Summary
フローサイトメトリーを使用して薬物キャリアと細胞間相互作用の絶対定量を行うためのワークフローが実証され、新しい薬物送達システムのより合理的な評価が可能になります。このワークフローは、あらゆるタイプの薬物キャリアに適用できます。
Abstract
ドラッグデリバリーシステムの設計の主要なコンポーネントは、特定の細胞タイプとの相互作用を増幅または減衰させる方法に関係しています。例えば、化学療法は、癌細胞への結合を増強するために抗体で機能化され(「ターゲティング」)、または免疫細胞の認識を回避するのを助けるためにポリエチレングリコールで機能化され得る(「ステルス」)。細胞レベルであっても、薬物キャリアの結合と取り込みを最適化することは、複雑な生物学的設計上の問題です。したがって、新しい運送業者がセルとどの程度強く相互作用するかを、そのセルに配送された運送業者の貨物の機能的有効性から分離することは価値があります。
化学療法の例を続けると、「がん細胞にどれだけうまく結合するか」は、「がん細胞をどれだけうまく殺すか」とは別の問題です。後者の定量的 in vitro アッセイは十分に確立されており、通常は生存率の測定に依存しています。ただし、細胞キャリア相互作用に関するほとんどの公開された研究は、定性的または半定量的です。一般に、これらの測定は担体の蛍光標識に依存しており、その結果、細胞との相互作用を相対的または任意の単位で報告します。ただし、この作業は標準化され、少数の特性評価実験で絶対的に定量化できます。このような絶対定量は、ナノ粒子、微粒子、ウイルス、抗体薬物複合体、操作された治療細胞、または細胞外小胞など、さまざまな薬物送達システムの合理的なクラス間およびクラス内の比較を容易にするため、価値があります。
さらに、定量化は、その後のメタアナリ シスまたはインシリコ モデリングアプローチの前提条件です。この記事では、キャリアサイズと標識モダリティの違いを考慮したビデオガイドと、キャリアドラッグデリバリーシステムの in vitro 定量を実現する方法の決定木を紹介します。さらに、高度なドラッグデリバリーシステムの定量的評価に関するさらなる考慮事項について説明します。これは、次世代の医療の合理的な評価と設計を改善するための貴重なリソースとして機能することを目的としています。
Introduction
遭遇する細胞タイプに応じて特異的に設計された挙動を示すドラッグデリバリーコンストラクトの設計は、大きな研究関心を集めています。潜在的な薬物送達構築物または「担体」には、脂質製剤、ナノ成長無機物、ポリマー集合体、細胞外小胞、機能化された細菌細胞、または修飾ウイルスが含まれる。これらはすべて、物理的特性、表面特性、または抗体付着などの操作された化学的機能化により、臓器、組織、または細胞の特異性を示す可能性があります1,2。
in vitro担体評価におけるほぼユビキタスなステップは、前記薬物担持担体を含む懸濁液と共に細胞をインキュベートすることである。インキュベーション後、キャリア性能は、トランスフェクション効率や毒性などの薬剤貨物の性能の機能的読み出しによって測定されます。機能読み出しは、キャリアの有効性の下流の尺度であるため、有用です。しかし、より複雑な薬物送達構築物の場合、機能的な読み出しを超えて、目的の細胞とのキャリア相互作用の程度を個別に定量することがますます重要になっています。これにはいくつかの理由があります。
第一に、さまざまな貨物を運ぶことができる「プラットフォーム」キャリア技術の発見(および反復的な改善)への関心が高まっています。例えば、RNAをカプセル化するように設計された脂質ナノ粒子(LNP)は、あるRNA配列を別のRNA配列と交換することができますが、いくつかの注意点があります3。したがって、運送業者の技術を反復的に改善するには、貨物の機能に関係なくその性能を定量化することが重要です。第二に、関心のある貨物にとって機能的な読み出しは単純ではない可能性があり、キャリアの処方を迅速に反復して評価する能力を損なう可能性があります。単純な機能読み出し(例えば、蛍光)を有するモデル貨物を用いてin vitro最適化を行うことができるが、貨物を変更すると、担体4に対する生物学的応答が変化する可能性があり、したがって、代表的な結果をもたらさない可能性がある。第三に、多くのキャリアは、特定の細胞型と相互作用し、取り込まれるように設計されています。運送業者のこのようなターゲティング能力は、その治療用貨物ポストターゲティングの性能と区別することができ、また区別されるべきである。LNPの例を続けると、RNAカーゴは非常に強力かもしれませんが、LNPが細胞に結合し、内在化され、RNAを放出できない場合、下流の機能的影響は観察されません。これは、T細胞5などのトランスフェクションが困難な細胞型を標的とすることを目的としたキャリアにとって特に問題になる可能性があります。逆に、LNPは非常に効果的に標的化することができますが、RNA貨物は機能しない可能性があります。貨物の機能を測定するだけのダウンストリームアッセイでは、これら2つの状況を区別できないため、キャリアドラッグデリバリーシステムの開発と最適化が複雑になります。
