Summary
在这里，我们描述了一种从心肌梗死后（MI）小鼠心脏中分离出足够数量的具有高活力的单个非心肌细胞的方案。这可用于随后的单细胞测序、流式细胞术分析和原代细胞培养。
Abstract
心肌梗塞（MI）是最常见的心血管疾病之一，全球死亡率都在上升。非心肌细胞占心脏细胞总数的一半以上，它们有助于心肌损伤时的适应性补偿，包括炎症反应、组织修复和瘢痕形成。为了研究MI后的心脏微环境，单细胞RNA测序（scRNA-seq）被广泛用于识别不同的心脏细胞类型和细胞间通讯。在scRNA-seq样品制备程序中，制备细胞悬液是最关键的步骤之一，因为细胞活力会影响scRNA-seq结果的质量。因此，我们设计了一种实验方案，用于从MI后小鼠心脏制备非心肌细胞悬液，并特别关注通过选择温和的消化酶，控制消化时间和应用荧光激活细胞分选（FACS）来提高细胞活力。最后，我们从通过该协议获得的非心肌细胞悬液中分离CD45 + 细胞，然后我们进行了scRNA-seq。
Introduction
心肌梗塞（MI）是最常见的心血管疾病之一，其死亡率在全世界都在上升1。心肌梗死是由周围心肌的血液供应不足引起的，这可能是动脉粥样硬化斑块破裂时冠状动脉阻塞的结果。尽管经皮冠状动脉介入治疗 （PCI） 降低了急性心肌梗死患者的死亡率，但心肌梗死后心力衰竭的高患病率仍然是一个问题2。心肌梗死后心力衰竭的关键病理生理学是身体对心脏损伤的代偿反应，包括用非收缩性纤维化瘢痕替换死去的心肌。这些适应性反应在很大程度上依赖于由多种细胞类型和心脏组织细胞之间的相互作用介导的局部炎症，这种炎症现在被认为是减少纤维化疤痕形成的潜在治疗靶点，从而防止心肌梗死后心力衰竭3，4。有趣的是，梗死部位的微环境在MI1，5的不同阶段经历了浸润细胞类型和功能的时间依赖性转变。许多研究表明，非心肌细胞（例如免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞）在心肌梗死后炎症和组织修复中起核心作用5，6。近年来，单细胞测序已被广泛用作阐明非心肌细胞在后MI微环境中的参与和功能的有力工具7，8。 这为心肌梗死后损伤和修复的病理生理学以及针对心肌梗死后心力衰竭的潜在疗法的开发提供了见解。
高通量RNA测序（RNA-Seq）是一种使用下一代测序（NGS）7，8，9详细研究整个转录组的技术。最近，scRNA-Seq的发展彻底改变了生物医学研究领域。与传统的批量测序相比，scRNA-Seq在单细胞水平上分析基因表达谱和转录异质性7，8。该技术通过识别后MI微环境中的不同循环细胞类型并揭示心肌细胞和非心肌细胞之间的相互作用，显着促进了MI9，10细胞病理生理学的研究。这些发现进一步有助于发现心肌梗死后心力衰竭的新治疗靶点。一般来说，基于scRNA-seq的MI后实验包括三个主要部分：（1）MI后动物模型的建立;（2）细胞悬液的制备;（3）样本测序和数据分析。值得注意的是，制备细胞悬液是制备scRNA-Seq实验中最关键的一步，因为细胞悬液的质量决定了结果的准确性。
该协议旨在从MI后的心脏组织中提取非心肌细胞悬液;值得注意的是，包括维持细胞活力和分辨率的具体细节。同时，该方案中使用的设备，例如小鼠手术套件，啮齿动物呼吸机和离心机，可以在大多数动物实验中心和生物医学实验室中找到，因此，该方案的实验成本相对较低。此外，如果将梗死的时间点和部位视为变量，则该协议可用于模拟广泛的临床场景，特别是对于心肌梗死后并发症。
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Protocol
所有实验均按照浙江大学实验动物护理和使用指南进行，并经浙江大学动物咨询委员会批准。
1.左前降冠状动脉结扎术（LAD结扎术）手术
注意：使用八周龄雄性C57BL / 6J小鼠作为模型。心肌梗死后2周摘取心脏。 如前所述进行左前降冠状动脉结扎手术11。
- 手术前用70%乙醇对手术器械进行消毒。
- 称量小鼠，然后腹膜内注射1%戊巴比妥钠（50mg / kg）麻醉小鼠。观察脚趾捏反射，并测量呼吸频率以评估手术过程中的麻醉深度。
- 将鼠标放在带有37°C加热垫的手术台上。使用眼药膏防止眼睛脱水。
- 用脱毛膏涂抹左心前区胸部和颈部，并用棉签去除毛发。用碘酒消毒皮肤，然后用70%的酒精清洁该区域三次。
- 在显微镜下进行中线宫颈切口（0.8-1.0厘米）。分离气管周围的皮肤、肌肉和组织，然后将 20 G 套管插入气管。
注意：在显微镜下将套管插入气管时观察，以确保管子没有插入食道。 - 将鼠标连接到设置为0.2 mL潮气量的啮齿动物呼吸机上，每分钟150次冲程。
- 用无菌剪刀沿锁骨中线斜切小鼠胸部。解剖皮下组织以暴露肋骨。
- 使用无菌剪刀沿左锁骨中线（0.8-1.0厘米）斜切皮肤。进行左开胸术，分离第三和第四肋骨，露出心脏。使用肋条牵开器以获得清晰的视图。
