Quantificazione sperimentale delle interazioni tra sistemi di somministrazione di farmaci e cellule in vitro: una guida per la valutazione preclinica della nanomedicina

Summary

Viene dimostrato un flusso di lavoro per la quantificazione assoluta delle interazioni farmaco-cellula trasportatrice utilizzando la citometria a flusso per consentire una migliore valutazione razionale di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. Questo flusso di lavoro è applicabile ai vettori di droga di qualsiasi tipo.

Abstract

Una componente importante della progettazione di sistemi di somministrazione di farmaci riguarda come amplificare o attenuare le interazioni con specifici tipi di cellule. Ad esempio, un chemioterapico potrebbe essere funzionalizzato con un anticorpo per migliorare il legame alle cellule tumorali ("targeting") o funzionalizzato con glicole polietilenico per aiutare a eludere il riconoscimento delle cellule immunitarie ("stealth"). Anche a livello cellulare, ottimizzare il legame e l'assorbimento di un vettore di farmaci è un problema di progettazione biologica complesso. Pertanto, è importante separare la forza con cui un nuovo vettore interagisce con una cella dall'efficacia funzionale del carico di un vettore una volta consegnato a quella cella.

Per continuare l'esempio chemioterapico, "quanto bene si lega a una cellula tumorale" è un problema separato da "quanto bene uccide una cellula tumorale". I saggi quantitativi in vitro per questi ultimi sono ben consolidati e di solito si basano sulla misurazione della vitalità. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche pubblicate sulle interazioni cellula-vettore è qualitativa o semiquantitativa. Generalmente, queste misurazioni si basano sull'etichettatura fluorescente del vettore e, di conseguenza, riportano interazioni con le cellule in unità relative o arbitrarie. Tuttavia, questo lavoro può essere standardizzato ed essere reso assolutamente quantitativo con un piccolo numero di esperimenti di caratterizzazione. Tale quantificazione assoluta è preziosa, in quanto facilita confronti razionali, inter- e intra-classe di vari sistemi di somministrazione di farmaci: nanoparticelle, microparticelle, virus, coniugati anticorpo-farmaco, cellule terapeutiche ingegnerizzate o vescicole extracellulari.

Inoltre, la quantificazione è un prerequisito per successive meta-analisi o approcci di modellazione in silico . In questo articolo vengono presentate le guide video e un albero decisionale su come ottenere la quantificazione in vitro per i sistemi di somministrazione di farmaci carrier, che tengono conto delle differenze nelle dimensioni del vettore e nella modalità di etichettatura. Inoltre, vengono discusse ulteriori considerazioni per la valutazione quantitativa dei sistemi avanzati di somministrazione di farmaci. Questo è destinato a servire come una risorsa preziosa per migliorare la valutazione razionale e la progettazione per la prossima generazione di medicina.

Introduction

La progettazione di costrutti di somministrazione di farmaci che mostrano un comportamento specifico e progettato a seconda del tipo di cellula che incontrano ha attirato un notevole interesse di ricerca. I potenziali costrutti di somministrazione di farmaci o "vettori" includono formulazioni lipidiche, inorganici nano-coltivati, assemblaggi polimerici, vescicole extracellulari, cellule batteriche funzionalizzate o virus modificati. Tutti questi possono mostrare specificità di organi, tessuti o cellule a causa di proprietà fisiche, proprietà superficiali o funzionalizzazioni chimiche ingegnerizzate come l'attacco anticorpale ^1,2.

Un passo quasi onnipresente nella valutazione del vettore in vitro è quello di incubare le cellule con una sospensione contenente detto vettore caricato di farmaco. Dopo l'incubazione, le prestazioni del vettore vengono misurate tramite una lettura funzionale delle prestazioni del carico di droga, ad esempio l'efficienza di trasfezione o la tossicità. Le letture funzionali sono utili, in quanto sono una misura a valle dell'efficacia del vettore. Tuttavia, per costrutti di somministrazione di farmaci più complessi, è sempre più importante andare oltre le letture funzionali e quantificare separatamente il grado di interazione del vettore con la cellula di interesse. Ci sono alcune ragioni per questo.

In primo luogo, c'è un crescente interesse nella scoperta (e nel miglioramento iterativo) di tecnologie di trasporto "piattaforma", che possono trasportare una varietà di merci. Ad esempio, le nanoparticelle lipidiche (LNP) progettate per incapsulare l'RNA possono scambiare una sequenza di RNA con un'altra con pochi avvertimenti³. Pertanto, per migliorare iterativamente la tecnologia del vettore, è fondamentale quantificarne le prestazioni indipendentemente dalla funzionalità del carico. In secondo luogo, le letture funzionali potrebbero non essere semplici per il carico di interesse, compromettendo la capacità di iterare e valutare rapidamente le formulazioni del vettore. Mentre si potrebbe eseguire l'ottimizzazione in vitro utilizzando un modello di carico con una semplice lettura funzionale (ad esempio, fluorescenza), la modifica del carico può cambiare la risposta biologica a un vettore⁴ e può, quindi, non produrre risultati rappresentativi. In terzo luogo, molti portatori sono progettati per interagire ed essere assorbiti da un tipo di cellula specifico. Tale capacità di targeting di un vettore può e deve essere differenziata dalle prestazioni del suo targeting terapeutico del carico di carico. Per continuare l'esempio LNP, un carico di RNA potrebbe essere estremamente potente, ma se l'LNP non è in grado di legarsi alla cellula, essere internalizzato e rilasciare l'RNA, non si osserverà alcun effetto funzionale a valle. Questo può essere un problema in particolare per i portatori destinati a colpire tipi di cellule difficili da trasfettare, come le cellule T⁵. Al contrario, un LNP potrebbe colpire in modo estremamente efficace, ma il carico di RNA potrebbe non funzionare. Un test a valle che si limiti a misurare la funzionalità del carico non sarà in grado di distinguere tra queste due situazioni, complicando così lo sviluppo e l'ottimizzazione dei sistemi di somministrazione di farmaci carrier.