この作業では、キャリア の関連付け を絶対的に定量化する方法について説明します。会合は、担体と細胞との間の相互作用の実験的に測定された程度を指す用語である。会合は膜結合とインターナリゼーションを区別しない−担体は、それが細胞表面に結合しているため、または細胞がそれをインターナリゼーションしたために会合し得る。会合は、通常、細胞キャリアインキュベーション実験の一部として測定されます。歴史的に、関連性は任意の蛍光単位(典型的には「蛍光強度の中央値」またはMFI)または「パーセントアソシエーション」のいずれかで報告されており、その限界は以前に議論されている指標です6。要するに、これらの測定値は、実験プロトコル、フローサイトメーターの設定、および異なるキャリアの標識強度の違いにより、実験、実験室、および薬物キャリア間で比較できません。サイトメーターを較正し、それによってMFIの相対測定値を蛍光の絶対定量的測定値に変換することにより、前者を克服するための努力がなされてきました7。しかしながら、この方法は、様々なキャリアの標識強度の変動を考慮していないため、選択した標的細胞における様々なキャリア性能の合理的な比較はできない8。
ここで、相対的な任意の蛍光単位から「細胞当たりのキャリア数」の絶対定量的測定基準に実際的に変換する方法は、少数の追加の特性評価実験を行うことによって実証される。キャリア濃度の別のメトリック(例えば、細胞当たりのキャリア質量または細胞当たりのキャリア体積)が望まれる場合、キャリア特性評価が行われていれば、細胞当たりのキャリアから変換することは容易である。簡潔にするために、専門用語を避けるために、この作品では「キャリア」という言葉を使用して、膨大な品揃えのドラッグデリバリー構造を指します。これらの定量技術は、ナノエンジニアリングされた金粒子またはバイオエンジニアリングされた細菌に適用されるかどうかにかかわらず、等しく適用できます。
いくつかの事実により、任意の蛍光単位から細胞当たりの担体への変換が可能になります。まず、測定された蛍光強度は、蛍光が装置の検出限界内にあり、機器設定が同じであると仮定して、蛍光色素9 (または蛍光標識された担体)の濃度に比例します。したがって、担体の蛍光とサンプルの蛍光がわかっている場合、すべての測定が同じ設定および条件下で行われた場合、そのサンプルに存在するキャリアの数を決定できます。ただし、特に小型のキャリアの場合、キャリア蛍光、細胞自家蛍光、および細胞会合蛍光を同じ装置で同じ設定で測定できない場合があります。この場合、ある装置で測定された蛍光と別の装置で測定された蛍光の間で変換できるようにするという2番目の要件があります。そのために、蛍光色素濃度の標準曲線を確立して、当量可溶性蛍光色素分子(MESF)標準9を利用して、両方の機器の蛍光強度を測定することができます。これにより、次いで、非サイトメーター上でのキャリア蛍光のバルクの測定が可能になり、任意のサイズまたは特性のキャリア上で行うことができる測定が可能になります。このようなバルク定量が既知の濃度の担体懸濁液に対して行われる場合、サンプルの細胞当たりの担体の数を、もう一度計算することができる。
この研究は、キャリア会合(測定された蛍光強度によって決定される)を測定するプロセスを実証しているが、細胞-キャリア相互作用の他の測定(例えば、インターナライズドキャリアと膜結合キャリアを区別する実験プロトコル)についても同様のプロトコルを実行することができる。さらに、このプロトコルは、非蛍光アッセイ(例えば、マスサイトメトリー)によって関連が測定された場合、ほぼ同じであろう。
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Protocol
1.適切なストリームの選択
- 図 1 で概説されている決定木に従って、使用する実験セットアップに最適なワークフロー (ストリーム) (図 2) を決定します。このストリームの選択に関するさらなるコメントについては、ディスカッションを参照してください。
- サイトメーターストリームに従う場合は、手順2.1.1〜2.2.7に進みます。バルクストリームに従う場合は、手順 3.1.1.1-3.1.5.7 に進みます。