- 用弯曲的镊子打开心包，然后使用7-0丝缝合线结扎左前降动脉（左心房附件下方）。左心室前壁苍白表明心肌灌注成功中断。
- 松开肋骨牵开器，用5-0丝线将胸廓线分层缝合，同时从胸部排出空气。用5-0缝合丝线缝合颈部切口。
- 一旦恢复自主呼吸，就从鼠标上取下气管插管。腹腔注射0.5mL预热无菌盐水。每12小时皮下注射丁丙诺啡（0.1mg / kg），以减轻疼痛。
- 最后，将鼠标放在加热垫上等待复苏。通过目视观察 监测 鼠标，确保它不会过度呼吸困难或出血。
- 鼠标醒来后将鼠标放回笼子。在第一周，每天监测鼠标，以验证其活动性、梳理和饮食习惯是否足够。根据实验需要，在心肌梗死后的不同时间点收获心脏。
注意：在该协议中，单细胞悬液是在MI后2周用心脏制备的。
2.心脏单细胞悬液的制备
- 溶液和培养基的制备
- 心脏组织解离缓冲液：将 10 mg 胶原酶 IV （600 U/mL）、5 mg 分散酶 II （0.5 U/mL） 和 50 μL 脱氧腺素酶 I （100 μg/mL） 混合在 5 mL RPMI 1640 中。使用前在水浴中将该培养基预热至37°C。
- 细胞洗涤缓冲液：在磷酸盐缓冲盐水（PBS，PH 7.4）中制备1%BSA或10%FBS，并保持在4°C或冰上。
- 灌注溶液：预冷PBS（PH 7.4）作为灌注溶液。
- 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液：使用制造商提到的红细胞裂解缓冲液。
注意：有关本研究中使用的试剂和设备列表，请参阅 材料表 。
- 通过腹膜内戊巴比妥钠（150mg / kg）注射对小鼠实施安乐死。
- 心脏解剖
- 用胶带将其后肢固定到位，将鼠标置于仰卧位。
- 用70%乙醇喷洒身体，然后垂直穿过腹部皮肤和肌肉，同时避免刺穿肝脏。小心地打开胸部，同时避免刺穿心脏。
- 使用预冷的 PBS （PH 7.4） 灌注左心室，直到观察到无色灌注液（需要大约 15 mL PBS [pH 7.4]）。
- 用镊子轻轻地将心脏从胸部提起，并用眼科剪刀剪掉附着在心脏外部的多余组织。将心脏置于 1.5 mL 微量离心管中的 1 mL 预冷 PBS （PH 7.4） 中。
- 心脏组织的酶解离
- 将小鼠心脏转移到24孔板的一个孔中，将150μL心脏组织解离缓冲液放在冰上，并用剪刀将其切成小块（~1mm）。
- 将切碎的心脏组织转移到装有 5 mL 组织解离缓冲液的 15 mL 离心管中。
注意：推荐的心脏组织解离缓冲液体积为 5 mL/心脏。 - 将离心管置于37°C下以125rpm的电动恒温往复摇床中1小时。 每20分钟上下移取组织悬浮液10次。
- 通过70μm细胞过滤器过滤细胞悬液以去除未消化的组织和团块。加入 25 mL 细胞洗涤缓冲液冲洗原始管，然后将其转移以冲洗细胞过滤器。接下来，通过40μm细胞过滤器过滤细胞悬液以进一步去除细胞团块。
- 在4°C下以300× g 离心过滤的细胞悬液5分钟。 弃去上清液，然后将细胞样品重悬于1x RBC裂解缓冲液中，在室温（RT）下5分钟。
- 加入四倍体积的细胞洗涤缓冲液，并在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 取出上清液，并将细胞重悬于10 mL细胞洗涤缓冲液中。在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 除去上清液，并将细胞重悬于1mL细胞洗涤缓冲液中。
- 将 18 μL 细胞悬液与 2 μL 吖啶橙 （AO）/碘化丙啶 （PI） 染色溶液 （9：1） 混合，并将 10 μL 混合物加入计数室载玻片中。使用自动细胞计数器评估细胞数量和活力。
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Representative Results
通过实施该协议的第2节获得了具有高活力的单细胞悬液。然而，仍然可以观察到细胞碎片（图1A）;因此，进行了荧光激活细胞分选（FACS）以进一步提高质量16。FACS后，平均细胞大小从9.6μm减小到9.1μm（ 表1），这表明FACS可以有效降低细胞悬液中细胞片段的比例 （图1B）。用于FACS的门控策略如图 1C所示。
除 图1中的图像外，还通过细胞计数器测量细胞浓度、平均细胞大小和细胞活力（表1）。细胞浓度的差异是由于细胞悬浮液的体积。值得注意的是，FACS后平均细胞大小减小（表1），这表明FACS可以有效减少细胞聚集并去除细胞碎片。