In questo lavoro, viene discusso come quantificare assolutamente l'associazione del vettore. Associazione è un termine che si riferisce al grado di interazione misurato sperimentalmente tra un vettore e una cellula. L'associazione non distingue tra legame di membrana e internalizzazione: un vettore può essere associato perché è legato alla superficie cellulare o perché la cellula l'ha interiorizzata. L'associazione è comunemente misurata come parte degli esperimenti di incubazione del vettore cellulare. Storicamente, l'associazione è stata riportata sia in unità fluorescenti arbitrarie (tipicamente "intensità di fluorescenza mediana" o MFI) o come "associazione percentuale", metriche le cui limitazioni sono state precedentemente discusse⁶. In breve, queste misurazioni non sono comparabili tra esperimenti, laboratori e vettori di farmaci a causa delle differenze nei protocolli sperimentali, nelle impostazioni del citometro a flusso e nelle intensità di etichettatura dei diversi vettori. Sono stati fatti sforzi per superare il primo calibrando il citometro, convertendo così la misura relativa delle IFM in una misura assolutamente quantitativa della fluorescenza⁷. Tuttavia, questo metodo non tiene conto della variabilità dell'intensità di etichettatura dei vari vettori e, quindi, non consente il confronto razionale delle varie prestazioni del vettore in una cella target di scelta⁸.

Qui, come convertire praticamente da unità fluorescenti relative e arbitrarie alla metrica quantitativa assoluta del "numero di portatori per cella" è dimostrato eseguendo un piccolo numero di ulteriori esperimenti di caratterizzazione. Se si desidera un'altra metrica di concentrazione del vettore (ad esempio, massa portante per cella o volume portante per cella), è semplice convertire da portatori per cella, a condizione che sia stata eseguita la caratterizzazione del vettore. Per brevità e per evitare il gergo, la parola "vettore" è usata all'interno di questo lavoro per riferirsi al vasto assortimento di costrutti di somministrazione di farmaci. Queste tecniche di quantificazione sono ugualmente applicabili, sia applicate a una particella d'oro nano-ingegnerizzata o a un batterio bio-ingegnerizzato.

Alcuni fatti consentono la conversione da unità fluorescenti arbitrarie a vettori per cella. In primo luogo, l'intensità di fluorescenza misurata è proporzionale alla concentrazione di un fluoroforo⁹ (o di un vettore marcato con fluorescenza), supponendo che la fluorescenza rientri nei limiti di rilevazione dello strumento e che le impostazioni della strumentazione siano le stesse. Pertanto, se la fluorescenza di un vettore e la fluorescenza di un campione sono note, si può determinare quanti portatori sono presenti in quel campione se tutte le misurazioni sono state eseguite nelle stesse impostazioni e condizioni. Tuttavia, soprattutto per i vettori più piccoli, potrebbe non essere possibile misurare la fluorescenza del vettore, l'autofluorescenza cellulare e la fluorescenza associata alle cellule sullo stesso strumento con le stesse impostazioni. In questo caso, esiste un secondo requisito per rendere possibile la conversione tra fluorescenza misurata su uno strumento e fluorescenza misurata su un altro. Per fare ciò, è possibile stabilire una curva standard della concentrazione di fluorofori per misurare l'intensità della fluorescenza su entrambi gli strumenti, sfruttando lo standard MESF (Molecules of Equivalent Solubili Fluorochrome)⁹. Ciò consente quindi la misurazione della fluorescenza del vettore in massa su un non citometro, una misurazione che può essere eseguita su portatori di qualsiasi dimensione o caratteristica. Quando tale quantificazione di massa viene effettuata su una sospensione portante di concentrazione nota, il numero di portatori per cellula di un campione può, ancora una volta, essere calcolato.

Mentre questo lavoro dimostra il processo per misurare l'associazione dei portatori (come determinato dall'intensità di fluorescenza misurata), un protocollo analogo potrebbe essere eseguito per altre misure di interazione cellula-vettore (ad esempio, un protocollo sperimentale che differenzia i portatori internalizzati e legati alla membrana). Inoltre, questo protocollo sarebbe in gran parte lo stesso se l'associazione fosse misurata attraverso un saggio non fluorescente (ad esempio, attraverso la citometria di massa).