図 1: ワークストリームのデシジョン ツリー。 使用する Stream の決定は、主に対象のキャリアの種類によって異なります。より大きなキャリアや散乱特性の高いキャリアは、サイトメーターで個別に検出できるため、サイトメーターストリームを使用した定量に適しています。バルクストリームは、他のすべてのキャリアタイプに適しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 作業ストリームの概要。 このプロトコルは、2つの異なるストリームに分割されます。サイトメーターストリームは、高感度サイトメーターを使用して、懸濁液中のキャリアをカウントし、個々の蛍光を測定してから、キャリアと一緒にインキュベートした細胞の蛍光を決定します。バルクストリームは、ナノ粒子追跡分析などの非サイトメトリーベースの技術を使用して、懸濁液中のキャリアをカウントします。次に、個々のキャリア蛍光をマイクロプレートリーダーまたは分光蛍光光度計を使用して定量します。したがって、フローサイトメーターの使用は、キャリアとともにインキュベートされた細胞の最終蛍光の測定に限定され、より広い範囲のサイトメーターで測定でき、使用するキャリアの種類に依存しません。略語:MESF =等価可溶性蛍光色素の分子。MFI = 蛍光強度の中央値。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. サイトメーターストリーム
- キャリアカウント
注:流量(μL/s)がわかっている場合は、任意のフローサイトメーターをこの測定に使用できます。流量が不明で決定できない場合は、この手順に進まないでください。代わりに、手順 3.1 に進みます。懸濁液中の担体をカウントすることで、各細胞実験でインキュベートされた担体の数を正確かつ再現性よく決定することができます。- 光散乱チャネル(通常は側方散乱[SSC])と蛍光の両方でキャリアを検出するようにサイトメーターを設定します。キャリアを検出できるようにしきい値を調整してください。
注意: SSCが明確な信号を提供しない場合(前方散乱[FSC]など)、異なる光散乱チャネルを介した反復が必要になる場合があります。 - 希釈液のみのサンプルを実行して、SSCチャンネルと蛍光チャンネルの両方のバックグラウンドイベント数を定量します。
注: 理想的なバックグラウンド イベント数は <100 イベント/秒です。 - フローサイトメトリー用の担体を準備します。
- 関係するキャリアシステムに応じて、キャリアがボルテックスまたは超音波処理によって十分に吊り下げられていることを確認してください。
- 可能であれば、キャリア濃度が1,000キャリア/μLから10,000キャリア/μLの間であることを確認してください。バックグラウンドよりも1〜2桁大きいイベントカウントは、良いスタートです。キャリア濃度の大きさが不明な場合は、ストックから1:1,000希釈液を調製することをお勧めします。最初の結果をフィードバックとして使用して、将来のサンプル希釈を通知します。
注:濁った懸濁液は一般的に濃度が高すぎます。
- 最初のキャリアサンプルをサイトメーターにロードし、記録を開始します。
- SSCチャンネルと蛍光チャンネルの両方から得られたイベント数を比較します。これらはほぼ等しいはずです(<10%の差)。そうでない場合は、光電子増倍管(PMT)の設定や蛍光チャンネルのレーザー強度など、サイトメーターの設定を確認してください。あるいは、共焦点顕微鏡などの他の方法を使用して、担体の蛍光標識が存在し、均一であることを検証します。
- 手順2.1.3-2.1.5を、ストックとは異なる希釈液でさらに2回以上繰り返します。各サンプルのイベント数がバックグラウンド イベント数より少なくとも 1 桁大きいことを確認します。
- 3つ以上のサンプルが線形トレンドを示すこと、つまり、2倍のサンプル希釈により、測定されたキャリア濃度が対応する2倍減少することを確認します。
- 直線範囲内のサンプル、対応する希釈係数、および既知のサイトメーター流量を使用して、式 (1) に従ってストックキャリア濃度を計算します。
(1)
ここで、 C はキャリア/mL単位のストックキャリア濃度です。蛍光ではなく、光散乱検出から得られたイベントカウントを使用することをお勧めします。
- 光散乱チャネル(通常は側方散乱[SSC])と蛍光の両方でキャリアを検出するようにサイトメーターを設定します。キャリアを検出できるようにしきい値を調整してください。
- キャリアあたりの蛍光強度の決定を含む、キャリア-細胞実験のフローサイトメトリー読み出し
注:理想的には、キャリアあたりの蛍光強度は、キャリアセル実験にできるだけ近い場所で決定されます。これは、個々のキャリアについて得られたMFIを、キャリアに関連する細胞のMFIと直接比較できるようにするためです。実際には、サイトメーターは通常、同じPMT電圧を使用して連続した日に使用した場合、同様の結果を生成しますが、これは保証できません。- キャリアセル実験を計画します。ステップ2.1で決定されたキャリア濃度を使用して、所望の用量のキャリアを投与する。
- 関連するチャンネルで最適なPMT電圧設定を決定することにより、最終的なキャリアセル実験用のフローサイトメーターをセットアップします。キャリア検出を許可するしきい値を設定します。
