm. (B) Fast tumor bestående af en masse epithelioidceller. (C) Nekrotiske celler i et rum. (D) Tumor-hjerne interface (E) Små udvækst kendt som mikrometastaser. (B-E skala bar = 200 μm). (F) Immunohistokemiske billeder, der viser HER2- og HER3-positivitet og matchede hæmatoxylin og eosin (H&E). Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Systemisk inddragelse
Der blev ikke observeret tumorer i vævsafsnit fra andre organer (figur 8). Dette fund stemmer overens med de bioluminescerende data, hvor bioluminescens kun blev påvist fra dyrenes hoveder. Sammen viste resultaterne, at denne model er forbundet med ingen påviselige systemiske tumorer.
Figur 8: Histologi af andre organer. Der var ingen åbenbar tumorinddragelse i de screenede organer: knogle, lever, nyre, bugspytkirtel, lunge, hjerte, milt, tarm og æggestok. Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Kanyle-sprøjte til injektion af indre halspulsårer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Snapshots af injektionsprocessen for den indre halspulsåre. Billedbeskrivelsen findes i supplerende tabel 1. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: T2-vægtet MR, der viser en stor intramuskulær tumor i højre ansigtsvæv (skitseret rødt). H&E-farvet vævssektion afslører tætpakkede tumorceller. Skalastang = 2 mm (midten) og 100 μm (højre). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Trin-for-trin beskrivelse af injektionen af den indre halspulsåre i supplerende figur 2. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjernemetastase er en kompleks proces af kræftceller, der spredes fra deres primære sted til hjernen. Der findes forskellige dyremodeller, der afspejler visse stadier af denne flertrinsproces, og der er fysiologiske og praktiske overvejelser ved at designe prækliniske metastasestudier41,42. De fleste offentliggjorte undersøgelser, der undersøger brugen af nanomedicin til hjernemetastasebehandling, har brugt intrakardiale43,44 og intrakranielle 45,46,47,48,49 modeller. Podning af kræftceller via halspulsåren kan bedre rekapitulere den metastatiske proces og hjernemetastase patobiologi.
Men erfaringsmæssigt resulterede den almindelige carotisinjektionsteknik i, at flere dyr præsenterede sig med betydelige ansigtstumorer på tidlige tidspunkter. Hos dyr med både aktive hjerne- og ansigtstumorer blev ansigtstumorer observeret at vokse hurtigere i størrelse end hjernetumorerne. Dette kan skyldes det mere vaskulariserede mikromiljø, der understøtter tumorvækst (supplerende figur 3).
Den fælles halspulsåre leverer blod til ansigtsregionen og hjernen via henholdsvis de ydre og carotisarterier. Derfor vil injektion af kræftceller via den fælles halspulsåre efter aftale med andre25 føre til såning i begge regioner. Det er muligt at forhindre ansigtstumorer ved først at ligere den ydre halspulsåre før almindelig carotisarterieinjektion.
Den interne halspulsåreinjektionsmetode, der er beskrevet her, simulerer hjernemetastase ved at indføre kræftcellerne i det primære blodkar, der forsyner hjernen. Denne model rekapitulerer indgivelsen af cirkulerende kræftceller i hjernens vaskulære seng, hvilket tillader deres transmigration og dannelse af metastatisk hjerneudvækst. Resultaterne viser, at injektion af halspulsåren begrænser såning af kræft til andre organer forbundet med metoder som intrakardial injektion.
Der er nogle kritiske overvejelser og fejlfindingsoplysninger til protokollen. For det første kan celleklumper okkludere intrakranielle blodkar og udløse et slagtilfælde. Dette kan afhjælpes ved at føre cellesuspensionen gennem en cellesi for at sikre en klumpfri cellesuspension. Derefter kan injektion af overskydende væske i hjernen resultere i inflammatorisk ødem og hindre vaskulær lateralisering. Dette kan undgås ved at bruge injektionsvolumen mindre end 100 μL. Brug af en sutur med flossede ender og tilstedeværelsen af fascia eller fibrofedtvæv kan hindre looping af sutur omkring den ydre halspulsåre. Det anbefales først at rydde fascia eller fibrofedtvæv ved at anvende en blid aftørringsbevægelse langs arterien med tangen og fjerne flossede ender ved at skære enden af suturen. Endelig har kræftcellelinjer unikke vækstrater, og det er derfor vigtigt at optimere cellekoncentrationen til injektion. Erfaringsmæssigt blev der i lunge- og melanomhjernemetastasemodeller, der involverede de aggressive humane kræftcellelinjer NCI-H1975 og A2058, injiceret færre celler (1 x 105 celler i 100 μL) for at forhindre hurtig sygdomsprogression.
Det mest udfordrende trin i denne protokol er indsættelse af nål i halspulsåren og injektion af celler. Det anbefales at bruge en ny nål pr. dyr til sterilitet, fordi brug af stumpe nåle øger risikoen for punktering eller rive blodkar. Det anbefales også at bruge en sprøjtedriver til proceduren for at reducere den første spurt af injicere og rystende nål under injektionen. Sprøjtedriveren har også den ekstra fordel at matche injektionshastigheden med fysiologisk blodgennemstrømningshastighed.
Denne protokol er ikke uden begrænsninger. Proceduren er teknisk krævende, og der er risiko for, at dyr bukker under for slagtilfælde fra lateraliseringsfejl på trods af at de gennemgår en vellykket procedure. Fra vores erfaring er slagtilfælde 11,4% (n = 21/168 dyr). Derfor bør startprøvestørrelsen tage højde for disse dyr, der vil dø af slagtilfælde. Da denne metode leverer kræftceller direkte mod hjernen, har den reduceret systemisk tumorbyrde og er derfor ikke ideel til at studere systemisk spredning.
Sammenfattende vil protokollen tillade generering af hjernemetastase musemodel, der er egnet til lægemiddelscreening og evaluering af lægemidlets terapeutiske profil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter. Finansieringskilderne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen; i indsamling, analyser eller fortolkning af data; i skrivningen af manuskriptet eller i beslutningen om at offentliggøre papiret.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af The Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC), tilskudsnummer APP1162560. ML blev finansieret af et UQ postgraduate forskningsstipendium. Vi vil gerne takke alle, der hjalp med dyrehold og in vivo-billeddannelse af dyrene. Vi takker Royal Brisbane and Women's Hospital for at donere aliquots af zirconium til denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance needle | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
| Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
| Animal heat mat | |||
| Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Autoclave bags | |||
| BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
| Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
| Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| Dissection microscope | |||
| Ear puncher | |||
| Electric clippers | |||
| Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
| Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| Isoflurane | |||
| Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| Mashed mouse chow | |||
| Meloxicam (METACAM) | |||
| Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
| PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
| PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
| Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
| Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| Sticky tape | |||
| Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
| Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
| Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
| Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
| Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Thread | |||
| Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
| Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y.
- Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
- Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
- Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
- Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
- Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
- Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
- Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
- Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
- Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
- Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
- Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
- Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
- Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
- Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
- Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
- Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
- Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
- Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
- Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
- Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
- Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
- Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
- Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
- Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
- Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
- Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
- Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
- Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
- Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
- Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
- Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
- He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
- Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
- Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).