Protocol

1. Scegliere il flusso appropriato

1. Seguire l'albero decisionale descritto nella Figura 1 per determinare il flusso di lavoro migliore (flusso) (Figura 2) per la configurazione sperimentale utilizzata. Fare riferimento alla discussione per ulteriori commenti su questa scelta di flusso.
2. Se si segue il flusso del citometro, continuare con i passaggi 2.1.1-2.2.7. Se si segue il flusso di massa, continuare con i passaggi 3.1.1.1-3.1.5.7.

Figura 1: albero decisionale del flusso di lavoro. La decisione su quale Stream utilizzare dipende principalmente dal tipo di operatore di interesse. I vettori più grandi e i vettori con elevate proprietà di diffusione possono essere rilevati più facilmente individualmente sui citometri, rendendoli così adatti per la quantificazione utilizzando il flusso citometrico. Il Bulk Stream è adatto a tutti gli altri tipi di corriere. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Panoramica dei flussi di lavoro. Questo protocollo è suddiviso in due diversi flussi. Il flusso del citometro utilizza un citometro sensibile per contare i portatori in sospensione, misurare la loro fluorescenza individuale e quindi determinare la fluorescenza delle cellule incubate con i vettori. Il Bulk Stream utilizza tecniche non basate sulla citometria, come la Nanoparticle Tracking Analysis, per contare i portatori in sospensione. La fluorescenza del singolo vettore viene quindi quantificata utilizzando un lettore di micropiastre o uno spettrofluorometro. L'uso del citometro a flusso è quindi limitato alla misurazione della fluorescenza finale delle cellule incubate con vettori, una misurazione che può essere effettuata su una gamma più ampia di citometri e che è indipendente dal tipo di vettore utilizzato. Abbreviazioni: MESF = molecole di fluorocromo solubile equivalente; MFI = intensità mediana della fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Il flusso del citometro

1. Conteggio dei vettori
   NOTA: Per questa misurazione può essere utilizzato qualsiasi citometro a flusso, a condizione che la portata (μL/s) sia nota. Se la portata è sconosciuta e non può essere determinata, non procedere con questo passaggio. Procedere invece con il passaggio 3.1. Il conteggio dei portatori in sospensione consente una determinazione accurata e riproducibile del numero di portatori incubati in ciascun esperimento cellulare.
   1. Impostare il citometro per rilevare i vettori, sia tramite un canale di diffusione ottica (tipicamente dispersione laterale [SSC]) che con fluorescenza. Assicurati di regolare la soglia per consentire il rilevamento dei vettori.
      NOTA: l'iterazione attraverso diversi canali di diffusione ottica può essere necessaria se SSC non fornisce un segnale chiaro (ad esempio, diffusione diretta [FSC]).
   2. Eseguire un campione di solo diluente per quantificare il conteggio degli eventi in background sia nei canali SSC che in quelli fluorescenti.
      NOTA: il conteggio ideale degli eventi in background è <100 eventi/s.
   3. Preparare i vettori per la citometria a flusso.
      1. Assicurarsi che i vettori siano ben sospesi dal vortice o dalla sonicazione, a seconda del sistema di supporto coinvolto.
      2. Se possibile, assicurarsi che la concentrazione del vettore sia compresa tra 1.000 vettori/μL e 10.000 vettori/μL. Un conteggio degli eventi da uno a due ordini di grandezza superiore allo sfondo è un buon inizio. Se l'ordine di grandezza della concentrazione del vettore è sconosciuto, un buon inizio è preparare una diluizione 1:1.000 dal magazzino. Utilizzare i risultati iniziali come feedback per informare le future diluizioni del campione.
         NOTA: Una sospensione nuvolosa è generalmente troppo concentrata.
   4. Caricare il primo campione portante sul citometro e iniziare a registrare.
   5. Confrontare i conteggi degli eventi risultanti sia dal SSC che dai canali di fluorescenza; Questi dovrebbero essere approssimativamente uguali (<10% di differenza). In caso contrario, controllare le impostazioni del citometro, ad esempio le impostazioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) e l'intensità del laser per il canale fluorescente. In alternativa, utilizzare altri metodi come la microscopia confocale per convalidare che l'etichettatura fluorescente dei vettori sia presente e uniforme.
   6. Ripetere i punti 2.1.3-2.1.5 altre due o più volte con diluizioni diverse dal materiale. Assicurarsi che il conteggio degli eventi in ogni campione sia superiore di almeno un ordine di grandezza rispetto al conteggio degli eventi in background.
   7. Verificare che tre o più campioni mostrino una tendenza lineare, vale a dire che una diluizione del campione doppia dovrebbe comportare una corrispondente riduzione di due volte della concentrazione del supporto misurato.
   8. Utilizzare i campioni all'interno dell'intervallo lineare, i fattori di diluizione corrispondenti e la portata del citometro nota per calcolare la concentrazione del supporto del materiale in base all'equazione (1):
      (1)
      dove C è la concentrazione del vettore in vettori/ml. Si consiglia di utilizzare il conteggio degli eventi derivato dal rilevamento della diffusione ottica piuttosto che dalla fluorescenza.
2. Lettura della citometria a flusso dell'esperimento della cellula carrier, compresa la determinazione dell'intensità di fluorescenza per vettore
   NOTA: Idealmente, l'intensità fluorescente per vettore sarà determinata il più vicino possibile all'esperimento della cellula portante. Questo per garantire che le IFM ottenute per i singoli portatori possano essere direttamente confrontate con le IFM delle celle associate ai vettori. In pratica, un citometro di solito genera risultati simili se utilizzato in giorni consecutivi utilizzando le stesse tensioni PMT, ma ciò non può essere garantito.
   1. Progettare l'esperimento carrier-cell. Utilizzare la concentrazione del vettore determinata al punto 2.1 per somministrare la dose desiderata di portatori.
   2. Impostare il citometro a flusso per l'esperimento finale della cella portante determinando le impostazioni ottimali della tensione PMT nei canali pertinenti. Imposta le soglie per consentire il rilevamento dell'operatore.
   3. Eseguire i vettori in sospensione per determinare l'intensità di fluorescenza per vettore nelle impostazioni PMT correnti.
   4. Se necessario, modificare le soglie del citometro per rilevare le cellule e non i portatori.
   5. Eseguire un campione di controllo negativo - celle non incubate con vettori - per determinare la fluorescenza di fondo (autofluorescenza) delle cellule.
   6. Eseguire i campioni di cellule carrier per determinare l'intensità di fluorescenza per cella. Questa fluorescenza è una combinazione lineare di autofluorescenza cellulare e presenza di vettori fluorescenti.
   7. Calcolare il numero di portatori per cella utilizzando la seguente equazione (2):
      (2)
      dove P_assoc è il numero di portatori associati per cellula, _{la cella} FI è l'IFM delle cellule incubate con portatori, il _background FI è l'IFM delle cellule non incubate con portatori e il_vettore FI è l'IFM dei portatori in sospensione.