- 懸濁状態でキャリアを実行し、現在のPMT設定でのキャリアあたりの蛍光強度を決定します。
- 必要に応じて、サイトメーターの閾値を変更して、キャリアではなく細胞を検出します。
- ネガティブコントロールサンプル(キャリアとインキュベートされていない細胞)を実行して、細胞のバックグラウンド蛍光(自家蛍光)を決定します。
- キャリア細胞サンプルを実行して、細胞あたりの蛍光強度を測定します。この蛍光は、細胞の自家蛍光と蛍光キャリアの存在の線形結合です。
- 次の式 (2) を使用して、セルあたりのキャリア数を計算します。
(2)
ここで、Pアソソックは細胞当たりの結合したキャリアの数、FI細胞はキャリアと共にインキュベートされた細胞のMFI、FIバックグラウンドはキャリアと共にインキュベートされなかった細胞のMFI、 FIキャリアは懸濁中のキャリアのMFIである。
(1)
(2)3.バルクストリーム
- キャリアカウント:ナノ粒子追跡分析
注:バルクストリームでは、キャリアカウントはキャリアごとの絶対蛍光強度を定量化するために必要なステップです(ステップ3.1.4を参照)。さらに、懸濁液中のキャリアをカウントすることで、各細胞実験でインキュベートされたキャリアの数を正確かつ再現性よく決定できます。- 準備
- フローセルをレーザーモジュールに取り付け、レーザーモジュール全体を機器内の所定の位置にロックします。
- ゆっくりと(0.1 mL/s以下の速さで)フローセルを~1 mLの蒸留水で洗い流します。フローセル内に気泡が形成された場合は、懸濁液を部分的に引っ込めて気泡を気液界面に融合させてから進めてください。
- フラッシュのほぼ半分でカメラを起動します。キャリアの破片が洗い流されていることを確認してください。[キャプチャ]を選択して[キャプチャ設定]タブを開き、[カメラの起動]をクリックします。
- 1 mLの空気でシステムを乾燥させます。画面に静電気キャリアが表示されている場合は、製造元の指示に従ってフローセルを清掃します。
- 関係するキャリアシステムに応じて、キャリアがボルテックスまたは超音波 処理によって 十分に懸濁されていることを確認することにより、ナノ粒子追跡分析のためにキャリアを準備します。ストック濃度の桁数が不明な場合は、ストックから1:100希釈液を調製し、初期結果をフィードバックとして使用して、将来のサンプル希釈を通知します。担体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ではなく水で希釈して、担体濃度が1 × 107 担体/mLから1 ×10 9 担体/mLの間の各サンプルを少なくとも~0.6-1 mL調製します。
注:濁った懸濁液は一般的に濃度が高すぎます。バッファーと塩は、高いバックグラウンドノイズを生成する可能性があります。
- 測定
- レーザーモジュールを取り出し、直立させます。
- 最初のキャリアサンプルを1 mLシリンジに吸い込みます。シリンジをチューブインレットに取り付け、サンプルをフローセルに慎重にロードします。フローセル内に気泡が形成された場合は、懸濁液を部分的に引っ込めて気泡を気液界面に融合させてから進めてください。フローセル全体が液体で満たされていることを確認してから、一時停止します。
- 必要に応じてカメラのフォーカスを調整して、個々のキャリアを視覚化します。機器の右側にある回転ノブで粗いフォーカス調整を行います。[ ハードウェア ]タブを選択して微調整する | ポンプ/ステージ。 フォーカス スライダーを調整してフォーカスを変更します。
- カメラレベルを調整して、過飽和がないことを確認します。[ キャプチャ] タブで、スライダーを調整して最適な カメラレベル を選択します。
- 機器にこのアクセサリが装備されている場合は、キャリアサンプルを含むシリン ジをシリンジポンプ にロードして、測定中に継続的なサンプルフローを確保します。
- [SOP]タブで、[標準測定]を選択して、それぞれ30秒のキャプチャを5回取得します。ベースファイル名を入力し、必要に応じて、[詳細設定]ボタンをクリックしてサンプル情報を追加します(さまざまな選択肢を含むモーダルダイアログが開きます)。
注意: 希釈係数を入力すると、最終的なキャリア濃度測定はソフトウェアによって自動的に調整されます。この要素を入力することはお勧めしません。代わりに、手動で調整を行うと、分析が容易になり、各希釈液が機器のダイナミックレンジ内にあるかどうかを評価できます(ステップ3.1.3.4)。 - [スクリプトの作成と実行]を押して、[サンプルを進めてください]を求めるポップアップが表示されるのを待ちます。
- シリンジポンプを使用している場合は、[ハードウェア]タブを選択します。シリンジポンプタブ |注入速度を30〜80に設定し、注入を押します。シリンジポンプを使用しない場合は、サンプルを手動で進めます。