进行ScRNA-seq以研究心脏免疫微环境，同时验证通过该协议获得的细胞悬液质量。制备单细胞悬液后，我们首先对表达表面蛋白CD45的细胞进行分类，CD45是多种免疫细胞的常见标志物。接下来，我们使用10X Genomics平台17对CD45 +细胞进行了scRNA-seq。通过这种方式，我们将来自三个健康心脏样本的14，217个单个细胞合并到质量控制后的合并数据集中（表2）。t分布随机邻域嵌入（t-SNE）维数的无监督聚类和降低显示七种类型的免疫细胞明显分离（图2）。此外，每种免疫细胞类型都显示出经典标志物的高表达。最后，这些结果表明，该方案制备的单细胞悬液对单细胞测序具有很高的效力。
图1：心脏单细胞悬液中的细胞活力。 （A）没有FACS的细胞活力。黑色箭头表示细胞碎片（无荧光）。（B）FACS的细胞活力。黄色箭头表示活细胞（绿色荧光），红色箭头表示死细胞（红色荧光）。（C）门控策略。比例尺：50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：来自三个小鼠心脏样本的心脏 CD45+ 细胞的单细胞 RNA 测序。 （A）CD45 + 细胞的tSNE图，显示基于典型标记基因鉴定的免疫细胞群。（B）每个亚群中前五个差异表达基因的热图。 请点击此处查看此图的大图。
| 在FACS之前 | 在 FACS 之后 | |
| 总细胞浓度（细胞/毫升） | 约1.51 x 106 | 3.40 x 105 |
| 活细胞浓度（细胞/毫升） | 约1.40 x 106 | 3.15 x 105 |
| 死细胞浓度（细胞/毫升） | 约1.09 x 105 | 2.48 x 104 |
| 生存能力 （%） | 92.8 | 92.7 |
| 平均细胞大小（微米） | 9.6 | 9.1 |
表1：FACS前后的心脏单细胞悬液。 使用自动细胞计数器比较FACS之前和之后获得的心脏单细胞悬液的细胞密度。
| 估计 | |
| 估计的细胞数 | 14,217 |
| 每个单元格的平均读数 | 81,017 |
| 每个细胞的中位数基因 | 1,374 |
| 检测到的基因总数 | 18,424 |
| 每个单元格的 UMI 计数中位数 | 4,021 |
| 有效条形码 | 98.4% |
| 映射到基因组的读取 | 95.1% |
表2：质量控制统计数据。 该表列出了健康小鼠心脏的单细胞数据的不同估计值。
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Discussion
本文旨在描述一种在心肌梗死后从小鼠心脏中分离单个非心肌细胞的方案。该方案可用于高质量分离后MI微环境中不同类型的细胞，包括免疫细胞，内皮细胞和成纤维细胞。三个基本因素对于获得用于单细胞测序的高质量细胞悬液至关重要。第一个是酶消化的设置。重要的是控制消化时间以及消化酶的体积和浓度，以确保细胞活力和分离效率。在这种情况下，我们适当增加酶的浓度并延长消化时间。在这里，我们建议消化时间为45分钟至1小时。较短的持续时间可能会增加细胞活力，但可能导致心脏组织消化不足，并可能增加细胞团块的数量。此外，我们使用DNase I来防止细胞聚集，因为裂解细胞可以释放游离DNA包裹周围的细胞形成细胞团块13。第二个基本因素是使用含有BSA或FBS的细胞洗涤溶液。BSA或FBS不仅可以保护酶的活性，还可以提高细胞的活力。最后一个基本因素是促进FACS消除细胞碎片和死细胞。细胞片段会导致细胞计数和活力不准确。这些因素共同增强了细胞悬液的活力和纯度，使其与单细胞测序更兼容。
该协议首先描述了用于单细胞测序的细胞悬液制备，并且还包括以相对较低的成本提高细胞悬液质量的其他程序。与先前研究使用的其他方案相比，我们避免使用可能导致游离DNA诱导细胞聚集的消化酶，例如胰蛋白酶14。去除细胞碎片是单细胞研究的主要挑战之一，一些研究在运行样品之前使用死细胞去除试剂盒来提高细胞活力14，15。然而，在这里，我们建议使用FACS来提高样品纯度，因为它在减少死细胞和碎片方面效率很高。
通过该方案获得的单细胞悬液可以通过流动分析或原代细胞培养（标准无菌程序）进一步分析18。由于消化酶相对温和，因此适合消化心肌梗死不同阶段的心脏组织以及健康心脏的心脏组织。但是，该协议具有一定的局限性。例如，在37°C下长时间消化不可避免地促进了应激基因19，20的表达。这一限制可以通过使用低温活性蛋白酶或减少FACS的消化时间来解决。此外，该协议不包括分离心肌细胞，因此不适合研究局部组织反应。
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Disclosures
提交人声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了浙江省自然科学基金（LQ22H020010）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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