3. Il flusso di massa

1. Conteggio dei vettori: analisi del tracciamento delle nanoparticelle
   NOTA: Nel flusso di massa, il conteggio dei vettori è un passaggio necessario per quantificare l'intensità assoluta della fluorescenza per vettore (vedere il passaggio 3.1.4). Inoltre, il conteggio dei portatori in sospensione consente la determinazione accurata e riproducibile del numero di portatori incubati in ciascun esperimento cellulare.
   1. Preparazione
      1. Montare la cella di flusso sul modulo laser e bloccare l'intero modulo laser in posizione all'interno dello strumento.
      2. Lentamente (non più velocemente di 0,1 mL/s) lavare la cella di flusso con ~1 mL di acqua distillata. Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere.
      3. Avviare la fotocamera all'incirca a metà del lavaggio; Assicurati di confermare che i detriti del vettore siano stati lavati via. Selezionare Cattura per aprire la scheda Impostazioni di acquisizione e fare clic su Avvia fotocamera.
      4. Asciugare il sistema con 1 mL di aria. Se sullo schermo sono visibili supporti statici, pulire la cella di flusso seguendo le istruzioni del produttore.
      5. Preparare i vettori per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle assicurandosi che i supporti siano ben sospesi tramite vortice o sonicazione, a seconda del sistema di trasporto coinvolto. Se l'ordine di grandezza della concentrazione dello stock non è noto, preparare una diluizione 1:100 dal materiale madre e utilizzare i risultati iniziali come feedback per informare le future diluizioni del campione. Diluire i vettori in acqua e non in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per preparare almeno ~0,6-1 mL di ciascun campione con una concentrazione del vettore compresa tra 1 × 10⁷ carrier/mL e 1 × 10⁹ carrier/mL.
         NOTA: Una sospensione nuvolosa è generalmente troppo concentrata. Tamponi e sali possono generare un elevato rumore di fondo.
   2. Misurazione
      1. Estrarre il modulo laser e posizionarlo in posizione verticale.
      2. Aspirare il primo campione di supporto in una siringa da 1 ml. Collegare la siringa all'ingresso del tubo e caricare con attenzione il campione nella cella di flusso. Se si formano bolle all'interno della cella di flusso, ritrarre parzialmente la sospensione per unire la bolla con l'interfaccia aria-liquido prima di procedere. Assicurarsi che l'intera cella di flusso sia piena di liquido, quindi mettere in pausa.
      3. Regolare la messa a fuoco della fotocamera, se necessario, per visualizzare i singoli operatori. Effettua regolazioni grossolane della messa a fuoco con la manopola rotante sul lato destro dello strumento. Effettua regolazioni più precise selezionando la scheda Hardware | Pompe/Stadio. Modificare lo stato attivo regolando il dispositivo di scorrimento Focus .
      4. Regolare il livello della telecamera per assicurarsi che non vi sia sovrasaturazione. Nella scheda Acquisizione , selezionare il livello ottimale della fotocamera regolando il dispositivo di scorrimento.
      5. Se lo strumento è dotato di questo accessorio, caricare la siringa contenente il campione di supporto nella pompa della siringa per garantire un flusso continuo del campione durante le misurazioni.
      6. Nella scheda SOP , selezionare Misurazione standard per acquisire cinque acquisizioni da 30 s ciascuna. Immettere il nome file di base e, se lo si desidera, aggiungere ulteriori informazioni di esempio facendo clic sul pulsante Avanzate (che apre una finestra di dialogo modale con una varietà di scelte).
         NOTA: se viene inserito un fattore di diluizione, la misurazione finale della concentrazione del supporto verrà regolata automaticamente dal software. L'inserimento di questo fattore è sconsigliato. Eseguire invece la regolazione manualmente, il che facilita l'analisi e consente di valutare se ogni diluizione rientra nel campo dinamico dello strumento (passo 3.1.3.4).
      7. Premere Crea ed esegui script e attendere che venga visualizzato un popup che chiede di Esempio avanzato.
      8. Se si utilizza la pompa a siringa, selezionare la scheda Hardware | Syringe Pump tab impostare la velocità di infusione su 30-80 e premere Infondere. Se non si utilizza la pompa a siringa, far avanzare manualmente il campione.
      9. Nella finestra popup, selezionare OK per avviare l'acquisizione. Dopo ciascuna delle cinque acquisizioni, quando viene visualizzato nuovamente il pop-up Esempio avanza , verificare che il campione sia ancora in movimento attraverso la cella di flusso, manualmente o tramite la pompa a siringa. Quindi, selezionare OK per procedere con l'acquisizione successiva.
         NOTA: dopo cinque acquisizioni, il software apre automaticamente la scheda Processo e apre un pop-up che chiede di regolare le impostazioni del processo.
   3. Analisi
      1. Nella scheda Processo , regolare il dispositivo di scorrimento Soglia di rilevamento (tra 4 e 8) per identificare correttamente i vettori distinti visibili sullo schermo. Regola anche il guadagno dello schermo per facilitare la visualizzazione; Non influirà sull'analisi a valle. Utilizzare il dispositivo di scorrimento sotto la schermata di acquisizione per scorrere più fotogrammi del video per facilitare l'impostazione della soglia di rilevamento.
         NOTA: la soglia di rilevazione deve essere impostata una sola volta e, successivamente, non deve essere modificata tra misurazioni o campioni.
      2. Nel popup (nota dopo il passaggio 3.1.2.9), premere OK per avviare l'analisi di tracciamento. Monitorare l'avanzamento dell'analisi facendo clic sulla scheda Analisi | Scheda Analisi singola .
      3. Al termine dell'analisi, cerca che venga visualizzato un prompt Impostazioni di esportazione , in cui Includi PDF e Includi riepilogo esperimento dovrebbero essere selezionati per impostazione predefinita. Selezionare qualsiasi altro formato di esportazione desiderato.