- ポップアップ ウィンドウで、[OK] を選択してキャプチャを開始します。5 つのキャプチャのそれぞれが終了した後、[サンプルを事前に進めてください] ポップアップが再表示されたら、サンプルが手動またはシリンジ ポンプを介してフロー セル内を移動していることを確認します。次に、 [OK] を選択して次のキャプチャを続行します。
注意: 5回のキャプチャの後、ソフトウェアは自動的に[プロセス]タブを開き、プロセス設定の調整を求めるポップアップを開きます。
- 解析
- [ プロセス ] タブで、[ 検出しきい値 ] スライダー ( 4 から 8) を調整して、画面に表示される個別のキャリアを正しく識別します。 画面ゲイン も調整して、視覚化を支援します。ダウンストリーム解析には影響しません。キャプチャ画面の下にあるスライダーを使用して、ビデオの複数のフレームをスクロールし、検出しきい値の設定を支援します。
注意: 検出しきい値は一度設定する必要があり、その後、測定またはサンプル間で変更しないでください。 - ポップアップ(手順 3.1.2.9 の後)で、[ OK ] を押してトラッキング分析を開始します。[ 分析 ] タブをクリックして分析の進行状況を監視する | [単一解析 ] タブ。
- 分析が完了したら、表示される [設定のエクスポート] プロンプトを探します。このプロンプトでは、[PDF を含める] と [実験の概要を含める] が既定で選択されます。必要に応じて、他のエクスポート形式を選択します。
- PDFデータエクスポートの結果セクションで、測定された濃度が信頼できることを確認するために、測定されたキャリア濃度が1×107キャリア/mLから1×109キャリア/mL(機器のダイナミックレンジ)の間であることを確認し、濃度測定結果の下にエラーメッセージや注意メッセージがないか確認します。
- 手順3.1.2.1-3.1.3.4を、ストックとは異なる希釈で2回以上繰り返します。各サンプルの濃度が機器の直線範囲内にあることを確認してください。
- 線形傾向を示す3つ以上のサンプルを選択する、すなわち、2倍のサンプル希釈は、測定されたキャリア濃度の対応する2倍の減少をもたらすはずである。選択したサンプルと対応する希釈係数を使用して、ストックキャリア濃度を計算します。
- [ プロセス ] タブで、[ 検出しきい値 ] スライダー ( 4 から 8) を調整して、画面に表示される個別のキャリアを正しく識別します。 画面ゲイン も調整して、視覚化を支援します。ダウンストリーム解析には影響しません。キャプチャ画面の下にあるスライダーを使用して、ビデオの複数のフレームをスクロールし、検出しきい値の設定を支援します。
- キャリアあたりの絶対蛍光強度の決定
注:このストリーム内の個々のキャリアの蛍光を直接特徴付けることはできないため、蛍光強度はバルクで定量化されます。この方法は、蛍光強度がランバート・ベールの法則に従って蛍光色素濃度に直線的に関連しているという事実に依存しています。懸濁液中の担体のそのようなバルク定量が既知の担体濃度の懸濁液に対して行われる場合(ステップ3.1を参照)、担体当たりの蛍光を導出することができる。このステップは、蛍光プレートリーダーまたは分光蛍光光度計のいずれかで実行できます。蛍光強度は、MESFの数で与えられる既知の絶対蛍光を有するサンプルの標準曲線と比較される。- 遊離蛍光色素の溶液を使用して担体を標識する:色素を適切なバッファー(DMSOなど)に再懸濁し、担体希釈液と同じバッファーでさらに希釈します。あるいは、蛍光色素に結合した抗体の溶液を使用する。原液の濃度(MESF/mL)は、mg/mL単位の濃度、mg/mol単位の分子量、および式(3)を用いてアボガドロ数から算出します。キャリア希釈液で段階希釈を行い、検量線サンプルを生成します。
(3)
注:蛍光色素標識抗体は、標識の程度、つまり溶液中の蛍光色素と抗体のモル比がわかっている場合にのみ使用してください。最初に、担体サンプルの蛍光強度がまだ不明であるため、広い範囲の標準曲線を生成します。ここから、必要な範囲を含むように絞り込みます。 - キャリアサンプルを準備します。
注:ベストプラクティスは、2つ以上のキャリア希釈をテストして、測定値が線形であり、標準曲線の範囲内にあることを確認することです。 - 各サンプルの等量の蛍光、すなわちキャリア曲線と検量線の両方を測定します。
- 検量線を生成し、測定したキャリアサンプルのバルク絶対蛍光強度(MESF/mL)を差し引きます。
- 式 (4) のように、バルク蛍光 (MESF/mL) をキャリア濃度 (キャリア/mL) で割ることにより、キャリアあたりの絶対蛍光強度 (MESF/キャリア) を計算します。
(4)
- 遊離蛍光色素の溶液を使用して担体を標識する:色素を適切なバッファー(DMSOなど)に再懸濁し、担体希釈液と同じバッファーでさらに希釈します。あるいは、蛍光色素に結合した抗体の溶液を使用する。原液の濃度(MESF/mL)は、mg/mL単位の濃度、mg/mol単位の分子量、および式(3)を用いてアボガドロ数から算出します。キャリア希釈液で段階希釈を行い、検量線サンプルを生成します。
- 細胞実験(担体当たりの等価蛍光強度の決定を含む)
注:このステップでは、フローサイトメトリー定量ビーズを使用して、MESFとMFIの関係の標準曲線を生成します。これらの定量ビーズは、ビーズあたりのMESF数が既知の複数のビーズ集団で構成されており、これらの個々のビーズは任意のサイトメーターで検出できます。理想的には、MESF標準曲線は、キャリアセル実験の読み出しと同時に決定される。これは、個々のキャリアについて計算されたMFI値を、キャリアに関連付けられたセルのMFIと直接比較できるようにするためです。実際には、サイトメーターは通常、同じPMT電圧を使用して連続した日に使用した場合、同様の結果を生成しますが、これは保証できません。- キャリアセル実験を計画します。セクション3.1.3で決定されたキャリア濃度を使用して、目的の用量のキャリアを投与します。.
- 関連するチャンネルで最適なPMT電圧設定を決定することにより、最終的なキャリアセル実験用のフローサイトメーターをセットアップします。
- ネガティブコントロールサンプル、つまりキャリアとインキュベートされていない細胞を実行して、バックグラウンド蛍光を測定します。
- フローサイトメトリー定量ビーズを調製し、再懸濁します。細胞サンプルに用いたのと同じバッファー(PBSなど)を使用してください。ビーズ集団が別々に提供されている場合は、それらを一緒にプールします。
- フローサイトメトリー定量ビーズサンプルを実行します。
- キャリア細胞サンプルを実行して、細胞あたりの蛍光強度を測定します。
- 定量ビーズサンプルを使用して、絶対蛍光強度(MESF)をMFIに変換する検量線を生成します。この検量線とステップ3.1.4の結果を使用して、キャリアの理論上のMFIを計算します。式 (5) を使用して、セルあたりのキャリア数を計算します。
(5)
ここで、Pアソックは細胞当たりの結合したキャリアの数であり、FI細胞はキャリアと共にインキュベートされた細胞のMFIであり、FIバックグラウンドはキャリアと共にインキュベートされなかった細胞のMFIであり、FIキャリアは懸濁中のキャリアの計算されたMFIである(ステップ3.1.4)。
- 準備
(3)
(4)
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Representative Results
前述のように、異なる薬物キャリアタイプは、細胞キャリア会合の絶対定量のために異なる技術の使用を必要とする。例えば、633 nmのジスルフィド安定化ポリ(メタクリル酸)(PMASH)コアシェル粒子は、高感度フローサイトメーターを使用して検出するのに十分な大きさと密度です。そのため、これらの粒子を蛍光標識し、サイドアングル光散乱(SALS、SSCに類似)と適切な蛍光チャネルを使用してゲートしてカウントしました(図3)。両チャネルのイベント数の差は1.98%で、許容範囲内でした。
対照的に、100 nmの超常磁性酸化鉄ナノ粒子は小さすぎて個別に検出できないため、バルクストリームを使用して分析しました。これらのナノ粒子を計数し、ナノ粒子追跡分析を用いて特性評価した(図4)。136nmの平均ナノ粒子サイズは、水中のナノ粒子の流体力学的直径を反映しています。測定されたナノ粒子濃度(実行された希釈に対してまだ補正されていない)は、装置のダイナミックレンジ内にあるため、ナノ粒子濃度の正確な決定が成功していることが示唆されます。
バルクストリームでは、キャリア懸濁液の絶対蛍光強度を、最終的な細胞キャリアインキュベーションに使用されるフローサイトメーターでMFI値に変換します。この実験では、キャリアと同じ蛍光色素で標識した定量ビーズを複数日使用して、フローサイトメーターで標準曲線を作成しました(図5)。測定されたMFIと定量ビーズのMESF値との間の相関は線形であり、測定された日付間でほぼ類似しています。ただし、日付間にわずかな違いが見られる可能性があるため、キャリアセル実験の読み出しの一部として検量線を再生成することをお勧めします。
個々のキャリアのMFIが決定されると、セルキャリア会合データを完全に定量化し、より正確に解釈することができます。235 nm PMASH カプセルで蛍光標識したHeLa細胞を、0時間から24時間の間のさまざまな時点(図6)でインキュベートするなどの経時的実験を行うことが推奨されます。予想通り、中央値の細胞蛍光は時間とともに増加し、カプセルがHeLa細胞と会合していることを示しています。このような実験は、さまざまな時点での相対的なキャリア性能を比較するために使用できますが、これらの結果は絶対的に定量的ではありません。
絶対定量の重要性は、サイトメーターストリームまたはバルクストリームのいずれを介して行われる場合でも、2つのキャリアタイプの関連性を比較すると明らかになります。図7は、相対定量(図7A)または絶対定量のいずれかによって分析された同じ2つの実験を示す。キャリアに対する明らかな細胞応答の違いは、実行された分析に応じて顕著です。相対定量を使用する場合、担体を直接比較すべきではありませんが(図7A)、絶対定量は標識強度とは無関係であるため、より同等です(図7B)。
図3:フローサイトメーター(サイトメーターストリーム)を使用した粒子の計数。Apogeeフローサイトメーターを使用した。 (A)光チャネル(SALS)を使用した粒子カウントにより、イベントカウントは200,659になります。(B)キャリアの蛍光チャネルを使用したキャリアカウント、イベントカウントは204,636になります。どちらの場合も、arcsinh変換とそれに続くゲーティングが適用されました(それぞれ6と4)。Fariaら10で最初に発表された633nmコアシェル粒子の生データから作成された図。略称: SALS = 小角光散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ナノ粒子追跡分析(バルクストリーム)を使用したキャリアのカウント。 サイズが100nmの超常磁性酸化鉄ナノ粒子を特徴付け、ナノ粒子追跡分析を使用してカウントしました。左、5回の反復測定の個々の結果の濃度/サイズヒストグラム。右、5回の反復のSEM±平均濃度/サイズ分布。この特定のサンプルでは、ストックから1:2,000の希釈を実行して、機器のダイナミックレンジ内の濃度を取得しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:フローサイトメーター(バルクストリーム)上の定量ビーズを使用したMESFからMFIへの変換。 4つの異なるMESF値を有する蛍光ビーズをフローサイトメーターで様々な日に分析し、標準曲線を描画した。略語:MESF =等価可溶性蛍光色素の分子。MFI = 蛍光強度の中央値。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:フローサイトメーター-タイムコースシリーズ(サイトメーターストリームおよびバルクストリーム)の最終細胞実験。 経時変化実験からのフローサイトメトリーデータの代表的な画像。THP-1細胞を235 nmのポリマーカプセルとともに0時間、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間、および24時間(左から右)インキュベートしました。キャリア蛍光はx軸に示され、光チャネルはy軸に示されます。いずれの場合も、arcsinh変換が実行されました。ゲーティングは実行されませんでした(グラフの限界を選択する以外)。Fariaら10の生データから作成。略称: SALS = 小角光散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:キャリア-細胞会合の相対定量と絶対定量(サイトメーターストリームおよびバルクストリーム)。 両方の図は、Fariaらの生データから作成された、RAW264.7マクロファージと150 nm(青色)または633 nmコアシェルキャリア(オレンジ)との間の24時間のインキュベーションの同じ2つの実験からのデータを視覚化しています10。両方のテクニカル反復の中央値がプロットされます。(A)相対定量、a.u.でMFIとして報告される(B)絶対定量、細胞あたりのキャリア数として報告される。略語:MFI =蛍光強度の中央値;a.u. = 任意の単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
薬物キャリアと細胞の間の相互作用を特徴づけることは、新しい薬物送達システムの開発においてますます重要になっています。具体的には、様々な担体構築物の合理的な評価および比較を可能にするために、標的細胞およびオフ標的細胞と相互作用する前記担体の性能の絶対定量化が重要である。このプロトコルは、薬物キャリアを扱う研究者が、細胞キャリアの会合に関する相対的な半定量的フローサイトメトリーデータを絶対定量結果に変換できるようにする2ストリーム方法論について説明しています。概説されたプロセスは、蛍光標識されていれば、小型、大型、有機、無機など、あらゆるタイプの担体に適用できます。ただし、キャリアが異なれば、セルあたりのキャリアを計算するために必要なアプローチも異なります。これは、必要な特性評価測定に使用されるさまざまな計測器の制限によるものです。
そのため、このプロトコルは、サイトメーターストリームとバルクストリームの2つのストリームに分割されます。1つ目のサイトメーターストリームは、フローサイトメーターのみを必要とするより簡単なアプローチですが、このサイトメーターは、使用する個々のキャリアを検出するのに十分な感度、つまり、目的の薬物キャリアを検出するのに十分な大きさと密度である必要があります。バルクストリームは、代替計装を使用することで個々のキャリアを検出する必要性が回避されるため、あらゆるキャリアタイプと互換性があります。ただし、バルクストリームでは、より多くの特性評価実験を行う必要があります。
適切な Stream (および適切なテクノロジ) の選択を支援するために、上記の考慮事項をデシジョン ツリーにまとめました (図 1)。繰り返しになりますが、バルクストリームは、使用するキャリアタイプに関係なく、すべての研究者に適しているため、常にバックアップとして戻すことができます。2 つのストリームのワークフローの概要を 図 2 に示します。特に、フローサイトメーターの感度の継続的な進歩により、サイトメーターストリームはより多くの<300 nmキャリアに使用できる可能性があります。
この手順についていくつかの注意をする必要があります。第1に、細胞蛍光を細胞当たりの担体の絶対数に変換するための記載された戦略は、懸濁液中の個々の担体蛍光の測定に依存する。しかしながら、蛍光は、蛍光色素の直接的な化学的環境(例えば、担体希釈剤、細胞表面、または様々な細胞内区画)によって影響を受ける。特に、エンドソーム区画の酸性環境は、ある種の主としてタンパク質ベースの色素11の蛍光強度に影響を及ぼすことが知られている。そのため、研究対象の担体の種類に関係なく、薬物担体の標識にはpHに敏感で光安定性の高い色素範囲を使用することをお勧めします(推奨事項については、 材料の表 を参照してください)。この色素範囲の追加の利点は、その一般的な明るさであり、薬物キャリア検出の感度を高めます。
第二に、上記の方法はガイダンスを提供することを意図していますが、定量ワークフローのさまざまなステップを実行するために使用できる技術の排他的なリストを形成するものではありません。特に、より小さいまたは低散乱のキャリア(バルクストリームのもののように)をカウントするためのさまざまな技術が存在します。これらには、同じナノ粒子追跡分析12を実行できる他の機器、およびマルチアングル動的光散乱、質量分析、電子顕微鏡13、重量測定、または光学密度測定などの他の方法が含まれます(ShangおよびGao14によってさらにレビューされます)。さらに、この実験的定量化(任意の蛍光単位から細胞あたりのキャリアの絶対数への移行)は、「定量的生物学ワークフロー」と呼ばれるものの一部にすぎません。絶対的な実験定量は必要ですが、十分ではありません。キャリアの会合を定量化して報告するだけでは、インキュベーション時間、用量、添加する薬物キャリアの濃度、実験容器ごとに使用される細胞数など、実験セットアップによる粒子会合の違いは考慮されません。
さらに、異なる物理化学的特性を有する担体は、実験設定が同じであっても、細胞に送達される投与量が大きく異なる可能性があります15。キャリア性能は、in vitroであっても、これらすべての要因を考慮せずに決定することはできません。言い換えれば、キャリアと細胞の会合を単に定量化するだけでは、一般に、研究者と研究室の間でキャリアを公平に比較することはできません。この観点から、特定のキャリア−細胞対10間の親和性の不偏かつ定量的尺度として、運動学的パラメータ(すなわち速度定数)を導出するために、キャリア−細胞会合の時間経過実験およびその後のインシリコ数学的モデリングを実行することの重要性についての事前の議論があった。実験的定量化はまた、生物学的異質性16の潜在的な原因を特定すること、または複雑な生物学的モデル17における侵入動力学を決定することなど、適用される他のインシリコ技術のための前提条件でもある。標準化された報告のためのバイオナノ実験文献ガイドラインにおける最小情報報告18と組み合わせることで、キャリア性能の定量的評価は、新しいナノメディシンの開発を加速することができます。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC;プログラム助成金番号GNT1149990)、オーストラリアHIVおよび肝炎ウイルス学研究センター(ACH2)、およびレジェーンルイーズラングロワの不動産からの贈り物。FCは、国立保健医療研究評議会(NHMRC)のシニアプリンシパルリサーチフェローシップ(GNT1135806)の授与を認めています。図 1 と 図 2 は BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
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