      4. Nella sezione Risultati dell'esportazione dei dati PDF, per garantire che la concentrazione misurata sia affidabile, verificare che la concentrazione del supporto misurata sia compresa tra 1 × 10⁷ portatori/ml e 1 × 10⁹ portatori/mL - la gamma dinamica dello strumento - e verificare la presenza di eventuali messaggi di errore o messaggi di cautela sotto il risultato della misurazione della concentrazione.
      5. Ripetere i punti 3.1.2.1-3.1.3.4 due o più volte con diluizioni diverse dal materiale. Assicurarsi che la concentrazione di ciascun campione rientri nell'intervallo lineare dello strumento.
      6. Selezionare tre o più campioni che mostrano una tendenza lineare, ovvero una diluizione del campione doppia dovrebbe comportare una corrispondente riduzione di due volte della concentrazione del supporto misurato. Utilizzare i campioni selezionati e i fattori di diluizione corrispondenti per calcolare la concentrazione del portafoglio.
   4. Determinazione dell'intensità assoluta di fluorescenza per vettore
      NOTA: Poiché la fluorescenza dei singoli vettori in questo flusso non può essere caratterizzata direttamente, l'intensità della fluorescenza è quantificata in massa. Questo metodo si basa sul fatto che l'intensità della fluorescenza è linearmente correlata alla concentrazione di fluorocromo secondo la legge di Lambert-Beer. Quando tale quantificazione di massa dei vettori in sospensione viene effettuata su una sospensione di concentrazione nota del vettore (vedere punto 3.1), la fluorescenza per vettore può essere derivata. Questo passaggio può essere eseguito su un lettore di piastre a fluorescenza o su uno spettrofluorometro. L'intensità di fluorescenza viene confrontata con una curva standard di campioni con fluorescenza assoluta nota, espressa in numero di MESF.
      1. Utilizzare una soluzione di fluorocromo libero per etichettare il supporto: risospendere il colorante nel tampone appropriato (ad esempio, DMSO) ed eseguire ulteriori diluizioni nello stesso tampone del diluente vettore. In alternativa, utilizzare una soluzione di un anticorpo coniugato al fluorocromo. Calcolare la concentrazione della soluzione madre (MESF/mL) dalla concentrazione in mg/ml, il peso molecolare in mg/mole e il numero di Avogadro usando l'equazione (3). Eseguire una diluizione seriale nel diluente portante per generare campioni di curva standard.
         (3)
         NOTA: Utilizzare un anticorpo coniugato con fluorocromo solo se è noto il grado di marcatura, cioè il rapporto molare tra il fluorocromo e l'anticorpo nella soluzione. Inizialmente, generare una curva standard con un ampio intervallo, poiché l'intensità di fluorescenza del campione portante è ancora sconosciuta. Da qui, restringilo per includere l'intervallo richiesto.
      2. Preparare i campioni del supporto.
         NOTA: la procedura consigliata consiste nel testare due o più diluizioni del supporto per verificare che le misurazioni siano lineari e rientrino nell'intervallo della curva standard.
      3. Misurare la fluorescenza di volumi uguali di ciascun campione, cioè sia la curva portante che quella standard.
      4. Generare una curva standard e dedurre l'intensità assoluta di fluorescenza in MESF/mL per i campioni di supporto misurati.
      5. Calcolare l'intensità assoluta di fluorescenza per vettore (MESF/vettore) dividendo la fluorescenza di massa (MESF/mL) per la concentrazione del vettore (carriere/mL) come nell'equazione (4):
         (4)
   5. Esperimento cellulare (compresa la determinazione dell'intensità di fluorescenza equivalente per vettore)
      NOTA: In questa fase, le sfere di quantificazione della citometria a flusso vengono utilizzate per generare una curva standard della relazione tra MESF e MFI. Queste perle di quantificazione sono costituite da più popolazioni di perline con un numero noto di MESF per perla e queste singole perle possono essere rilevate da qualsiasi citometro. Idealmente, la curva standard MESF viene determinata contemporaneamente alla lettura degli esperimenti carrier-cell. Questo per garantire che i valori delle IFM calcolati per i singoli vettori possano essere confrontati direttamente con l'IFM delle celle associate ai vettori. In pratica, un citometro di solito genera risultati simili se utilizzato in giorni consecutivi utilizzando le stesse tensioni PMT, ma ciò non può essere garantito.
      1. Progettare l'esperimento carrier-cell. Utilizzare la concentrazione del vettore determinata al paragrafo 3.1.3 per somministrare la dose desiderata di portatori.
      2. Impostare il citometro a flusso per l'esperimento finale della cella portante determinando le impostazioni ottimali della tensione PMT nei canali pertinenti.
      3. Eseguire un campione di controllo negativo, cioè cellule non incubate con vettori, per determinare la fluorescenza di fondo.
      4. Preparare e risospendere le sfere di quantificazione della citometria a flusso. Utilizzare lo stesso buffer utilizzato per i campioni di cella (ad esempio, PBS). Se le popolazioni di perline sono fornite separatamente, raggrupparle insieme.
      5. Eseguire il campione di perline di quantificazione della citometria a flusso.
      6. Eseguire i campioni di cellule carrier per determinare l'intensità di fluorescenza per cella.
      7. Utilizzare il campione di sfere di quantificazione per generare una curva standard che converte l'intensità assoluta di fluorescenza (MESF) in MFI. Utilizzare questa curva standard e i risultati del punto 3.1.4 per calcolare l'IFM teorico dei vettori. Calcola il numero di portatori per cella usando l'equazione (5):
         (5)
         Dove P_assoc è il numero di portatori associati per cellula, _{la cella} FI è l'IFM delle cellule incubate con vettori, lo_sfondo FI è l'IFM delle cellule non incubate con portatori e il vettore FI è l'IFM calcolato dei portatori in sospensione (fase 3.1.4).

Representative Results

Come discusso in precedenza, diversi tipi di vettori di farmaci richiedono l'uso di tecniche diverse per la quantificazione assoluta dell'associazione cellula-vettore. Ad esempio, le particelle del guscio centrale di poli(acido metacrilico) (PMA_SH) stabilizzate con disolfuro a 633 nm sono abbastanza grandi e dense per il rilevamento utilizzando un citometro a flusso sensibile. Come tali, queste particelle sono state etichettate in modo fluorescente, quindi controllate e contate utilizzando la diffusione della luce ad angolo laterale (SALS, analogo a SSC), nonché il canale fluorescente appropriato (Figura 3). La differenza nel conteggio degli eventi in entrambi i canali è stata dell'1,98%, ben all'interno dell'intervallo accettabile.

Al contrario, le nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro da 100 nm sono troppo piccole per essere rilevate singolarmente e sono state, quindi, analizzate utilizzando il flusso di massa. Queste nanoparticelle sono state contate e caratterizzate utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (Figura 4). La dimensione media delle nanoparticelle di 136 nm riflette il diametro idrodinamico della nanoparticella in acqua. La concentrazione di nanoparticelle misurata, non ancora corretta per la diluizione eseguita, rientra nell'intervallo dinamico dello strumento, suggerendo una determinazione efficace e accurata della concentrazione di nanoparticelle.

Continuando nel Bulk Stream, l'intensità assoluta di fluorescenza di una sospensione portante deve essere convertita in un valore MFI sul citometro a flusso utilizzato per l'incubazione finale del vettore cellulare. In questo esperimento, le perle di quantificazione etichettate con lo stesso colorante fluorescente del vettore sono state utilizzate per più giorni per generare curve standard su un citometro a flusso (Figura 5). La correlazione tra l'IFM misurata e il valore MESF delle sfere di quantificazione è lineare e ampiamente simile tra le date misurate. Tuttavia, si possono osservare lievi differenze tra le date e, come tale, si raccomanda di rigenerare una curva standard come parte della lettura degli esperimenti di cellula portante.

Una volta determinata la MFI dei singoli portatori, i dati di associazione cellula-carrier possono essere assolutamente quantificati e interpretati in modo più accurato. Si raccomanda di eseguire esperimenti nel corso del tempo, ad esempio l'incubazione di cellule HeLa marcate con fluorescenza con capsule PMA_SH a 235 nm, per vari punti temporali compresi tra 0 h e 24 h (Figura 6). Come previsto, la fluorescenza cellulare mediana aumenta nel tempo, indicando che le capsule si stanno associando con le cellule HeLa. Mentre tali esperimenti possono essere utilizzati per confrontare le prestazioni relative del vettore in vari punti temporali, questi risultati non sono assolutamente quantitativi.

L'importanza della quantificazione assoluta, sia essa effettuata tramite il flusso citometrico o il flusso di massa, diventa chiara quando si confronta l'associazione di due tipi di vettori. La Figura 7 mostra gli stessi due esperimenti, analizzati mediante quantificazione relativa (Figura 7A) o quantificazione assoluta. La differenza nella risposta cellulare apparente ai portatori è netta, a seconda dell'analisi eseguita; i vettori non dovrebbero essere confrontati direttamente quando si utilizza la quantificazione relativa (Figura 7A), mentre la quantificazione assoluta è indipendente dall'intensità dell'etichettatura e, quindi, più comparabile (Figura 7B).

Figura 3: Conteggio delle particelle mediante un citometro a flusso (flusso citometrico). È stato utilizzato un citometro a flusso Apogee. (A) Conteggio delle particelle utilizzando un canale ottico (SALS), con un conteggio degli eventi di 200.659. (B) Conteggio della portante utilizzando il canale fluorescente del vettore, con un conteggio degli eventi di 204.636. In entrambi i casi, è stata applicata una trasformata arcsinh seguita da gating (rispettivamente a 6 e 4). Dati creati da dati grezzi di particelle core-shell a 633 nm pubblicati per la prima volta in Faria et ^al.10. Abbreviazione: SALS = dispersione luminosa ad angolo ridotto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Conteggio dei vettori mediante Nanoparticle Tracking Analysis (Bulk Stream). Le nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro di 100 nm di dimensioni sono state caratterizzate e contate utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle. A sinistra, istogramma concentrazione/dimensione dei singoli risultati di cinque misurazioni replicate. Destra, la distribuzione media concentrazione/dimensione ± SEM di cinque repliche. In questo particolare campione, è stata eseguita una diluizione 1:2.000 dal magazzino per ottenere una concentrazione all'interno della gamma dinamica dello strumento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Conversione di MESF in MFI utilizzando sfere di quantificazione su un citometro a flusso (Bulk Stream). Le sfere fluorescenti con quattro diversi valori MESF sono state analizzate su un citometro a flusso in vari giorni e sono state disegnate curve standard. Abbreviazioni: MESF = molecole di fluorocromo solubile equivalente; MFI = intensità mediana della fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Esperimento finale su cellule su serie di corsi citometrici a flusso (Cytometer Stream e Bulk Stream). Immagini rappresentative dei dati di citometria a flusso da un esperimento del corso del tempo. Le cellule THP-1 sono state incubate con una capsula polimerica da 235 nm per 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h e 24 h (da sinistra a destra). La fluorescenza del vettore è mostrata sull'asse x, mentre un canale ottico è mostrato sull'asse y. In tutti i casi, è stata eseguita una trasformata arcsin. Non è stato eseguito alcun gating (a parte la scelta dei limiti del grafico). Creato da dati grezzi in Faria et ^al.10. Abbreviazione: SALS = dispersione luminosa ad angolo ridotto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Quantificazione relativa e assoluta dell'associazione carrier-cell (Cytometer Stream e Bulk Stream). Entrambe le figure visualizzano i dati degli stessi due esperimenti, un'incubazione di 24 ore tra macrofagi RAW264.7 e vettori core-shell a 150 nm (blu) o 633 nm (arancione), creati da dati grezzi in Faria et ^al.10. Vengono tracciate le mediane di entrambe le repliche tecniche. (A) Quantificazione relativa, riportata come IFM nell'u.a. (B) Quantificazione assoluta, riportata come numero di portatori per cella. Abbreviazioni: MFI = intensità mediana di fluorescenza; U.A. = unità arbitrarie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

La caratterizzazione delle interazioni tra vettori di farmaci e cellule sta diventando sempre più importante nello sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione di farmaci. In particolare, per consentire la valutazione razionale e il confronto di vari costrutti di portatori, è fondamentale quantificare in modo assoluto le prestazioni di detto vettore per interagire con cellule target e off-target. Questo protocollo descrive una metodologia a due flussi che consente a qualsiasi ricercatore che lavora con un vettore di farmaci di convertire i dati relativi di citometria a flusso semiquantitativo sull'associazione cellula-vettore in risultati quantitativi assoluti. Il processo delineato è applicabile a qualsiasi tipo di vettore - piccolo, grande, organico, inorganico - a condizione che siano etichettati in modo fluorescente. Tuttavia, vettori diversi richiedono approcci diversi per calcolare i vettori per cella. Ciò è dovuto ai limiti delle varie strumentazioni utilizzate per le misure di caratterizzazione richieste.

Come tale, questo protocollo è diviso in due flussi: il flusso citometrico e il flusso di massa. Il primo, il flusso citometrico, è l'approccio più diretto e richiede solo un citometro a flusso, ma questo citometro deve essere abbastanza sensibile da rilevare i singoli vettori utilizzati, o, in altre parole, il vettore di droga di interesse deve essere abbastanza grande e denso da essere rilevato. Il Bulk Stream è compatibile con qualsiasi tipo di vettore, in quanto la necessità di rilevare singoli vettori viene aggirata attraverso l'uso di strumentazione alternativa. Tuttavia, il Bulk Stream richiede ulteriori esperimenti di caratterizzazione da eseguire.

Per facilitare la scelta del flusso appropriato (e come tale, delle tecnologie appropriate), le considerazioni di cui sopra sono state riassunte in un albero decisionale (Figura 1). Per ribadire, il Bulk Stream è adatto a tutti i ricercatori indipendentemente dal tipo di vettore utilizzato e può, quindi, essere sempre ripristinato come backup. I flussi di lavoro dei due flussi sono descritti nella Figura 2. In particolare, con i continui progressi nella sensibilità dei citometri a flusso, è possibile che il flusso di citometri possa essere utilizzato per più portatori di <300 nm.

Su questa procedura è opportuno fare alcune osservazioni. In primo luogo, la strategia descritta per convertire la fluorescenza cellulare in un numero assoluto di vettori per cellula si basa sulla misurazione della fluorescenza del singolo vettore in sospensione. Tuttavia, la fluorescenza è influenzata dall'ambiente chimico immediato del fluorocromo (ad esempio, il diluente del vettore, la superficie cellulare o vari compartimenti intracellulari). In particolare, è noto che l'ambiente acido del compartimento endosomico influenza l'intensità della fluorescenza di alcuni coloranti principalmente a base proteica¹¹. Pertanto, indipendentemente dal tipo di vettore studiato, si raccomanda di utilizzare intervalli di coloranti insensibili al pH e altamente fotostabili per l'etichettatura dei vettori di farmaci (vedere la Tabella dei materiali per una raccomandazione). L'ulteriore vantaggio di questa gamma di coloranti è la sua luminosità generale, che migliora la sensibilità del rilevamento del vettore di farmaci.

In secondo luogo, i metodi discussi sopra hanno lo scopo di fornire una guida, ma non formano in alcun modo un elenco esclusivo di tecniche che possono essere utilizzate per eseguire le varie fasi del flusso di lavoro di quantificazione. In particolare, esiste una varietà di tecniche per contare i vettori più piccoli o a bassa dispersione (come quelli nel Bulk Stream). Questi includono altri strumenti in grado di eseguire la stessa analisi di tracciamento delle nanoparticelle 12, così come altri metodi del tutto, come la diffusione dinamica della luce multi-angolo, la spettroscopia di massa, la microscopia elettronica¹³, la gravimetria o le misure di densità ottica (ulteriormente riviste da Shang e Gao¹⁴). Inoltre, questa quantificazione sperimentale - che passa da unità di fluorescenza arbitrarie a un numero assoluto di vettori per cellula - è solo una parte di quello che potrebbe essere definito un "flusso di lavoro di biologia quantitativa". La quantificazione sperimentale assoluta è necessaria ma non sufficiente. La semplice quantificazione e segnalazione dell'associazione dei vettori non tiene conto delle differenze nell'associazione delle particelle dovute alla configurazione sperimentale, come il tempo di incubazione, la dose e la concentrazione del vettore di farmaco aggiunto o il numero di cellule utilizzate per contenitore sperimentale.

Inoltre, i vettori con diverse proprietà fisico-chimiche possono avere dosaggi molto diversi consegnati alle cellule, anche quando la configurazione sperimentale è identica¹⁵. Le prestazioni del vettore, anche in vitro, non possono essere determinate senza tenere conto di tutti questi fattori. In altre parole, la semplice quantificazione dell'associazione carrier-cell non consente, in generale, un confronto imparziale dei vettori tra ricercatori e laboratori. In questa luce, c'è stata una discussione preliminare sull'importanza di eseguire esperimenti di associazione carrier-cell e successivi modelli matematici in silico per derivare parametri cinetici (cioè costanti di velocità) come misura imparziale e quantitativa dell'affinità tra una particolare coppia carrier-cell¹⁰. La quantificazione sperimentale è anche un prerequisito per l'applicazione di altre tecniche in silico , come l'identificazione di potenziali fonti di eterogeneità biologica¹⁶ o la determinazione della cinetica di penetrazione in un modello biologico complesso¹⁷. In combinazione con le linee guida Minimum Information Reporting in Bio-Nano Experimental Literature per la segnalazione standardizzata¹⁸, la valutazione quantitativa delle prestazioni del vettore può accelerare lo sviluppo di nuove nanomedicine.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard