Summary
Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.
Abstract
Mikroglia, beyin mikro ortamında homeostazı koruyan ve çoklu nörolojik hastalıklarda kilit bir oyuncu haline gelen miyeloid kökenli yerleşik bağışıklık hücreleridir. İnsan mikrogliasını sağlık ve hastalıkta incelemek, insan hücrelerinin son derece sınırlı arzı nedeniyle bir meydan okumayı temsil eder. İnsan bireylerden türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) bu bariyeri aşmak için kullanılabilir. Burada, in vitro deneyler için insan iPSC'lerinin mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) nasıl ayırt edileceği gösterilmiştir. Bu iMG'ler, mikroglia benzeri morfoloji, uygun belirteçlerin ekspresyonu ve aktif fagositoz dahil olmak üzere mikroglia'nın beklenen ve fizyolojik özelliklerini sergiler. Ek olarak, insan iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan (i3LMN'ler) türetilen sinaptozom substratlarının izole edilmesi ve etiketlenmesi için belgeler sağlanmaktadır. Canlı hücreli, uzunlamasına bir görüntüleme testi, pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş insan sinaptozomlarının yutulmasını izlemek için kullanılır ve iMG'nin fagositik kapasitesinin araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan protokoller, insan mikroglia biyolojisini ve mikroglia'nın hastalığa katkısını araştıran farklı alanlara geniş ölçüde uygulanabilir.
Introduction
Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir ve CNS'nin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Mikroglia, yetişkin beyninde homeostazı korumak ve travma ve hastalık süreçlerine aktif olarak yanıt vermek için de önemlidir. Kümülatif kanıtlar, mikroglia'nın çoklu nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anahtar katkıda bulunduğunu göstermektedir 1,2. Mikroglial biyoloji hakkındaki mevcut bilgiler ağırlıklı olarak fare modellerinden türetilmiş olsa da, son çalışmalar murin ve insan mikrogliası arasındaki önemli farklılıkları aydınlatmış ve insan mikrogliasının genetiğini ve biyolojik işlevlerini incelemek için teknolojilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır 3,4. Mikroglia'nın disseke edilmiş birincil dokudan izole edilmesi, mikroglia özelliklerini ciddi şekilde değiştirebilir5, bu tür hücrelerle elde edilen potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar. Bu yöntemin genel amacı, insan iPSC'lerini iMG'lere ayırt etmek, böylece bazal koşullar altında insan mikrogliasını incelemek için bir hücre kültürü sistemi sağlamaktır. Ayrıca, tamamen insan model sistemi kullanan bir fagositoz testi, hem kalite kontrol önlemi olarak hem de hastalık bağlamında iMG disfonksiyonunu değerlendirmek için iMG'lerin işlevselliğini incelemek için bir araç olarak buraya dahil edilmiştir.
Mikroglia'nın iPSC'lerden farklılaşması için çoklu protokoller son zamanlarda literatürdeortaya çıkmıştır 6,7,8,9,10. Bazı protokollerin potansiyel dezavantajları arasında uzun veya uzun süreli farklılaşma, çoklu büyüme faktörlerinin eklenmesi ve / veya karmaşık deneysel prosedürler 6,9,10 bulunmaktadır. Burada, iPSC'lerin ilkel makrofaj öncülleri (PMP'ler) olarak adlandırılan öncü hücrelere farklılaştırılması yoluyla mikroglia ontojenisinin yönlerini özetleyen "kullanıcı dostu" bir farklılaşma yöntemi gösterilmiştir7,11. PMP'ler daha önce açıklandığı gibi oluşturulur ve bazı optimizasyonlar burada12'de sunulmuştur. PMP'ler, kan-beyin bariyeri kapanmadan önce beyni istila ederek embriyonik gelişim sırasında mikrogliaya yol açan MYB'den bağımsız yumurta sarısı kesesi kaynaklı makrofajları taklit eder13. PMP'leri iMG'lere ölümcül bir şekilde ayırt etmek için, Haenseler ve ark. ve Brownjohn ve ark. tarafından protokollere dayanan hızlı ve basitleştirilmiş bir monokültür yöntemi kullandık ve iMG'lerin mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçleri 7,8 sağlam bir şekilde eksprese ettiği verimli bir mikroglia farklılaşma yöntemi oluşturmak için bazı değişiklikler yaptık. Bu farklılaştırma yöntemi, iPSC'lerin kültüründe uzmanlığa sahip laboratuvarlarda ve bir insan modeli sistemi kullanarak mikroglia biyolojisini incelemeyi amaçlayan araştırma hedefleriyle çoğaltılabilir.
iPSC türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve fagositoz da dahil olmak üzere mikroglial kanonik fonksiyonları araştırmak için önemli bir araçtır. Mikroglia, hücre kalıntılarını, toplanmış proteinleri ve bozulmuş miyelin14'ü temizledikleri beyin ve CNS'nin profesyonel fagositleridir. Mikroglia ayrıca sinapsları yutarak sinaptik yeniden şekillenmede ve patojenlerin fagositozu yoluyla dış enfeksiyonlara karşı savunmada işlev görür15,16. Bu protokolde, iMG'ler tarafından fagositoz, iMG yutulması için materyal olarak insan sinaptozomları kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla, insan i3LMN'lerinden türetilen sinaptozomları izole etmek için bir açıklama açıklanmaktadır. i3LMN türevi insan sinaptozomları, fagozom işleme ve in vitro bozunma sırasında asidik bölmeler içinde lokalize sinaptozomların miktarının belirlenmesine izin veren pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiştir. Canlı hücre mikroskobu kullanan bir fagositoz testi, mikroglia yutulmasının dinamik sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için gösterilmiştir. Bu fonksiyonel tahlil, tam bir insan sistemi kullanarak sağlık ve hastalıkta mikroglial fagositozdaki olası kusurları araştırmak için bir temel oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler steril olmalı ve tüm adımlar steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Tüm iPSC hatlarının yanı sıra bakım ve farklılaştırma ortamları Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Aşağıda gösterilen mikroglia farklılaştırma yöntemi, burada açıklanan yeni değişikliklerle daha önce yayınlanmışprotokoller 7,8,12'ye dayanmaktadır.
1. Mikroglia farklılaşması
NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir.
- İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kültürü
NOT: iPSC kültür tekniklerini açıklayan daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir17.- Çözme ve bakım
- iPSC ortamını hazırlayın, ortamı aliquot edin ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Alikotları gece boyunca 4 ° C'de çözün ve 1 haftaya kadar kullanın. Kullanmadan önce ortamı ortam sıcaklığında en az 1 saat bekletin.
- 6 delikli bir plakanın kuyularını, kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'de seyreltilmiş 1 mL'lik 10 μg / mL laminin 521 ekleyerek kaplayın18. Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de en az 2 saat veya tercihen bir gece boyunca saklayın. Seyreltildikten sonra, laminini 3 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Steril suda seyrelterek 10 mM Rho kinaz inhibitörü Y27632 (ROCK İnhibitörü) stok çözeltisi hazırlayın. ROCK inhibitörü çözeltisinin tek kullanımlık alikotlarını yapın ve bunları 1 yıla kadar -20 ° C'de saklayın.
- DPBS'de 0,5 M EDTA'nın stok çözeltisini seyrelterek 0,5 mM EDTA hazırlayın.
- Dondurulmuş iPSC'lerin bir şişesini eritmek için, şişeyi çoğunlukla çözülene kadar 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Şişenin içeriğini derhal 4 mL iPSC ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
- Süpernatantı aspire edin ve kolonilerin bozulmasını önlemek için tüpün duvarına yavaşça 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL iPSC ortamı ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın.
- Kaplanmış kuyucukların her birine 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1,5 mL iPSC ortamı ekleyin ve yeniden askıya alınan kolonileri damla damla ortamı içeren kuyucuklara aktarın.
NOT: Kültür bakımı için adım 1.1.1.6'dan 5-7 damla kullanın, ancak her iPSC hattı için optimum tohumlama yoğunluğunu ayarlayın. - Plakayı yan yana ve arkadan öne doğru manuel olarak karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, ROCK inhibitörü olmadan taze iPSC ortamı ekleyerek ortamı tamamen değiştirin.
- Bakım için, hücreler% 80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her gün değiştirin.
NOT: Kullanılan iPSC ortamı esnek bir besleme programına izin veriyorsa, hücreler ortamı değiştirmeden 2 gün boyunca muhafaza edilebilir. Bunu geçiş başına bir kez ile sınırlamanız ve yalnızca hücrelerin% 50'den az birleşik olması durumunda tavsiye edilir.
- Bölme
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
- Hücreleri yerinden çıkarmak için, 1 mL 0.5 mM EDTA ekleyin ve hücre kolonilerinin kenarları kuyunun yüzeyinden kalkıncaya kadar oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Hücreleri DPBS ile tekrar yıkayın ve 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
- Hücre kolonilerini, bir hücre kaldırıcı kullanarak hafifçe kazıyarak ayırın. Kolonileri rahatsız etmemek için kuyunun her alanını sadece bir kez kazıyın.
NOT: Kolonileri kuyudan çıkarmak için alternatif yöntemler başka bir yerde bulunabilir17. - 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri toplayın ve 1,5 mL iPSC ortamı içeren önceden kaplanmış kuyucuklara (adım 1.1.1.2'de belirtildiği gibi) 1:6 oranında (hücrelerden ortama) damla damla aktarın.
- Çözme ve bakım
- Mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) iPSC farklılaşması
NOT: Küçük moleküller ve büyüme faktörleri, DPBS'de steril filtrelenmiş% 0.1 sığır serum albümininde, nihai konsantrasyondan 1.000 kat daha yüksek bir stok konsantrasyonuna çözülür. Erken geçişlerde iPSC'leri iMG'lere ayırmanız önerilir. iPSC hatlarının rutin karyotiplemesi önerilir.- Standart kaplama çözümü hazırlayın
- Hücre dışı matris kaplama reaktifinin stok çözeltisini gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözün.
- Mikrosantrifüj tüplerini ve filtre pipet uçlarını 4 °C'de önceden soğutun.
- Aliquot 250 μL konsantre hücre dışı matris kaplama reaktifi her tüpün içine yerleştirilir ve hemen buzun üzerine yerleştirilir. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
- Kaplama çözeltisini hazırlamak için, hücre dışı matris kaplama reaktiflerinden birini gece boyunca 4 ° C'de buz üzerinde çözün.
- İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (DMEM-F12 olarak adlandırılır) büyümesi için optimize edilmiş 50 mL buz gibi soğuk DMEM-F12'yi önceden soğutulmuş bir konik tüpe ekleyin ve buz üzerinde tutun.
- Buz gibi soğuk DMEM-F12'yi birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL'lik bir pipet ucunu soğutun ve ardından hücre dışı matris kaplama reaktifinin 250 μL'sini DMEM-F12 ortamını içeren konik tüpe aktarmak için hemen pipet ucunu kullanın.
NOT: Standart kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
- Embriyoid cisim (EB) oluşumu
- 4 °C'de 4 güne kadar muhafaza edilebilen EB ortamını hazırlayın.
- iPSC'ler %80 akıcılığa ulaştığında, 1 mL DPBS ile yıkayarak ve 37 °C'de 2 dakika boyunca 1 mL ayrışma reaktifi ekleyerek kolonileri ayrıştırın. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için birden çok kez kazıyarak bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri yerinden çıkarın. Hücreleri toplayın ve her şeyi 9 mL DPBS içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL EB ortamında yeniden askıya alın. 10 μL hücre alın ve 1: 1'i Tripan mavisi ile seyreltin. Hücreleri bir hemasitometre ile sayın ve hücre sayısına dayanarak, hücre stokunu 100 μL başına 10.000 hücrenin son seyreltilmesine kadar seyreltin. Hücreleri kaplamak için, seyreltilmiş hücrelerin kuyu başına 100 μL'sini düşük yapışkanlı, yuvarlak tabanlı, 96 delikli bir plakaya ekleyin.
NOT: Genel olarak, iPSC'lerin her %80'lik akıcılık kuyusundan 96 delikli plakanın 48 kuyusu elde edilebilir. - Plakayı 3 dakika boyunca 125 × g'da santrifüj yapın ve 4 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. 2. günde çok kanallı bir pipet kullanarak ve 50 μL eski ortamı nazikçe toplayarak ve ardından 50 μL taze EB ortamını geri ekleyerek yarım orta ölçekli bir değişiklik gerçekleştirin.
NOT: 4. günde, iPSC'ler sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi EB'ler olarak adlandırılan küresel hücresel yapılar oluşturacaktır. EB farklılaştırma süreci, gerekirse 7 güne kadar uzatılabilir.
- İlkel makrofaj öncüllerinin (PMP'ler) üretilmesi
- PMP baz ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
- 6 delikli bir plakanın kuyularını 1 mL buz gibi soğuk Matrigel kaplama çözeltisi ekleyerek kaplayın ve 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de en az2 saat veya tercihen bir gece boyunca inkübe edin.
- EB farklılaşmasının 4. gününde, EB'leri 1 mL pipet uçlarıyla toplayarak (pipet kullanarak) Matrigel kaplı kuyucuklara aktarın. EB'leri kuyudan çıkarmak için bir veya iki kez yukarı ve aşağı pipet. EB'lerin kuyunun kenarına yerleşmesini sağlamak için 6 delikli plakayı eğimli bir açıyla tutun.
NOT: Kaplanmış kuyu başına dokuz veya on EB kaplanabilir. - Tüm EB'ler yerleştikten sonra, EB'leri kuyunun kenarında tutarken 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak eski ortamı nazikçe pipetleyin ve çıkarın. Her bir kuyucuğa 3 mL taze hazırlanmış PMP tam ortam ekleyin. Plakayı yan yana ve arkadan öne doğru manuel olarak karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye yerleştirin.
- EB'lerin kuyunun dibine yapışmasına izin vermek için plakayı 7 gün boyunca rahatsız etmeyin. Bu süreden sonra, PMP tam ortam kullanarak yarım orta bir değişiklik gerçekleştirin.
NOT: Bu noktada, EB'lerin çoğu plakaya tutturulmalıdır. Kayan EB'ler kaldırılabilir. - 5-7 gün sonra, EB'leri kuyucukların dibine tutturulduklarından emin olmak için 4x büyütmede bir ışık alanı mikroskobu altında inceleyin. Ortamı 1.2.3.5'te açıklandığı gibi değiştirin. 21. günde, 3 mL PMP tam ortam ile tam bir ortam değişimi gerçekleştirin.
NOT: Ortamda yüzen miyeloid progenitörler bu noktada belirgin olabilir. Bu hücreler orta değişim sırasında atılmalıdır. - 28. günde, süpernatantta PMP'ler olarak adlandırılan yuvarlak hücreleri arayın ve 10 mL'lik bir pipet ve otomatik pipetleyici kullanarak PMP'leri içeren ortamı toplayın. EB'leri rahatsız etmemeye dikkat edin. PMP'leri ve ortamı 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve adım 1.2.4'te açıklandığı gibi devam edin.
NOT: Genellikle aynı iPSC hattından PMP'ler, 6 delikli bir plakanın beş kuyucuğundan toplanabilir ve tek bir 15 mL konik tüp içinde bir araya getirilebilir. - EB'lerin daha fazla bakımı için 3 mL taze PMP komple ortam ekleyin. PMP'ler EB'lerden 3 aydan uzun bir süre boyunca sürekli olarak ortaya çıktıkça, bunları 1.2.3.7 ve 1.2.3.8 numaralı adımlarda açıklandığı gibi her 4-7 günde bir toplayın (ortamın rengi sarı bir tona değiştirmesine izin vermeyin).
NOT: PMP'ler birkaç ay boyunca toplanabilse de, zamanla fenotiplerini değiştirebilirler.
- iMG'lere farklılaşma
- iMG baz ortamını (Malzeme Tablosu) hazırlayın, steril filtre uygulayın ve 3 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
- PMP'ler 15 mL'lik bir konik tüp içinde toplandıktan sonra, 4 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve 1-2 mL iMG bazal ortam kullanarak PMP'leri yeniden askıya alın. Küçük bir aliquot alarak ve Trypan mavisi ile 1: 1 seyrelterek bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
NOT: 0.5-1.5 × 106 PMP'ler normalde iPSC hattına ve EB kültürünün yaşına bağlı olarak her hafta elde edilir. - Hücrelerin geri kalanını 4 dakika boyunca 200 × g'da tekrar santrifüj yapın. PMP'leri istenen konsantrasyona kadar seyreltin, böylece hücreler taze hazırlanmış iMG tam ortamı kullanılarak hücre kültürü ile işlenmiş plakalar üzerinde ~ 105 /cm2 yoğunlukta kaplanır. Terminal farklılaşmasına izin vermek için 10-12 gün boyunca her 3-4 günde bir taze hazırlanmış iMG komple ortam kullanarak yarım orta bir değişim gerçekleştirin.
NOT: Bu noktada, hücreler mikroglia benzeri morfoloji kazanmalıdır. PMP'lerin mikroglia kaderine bağlılığını doğrulamak için, pürinerjik reseptör P2RY12 ve transmembran protein 119 (TMEM119)9 gibi mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçlerin ekspresyonunu doğrulamak için immünofloresan analizi yapılır. - Hücre sağlığını ve canlılığını korumak için, iMG farklılaşmasının 10 ila 12. günleri arasındaki tüm deneyleri yapın.
- Standart kaplama çözümü hazırlayın
2. Motor nöron kaynaklı insan sinaptozomları kullanılarak fagositoz testi
- iPSC kaynaklı alt motor nöronların transkripsiyon faktörü aracılı farklılaşması (i3LMN'ler)
NOT: Daha önce açıklandığı gibi farklılaşma işlemi için nörogenin-2 (NGN2), adacık-1 (ISL1) ve LIM homeobox 3 (LHX3) transkripsiyon faktörlerini içeren hNIL indüklenebilir transkripsiyon faktörü kasetinin kararlı bir şekilde yerleştirildiği bir WTC11 hattı kullanılmıştır.17. iPSC hattı, adım 1.1.1'de açıklandığı gibi, ancak adım 1.2.1'de açıklanan kaplama koşullarıyla korunmuştur. Herhangi bir hücre dışı matris kaplama reaktifi, laminin 521 gerekli olmadığından nöronal farklılaşma için kullanılacak iPSC'lerin kültürlenmesi için kullanılabilir. Tüm ortamlar kullanımdan önce en az 1 saat boyunca ortam sıcaklığına dengelenir.- 10 cm'lik kapları, adım 1.2.1'de açıklandığı gibi 5 mL standart kaplama çözeltisi ile kaplayın.
NOT: Burada farklılaşma başına 3-4 adet 10 cm'lik tabaklar kullanılmıştır. - İndüksiyon Baz ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 3 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
- Nöron ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
- Steril suda 100 mM borik asit, 25 mM sodyum tetraborat ve 75 mM sodyum klorür karıştırarak borat tamponu hazırlayın. PH'ı 8,5'e ayarlayın ve steril olarak filtreleyin.
- İPSC'ler% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri DPBS ile yıkayın ve 0.5 mM EDTA ekleyerek kolonileri yerinden çıkarın.
NOT: Her 10 cm'lik çanak için genellikle iki kuyu yeterlidir. - Hücreleri ortam sıcaklığında 4-5 dakika boyunca inkübe edin. EDTA'yı çıkarın ve her bir oyuğa HEPES ile 3 mL DMEM / F12 ekleyin.
- Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve hücreleri kuyunun dibinden çıkarmak için 2-3x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek 10 mL'lik bir pipet kullanın.
- Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın ve 3 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yapın.
- Hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü içeren 3 mL iPSC ortamında yeniden askıya alın ve bir hemasitometre kullanarak sayın.
- Plaka 1.5 × 10 μM ROCK inhibitörü içeren 12 mL iPSC ortamı ile önceden kaplanmış 10 cm'lik bir kapta 106 iPSC'ler.
- Ertesi gün, ortamı çıkarın ve hücreleri DPBS ile yıkayın. Transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indüklemek için 12 mL taze hazırlanmış Tam İndüksiyon ortamı ekleyin.
- 2. günde, eşit hacimlerde 0.1 mg / mL poli-D-lizin ve 1 mg / mL poli-L-ornitin ile hazırlanan 5 mL nöron kaplama çözeltisi ile 10 cm'lik kapları borat tamponunda seyreltin. Gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 3. günde, kaplanmış bulaşıkları 3 kat steril suyla yıkayın, suyu tamamen aspire edin ve tabakları eğerek ve ortam sıcaklığında en az 1 saat boyunca bir biyogüvenlik dolabı içinde kısmen açıkta bırakarak bulaşıkları kurumaya bırakın.
- Bulaşıklar tamamen kuruduktan sonra, 37 ° C'de en az 1 saat ve% 5 CO2 için 15 μg / mL laminin ve 40 μM BrdU ile desteklenmiş 6 mL Tam İndüksiyon ortamı ile kaplayın.
NOT: BrdU tedavisi, mitotik olarak aktif hücreleri ortadan kaldırmak ve böylece nöronal kültürlerin saflığını arttırmak için önerilir. BrdU'nun nöronal sağlık üzerindeki etkileri minimumdur. - Farklılaşan hücreleri 10 cm'lik çanak başına 3 mL ayrışma reaktifi ile tedavi edin ve ortam sıcaklığında 3-4 dakika inkübe edin.
- Ayrışma reaktifini çıkarmadan plakaya 6 mL DPBS ekleyin ve hücreleri ayırmak için çözeltideki hücreleri 10 mL'lik bir pipetle 4-5x yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hücre süspansiyonunu toplayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe geçirin. Süzgeci durulamak için 1 mL İndüksiyon baz ortamı ekleyin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri 40 μM BrdU içeren 3 mL Tam İndüksiyon ortamında yeniden askıya alın.
- Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Adım 2.1.14'te eklenen kaplama çözeltisini çıkarmadan 40 μM BrdU içeren 6 mL Tam İndüksiyon ortamında hücreleri seyrelterek 10 cm'lik tabak başına yaklaşık 2.5 × 10 cm'lik tabak 6 hücreyi önceden kaplanmış tabaklara yerleştirin.
- 4. günde, ortamı aspire edin, hücreleri DPBS ile 1x yıkayın ve 40 μM BrdU içeren taze Tam İndüksiyon ortamı ekleyin.
- 6. günde, ortamı aspire edin, hücreleri DPBS ile 1x yıkayın ve 1 μg / mL laminin ile desteklenmiş Nöron ortamı ekleyin.
- 9. günde, ortamın 1 /3'ünü , 1 μg / mL laminin ile desteklenmiş taze Nöron ortamı ile değiştirerek değiştirin.
- Her 3-4 günde bir taze 1 μg / mL laminin ile desteklenmiş Nöron ortamı ile yarım orta değişiklikler yaparak i3LMN'leri 25 gün daha koruyun.
NOT: Bu zaman noktasında, i3LMN'ler uzun süreçlere sahip bir nöronal morfoloji sunmalıdır. Nöronlar ayrıca kümeler veya hücre kümeleri oluşturma eğilimindedir. i3LMN'lerin farklılaşmasının nasıl doğrulanacağına dair daha ayrıntılı bir açıklama başka bir yerde bulunabilir17.
- 10 cm'lik kapları, adım 1.2.1'de açıklandığı gibi 5 mL standart kaplama çözeltisi ile kaplayın.
- Sinaptozom saflaştırma ve etiketleme
NOT: Steril koşulları koruyun ve tüm adımları bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin.- i3 LMN'leri DPBS ile iki kez yıkayın.
- Sinaptozomların izolasyonu için 2 mL buz gibi soğuk hücre lizis reaktifi ekleyin, 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve nöronları sıkıca kazıyın.
- Lisatı birden fazla 2 mL mikrotüpe (tüp başına ~ 1.5 mL lizat) aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.200 × g'de santrifüj yapın.
NOT: Bu prosedür boyunca tüpleri buz üzerinde tutun. - Süpernatantı toplayın (peleti atın) ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüj yapın. Sinaptozomları içeren peleti, DPBS'de% 5 DMSO'luk benzer bir hacme (orijinal lizat gibi) kaydedin ve yeniden askıya alın.
NOT: Sinaptozomlar hemen bir florofor ile etiketlenebilir veya gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklanabilir. - Sinaptozom preparatındaki toplam protein verimini değerlendirmek için tüm tüpler için bir Bisinkoninik asit (BCA) protein testi yapın.
NOT: Protein konsantrasyonunu ölçmek için diğer testler kullanılabilir. Farklı preparatlardan elde edilen toplam protein verimi referans olarak Tablo 1'e dahil edilmiştir. Presinaptik ve postsinaptik proteinlerin varlığını doğrulamak için sinaptoz preparatının batı leke analizinin yapılması önerilir. Burada, presinaptik belirteç, sinaptofizin (SYP) ve postsinaptik belirteç, postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD95), daha önce tarif edildiği gibi batı lekelenme analizi için seçildi19. - Suda 100 mM sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın, pH'ı 8.5'e ayarlayın ve steril filtreleyin.
- Kullanılan pH'a duyarlı boyanın 1 mg liyofilize tozunu 150 μL DMSO içine çözündürün. Tek kullanımlık alikotlar yapın ve bunları -80 ° C'de saklayın.
- Sinaptozomları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüj yapın.
- 100 μL 100 mM sodyum bikarbonat çözeltisinde 1 mg'a kadar sinaptozomları seyreltin.
- Sinaptozomları etiketlemek için, 1 mg sinaptozom başına yeniden yapılandırılmış pH'a duyarlı boyanın 1 μL'sini ekleyin ve ışığa maruz kalmayı önlemek için reaksiyonu alüminyum folyo ile örtün. Bir tüp çalkalayıcı kullanarak oda sıcaklığında 2 saat çalkalayın.
- Tüpe 1 mL DPBS ekleyin ve etiketli sinaptozomları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı çıkarın ve adım 2.2.11'de açıklandığı gibi dört ek yıkama gerçekleştirin.
- Son yıkama ve spinden sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın ve etiketli sinaptozomları DPBS'de% 5 DMSO ile istenen konsantrasyon için bir hacimde yeniden askıya alın (burada kullanılan 0.7 μg / μL). Tek kullanımlık alikotlar hazırlayın ve -80 ° C'de saklayın. Etiketli sinaptozomlara ışığa maruz kalmaktan kaçındığınızdan emin olun.
- Canlı hücreli fagositoz testi
- Plaka 20-30 × 1004 PMP'leri 100 μL iMG tam ortamda 96 delikli plakalara yerleştirin ve adım 1.2.4'te belirtildiği gibi 10 gün boyunca farklılaşma işlemini izleyin.
- Tahlil gününde, canlı hücreler için 1 damla nükleer lekeyi 2 mL iMG bazal ortamına ekleyerek nükleer boyama çözeltisini hazırlayın.
- 96 delikli plakanın kuyucuğu başına 40 μL ortam çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL nükleer boyama çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 ° C'de ve 2 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
- Etiketli sinaptozomları buz üzerinde çözün ve 1 dakika boyunca bir su sonikatör kullanarak hafifçe sonikleştirin. Sinaptozomları hemen buza geri aktarın. Etiketli sinaptozomları iMG tam ortamında, 50 μL ortam başına 1 μL sinaptozom oranında seyreltin.
NOT: Sinaptozom konsantrasyonu tahlil bağımlıdır ve optimizasyon gerektirebilir. Ortamda DMSO'nun nispeten düşük bir yüzdesini (yani% 0.1 veya daha az) korumak için, kuyu başına 2 μL'den fazla sinaptozom eklenmemesi önerilir. - Negatif kontrol olarak, aktin polimerizasyonunu ve dolayısıyla fagositozu inhibe etmek için bazı kuyucuklara sitokalasin D ile ön işlem yapın. İMG tam ortamında 60 μM sitochalasin D çözeltisi hazırlayın. 10 μM'lik son konsantrasyon için her bir kuyucuğa bu çözeltinin 10 μL'sini ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Plakayı inkübatörden çıkarın ve 10 dakika boyunca 10 ° C'de inkübe edin. Plakayı buz üzerinde tutun ve adım 2.3.4'te açıklandığı gibi hazırlanmış 50 μL ortam içeren sinaptozomlar ekleyin.
- Plakayı 10 ° C'de 3 dakika boyunca 270 × g'da santrifüj yapın ve görüntüleme elde edilene kadar plakayı buz üzerinde tutun.
- Görüntüleme edinimi ve analizi
- Plakayı canlı hücre görüntüleme okuyucusuna yerleştirin ve analiz edilecek kuyuları seçin.
- 20x objektif lens seçin.
- Parlak alan ve mavi (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) kanallarının odağı, ışık yayan diyot (LED) yoğunluğunu, entegrasyon süresini ve kazancını ayarlayın. Sinaptozom floresansı ilk zaman noktasında ihmal edilebilir olmalıdır. Kırmızı (RFP) kanala odaklanmak için, parlak alan kanalını referans olarak kullanın. Entegrasyon süresi ve kazancı deneyler arasında farklılık gösterebilir; kırmızı kanal için şu başlangıç ayarlarını kullanın: LED: 4, entegrasyon süresi: 250 ve kazanç: 5.
- Kuyu başına bir montajda elde edilecek tek tek karo sayısını seçin (kuyunun merkezinde 16 karo elde edin, böylece toplam kuyu alanının yaklaşık% 5'ini görüntüleyin). Sıcaklığı 37 °C'ye ve görüntüleme için istenen zaman aralığına ayarlayın.
NOT: Bu çalışmada görüntüler 16 saate kadar her 1 - 2 saatte bir elde edilmiştir. - Analiz yazılımını açın.
- Görüntüleri içeren denemeyi açın. Veri Azaltma simgesine tıklayın.
- Menüde, Tablo 2'de açıklanan parametrelerle montajdaki 4 x 4 ayrı döşemeden tam bir görüntü oluşturmak için Görüntüleme İşlemi altında Görüntüleme Dikiş'i seçin.
- Dikişli görüntüler oluşturulduktan sonra, bu görüntüler için DAPI ve RFP kanallarını kullanarak bir yoğunluk eşiği tanımlayın. Bir resim açın ve Analiz Et'e tıklayın; Analiz altında, Hücresel Analiz'i seçin ve Algılama Kanalı'nın altında, DAPI veya RFP kanallarında dikişli bir görüntü seçin. Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve DAPI kanalındaki hücre çekirdeklerini veya RFP kanalındaki sinaptozom sinyalini doğru seçen bir eşik değeri ve nesne boyutu değerleri oluşturun. Denemenin tamamına uygulanabilecek parametreler optimize edilene kadar işlemi farklı görüntülerle tekrarlayın.
NOT: Önerilen değerler Tablo 2'de bulunabilir. - Çekirdek sayısını saymak için Veri Azaltma menüsüne gidin ve Görüntü Analizi altında Hücresel Analiz'i seçin. Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve Kanal altında, DAPI dikişli görüntüleri seçin ve Tablo 2'de açıklanan parametreleri kullanın.
- Hesaplanan Metrikler sekmesine gidin ve Hücre Sayısı'nı seçin. Sinaptozom sinyalinin alanını elde etmek için Veri Azaltma menüsüne gidin ve Analiz altında Hücresel Analiz'i seçin.
- Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve Kanal altında, RFP dikişli görüntüleri seçin ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak açıklanan parametreleri kullanın.
- Hesaplanan Metrikler sekmesine gidin ve Nesne Toplamı Alanı'nı seçin. Veri Azaltma sekmesinde, Tamam'a tıklayın ve yazılımın elde edilen tüm görüntüleri analiz etmesine izin verin.
- Her zaman noktası için Nesne Toplamı Alanı ve Hücre Sayısı değerlerini dışa aktarın. Zaman noktası başına normalleştirilmiş alanı hesaplamak için Nesne Toplamı Alanı'nı Hücre Sayısı'na bölün. Birden fazla tedaviyi veya genotipi karşılaştırıyorsanız, denklemi (1) kullanarak fagositoz indeksini hesaplayın:
(1) - Sonuçları kaydedin ve verileri entegre edin.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak iMG'ler oluşturmak için, iyi tanımlanmış kenarlara sahip kompakt koloni morfolojisi gösteren farklılaşmamış iPSC'lerle başlamak önemlidir (Şekil 2A). EB oluşum bölümünde açıklandığı gibi tutulan ayrışmış iPSC'ler, farklılaşmanın 4. gününe kadar boyut olarak büyüyecek olan EB'ler olarak adlandırılan küresel agregalar oluşturacaktır (Şekil 2B). EB'ler PMP üretimi için uygun koşullarda toplandıktan ve kaplandıktan sonra, Matrigel kaplı plakalara bağlanırlar ve bir hücre tabakası küresel agregaları yayacak ve çevreleyecektir (Şekil 2C). Sağlıksız EB'ler plakadan ayrılır ve ortadan kaldırılmalıdır. PMP üretiminin 14. ila 21. gününden itibaren, potansiyel olarak farklı hücre tipleri ortaya çıkabilir ve ortamda yüzer; Bu hücreler ortam değişiklikleri sırasında atılmalıdır12. 28. günde, büyük bir sitoplazma-çekirdek oranına sahip yuvarlak hücreler, PMP'ler olarak adlandırılan süspansiyonda görünecektir (Şekil 2D). Bu hücreler sürekli olarak üretilir ve orta değişiklikler sırasında 3 aya kadar haftalık olarak hasat edilebilir. Her hafta hasat edilen PMP'lerin sayısı değişir ve iPSC çizgisine ve kültürün yaşına bağlıdır; verim genellikle zamanla azalır. iPSC'lerin Matrigel yerine laminin 521 kaplı plakalarda kültürlenmesi şiddetle tavsiye edilir, çünkü iPSC'ler daha önce ve bu çalışmada bildirildiği gibi eski koşullarda tutulduğunda PMP verimi daha yüksektir (Şekil 2E)18.
PMP'ler 10-12 gün boyunca iMG ortamına maruz kaldıktan sonra, hücreler küçük bir sitoplazma ve uzatılmış süreçlerin varlığı ile mikroglia benzeri bir morfoloji kazanırlar (Şekil 3A). Mikroglia kimliğini doğrulamak için, miyeloid belirteç iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (IBA1) ve mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçler pürinerjik reseptör P2RY12 ve transmembran protein 119'a (TMEM119) karşı antikorlarla immünofloresan boyama işlemi gerçekleştirdik(ayrıca Malzeme Tablosuna bakınız). Tipik olarak, hücrelerin% >95'i IBA1'i eksprese eder ve hücrelerin yaklaşık% 90'ı P2RY12 ve TMEM119'u eksprese eder (Şekil 3B).
iMG'lerin fagositik kapasitesini değerlendirmek için, pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş i3LMN türevi insan sinaptozomları kullanıldı. Sinaptozom preparatının kanonik yapısal özellikleri koruduğunu doğrulamak için, presinaptik belirteç, sinaptofizin (SYP) ve postsinaptik belirtecin zenginleştirilmesi, postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD95)19,20'den önce açıklandığı gibi gerçekleştirilen Western blot analizi (Şekil 4) ile doğrulanmıştır (ayrıca bakınız Malzeme Tablosu). ). pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş sinaptozomlar, iMG'ler tarafından yutulduktan sonra ve hücre içi asidik (yani düşük pH) bölmeler içinde lokalize olduklarında floresan haline gelir.
İlk zaman noktasında, kırmızı floresan sinyali minimaldi, çünkü sinaptozomların çoğu henüz fagositonize edilmemişti. 30 dakika sonra, kırmızı bir floresan sinyali tespit edildi ve zamanla daha da arttı. 10 saate kadar, kırmızı floresan sinyali sağlamdı, çünkü sinaptozomların çoğu yutulmuş ve fagositoz işlemi yoluyla asidik hücre içi bölmelere lokalize edilmişti (Şekil 5A). Sitokalasin D, fagositozu bloke etmek için yaygın olarak kullanılan bir aktin polimerizasyon inhibitörüdür. Beklendiği gibi, sitokalasin D-ile tedavi edilen iMG'lerde kırmızı floresan sinyalinde güçlü bir azalma gözlemledik, bu da tespit edilen sinyalin fagositik olaylardan kaynaklandığını gösteriyor. Ayrıca, iMG'lerin, muhtemelen sitochalasin D-ile tedavi edilen iMG'lerde aktin yeniden şekillenme eksikliğinden dolayı, sitokalasin D-ile tedavi edilen iMG'lerde tespit edilmeyen 10 saatlik fagositozdan sonra morfolojide değişiklikler gösterdiğini fark ettik. Mikroglia morfolojisindeki değişiklikler genellikle aktivasyon durumu2 ile ilişkilidir.
Açıklanan otomatik niceleme yöntemini kullanarak, her zaman noktasında kırmızı sinyalin toplam alanını ölçtük ve çekirdekleri sayarak elde edilen hücre sayısına normalleştirdik. Sonuçlar, yutulmuş sinaptozomların alanının, 16 saatte bir platoya ulaşılana kadar zamanla arttığını göstermektedir. Beklendiği gibi, sitokalasin D-ile tedavi edilen hücrelerden gelen kırmızı sinyal alanı, fagositoz inhibe edildiğinden zamanla artmadı (Şekil 5B). Birlikte, bu sonuçlar iMG'lerin beyin hastalığı ile ilgili materyali fagositonize edebildiğini ve fonksiyonel çalışmalar için uygun olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: iPSC'leri mikroglia benzeri hücrelere ayırmak için protokolün şeması. 0. günde, iPSC'ler% 80 akıcılığa ulaştığında, koloniler tek hücrelere ayrılır ve EB oluşumunu indüklemek için EB ortamında kültürlenir. 4. günde, EB'ler PMP üretimini indüklemek için PMP ortamında toplanır ve kaplanır. 28 gün sonra, PMP'ler toplanır ve iMG ortamı kullanılarak iMG'lere terminal olarak farklılaştırılır. PMP'ler 3 aya kadar haftalık olarak toplanabilir. Kısaltmalar: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iMG'ler = mikroglia benzeri hücreler; EB = embriyoid cisim; PMP = ilkel makrofaj öncüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: iPSC'lerden PMP'lere farklılaşma aşamalarında ışık mikroskobu ile değerlendirilen hücre morfolojisi. (A) iPSC'ler iPSC ortamında %80 akıcılığa kadar korunur. (B) EB ortamında 4 günlük farklılaşmadan sonra embriyoid bir cisim. (C) Kaplamalı plakalara bağlı EB'ler ve (D) PMP ortamında 28 günlük kültürden sonra EB'lerden süspansiyonda ortaya çıkan PMP'ler. (E) 1. haftada (28 günlük PMP farklılaşmasından sonra) ve 12. haftada ~48 EB'den toplanan PMP sayısı. Çubuk grafikler, iki farklı iPSC çizgisinden altı bağımsız farklılaşmanın (veri noktası) ortalamasını gösterir. İstatistikler iki yönlü ANOVA ve Šídák'ın çoklu karşılaştırma testi ile elde edildi. Ölçek çubukları = 1.000 μm (A), 400 μm (B-D). Kısaltmalar: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iMG'ler = mikroglia benzeri hücreler; EB = embriyoid cisim; PMP = ilkel makrofaj öncüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bu protokolle farklılaşan iMG'ler, 10 günlük terminal farklılaşmasından sonra iyi niyetli mikroglia özellikleri gösterir. (A) Mikroglia benzeri morfoloji sunan iMG'lerin temsili parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 400 μm. (B) Miyeloid/mikroglia belirteçleri IBA1, P2RY12 ve TMEM119'u eksprese eden iMG'lerin temsili immünofloresan görüntüleri. Ölçek çubukları= 400 μm (A), 50 μm (B). Kısaltmalar: iMG'ler = mikroglia benzeri hücreler; IBA1 = iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1; P2RY12 = pürinerjik reseptör P2RY12; TMEM119 = transmembran proteini 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: i3LMN kaynaklı insan sinaptozomları, batı leke analizi ile sinaptik belirteçleri ifade etti. 28 günlük kültürden sonra i3LMN'den türetilen bir insan sinaptozom preparatının temsili batı lekesi analizi, postsinaptik belirteç, PSD95, presinaptik belirteç, SIP ve β-tübülin ile incelendi. Kısaltmalar: i3LMN = iPSC türevi alt motor nöronlar; PSD95 = postsinaptik yoğunluk proteini 95; SYP = sinaptofisin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş ve canlı hücreli, uzunlamasına görüntüleme ile izlenen insan sinaptozomlarını kullanarak iMG'lerin fagositoz testi . (A) Belirtilen zaman noktalarında sitoD tedavisi olan ve olmayan etiketli insan sinaptozomlarına (kırmızı kanal) maruz kalan nükleer boyamalı (mavi kanal) iMG'lerin temsili parlak alan ve floresan montajları. Montajlar, 20x'te edinilen 16 fayansın satın alma sonrası işlenmesiyle oluşturuldu. Ölçek çubukları = 400 μm. (B) Hücre numarasına normalleştirilmiş sinaptozom floresan sinyalinin alanının miktarı. Veri noktaları, üç teknik çoğaltmanın ortalama ± SEM'ini gösterir. Her eğri, sitoD tedavisi olan ve olmayan bir iPSC hattından iki bağımsız farklılaşmanın (iMG 1 ve 2) niceliğini gösterir. Kısaltmalar: iMG'ler = mikroglia benzeri hücreler; cytoD = cytochalasin D. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 10 cm'lik DIF28 i3LMN tabak sayısı | Toplam protein (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tablo 1: 28 günlük farklılaşmada iPSC kaynaklı düşük motor nöronlardan sinaptozom izolasyonundan sonra toplam protein verimi. Sinaptozomlar ekstrakte edildikten sonra dört bağımsız farklılaşmadan elde edilen toplam protein miktarı. Her farklılaşmada farklı sayıda i3LMN içeren 10 cm'lik tabaklar toplandı. Protein verimi BCA protein testi ile ölçüldü. Kısaltmalar: iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; i3LMN = iPSC türevi alt motor nöronlar; DIF28 = 28 günlük farklılaşma; BCA = biskinkoninik asit.
| Parametre | Değer |
| Kayıt kanalı | Parlak alan, DAPI ve RFP |
| Füzyon yöntemi | Doğrusal karışım |
| Kenarlıklardaki siyah dikdörtgenleri kaldırmak için dikişli görüntüyü kırpın | Kontrol |
| Son Görüntüyü Küçültme | Kontrol |
| Parametre | Değer |
| Eşik | Kullanıcı tarafından belirlenir |
| Arka plan | Koyu |
| Dokunan nesneleri bölme | Kontrol |
| Maskelerdeki delikleri doldurun | Kontrol |
| Min. nesne boyutu | 7 μm |
| nesne boyutu | 30 μm |
| Birincil kenar nesnelerini dahil etme | Kontrol |
| Tüm görüntüyü analiz edin | Kontrol |
| Parametre | Değer |
| Eşik | Kullanıcı tarafından belirlenir |
| Arka plan | Koyu |
| Dokunan nesneleri bölme | Kontrol |
| Maskelerdeki delikleri doldurun | Kontrol |
| Min. nesne boyutu | 5 μm |
| nesne boyutu | 100 μm |
| Birincil kenar nesnelerini dahil etme | Kontrol |
| Tüm görüntüyü analiz edin | Kontrol |
Tablo 2: Görüntüleme elde ve veri analizinde kullanılan parametreler. Fagositoz testi sırasında görüntüleme kazanımı ve elde edilen görüntülerin analizi için göz önünde bulundurulması önerilen parametreler listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan farklılaşma protokolü, iPSC türevli mikroglia benzeri hücreleri ~ 6-8 hafta içinde yüksek saflıkta ve immünofloresan deneyleri ve daha fazla sayıda hücre gerektiren diğer tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli verimde elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu protokol, 1 haftada 1 × 106 iMG'ye kadar verim vermiştir, bu da protein ve RNA ekstraksiyonuna ve karşılık gelen aşağı akış analizlerine (örneğin, RNASeq, qRT-PCR, batı lekesi, kütle spektrometrisi) izin verir. Bununla birlikte, bu protokolün bir sınırlaması, iMG'lerin veriminin belirli uygulamaları kısıtlayabilmesidir. PMP'leri farklı haftalardan biriktirmek ve bir kerede farklılaşma işlemine devam etmek için yeterli progenitör toplanana kadar süspansiyonda homojen bir kültürü korumak için ek modifikasyonlar uygulanabilir18. Alternatif olarak, EB'lerin farklılaşması, PMP'lerin üretimini artırmak için daha yüksek alan hücre kültürü plakaları kullanılarak ölçeklendirilebilir.
Farklılaşma sürecini başlatmak için laminin 521 kaplı plakalarda kültürlenmiş iPSC'lerin kullanılması tavsiye edilir. Diğer kaplama reaktifleri, işlemin ilerleyen aşamalarında üretilen PMP'lerin sayısını azaltabilir18. Benzer şekilde, PMP üretimi sırasında EB yapışması için plakaların kaplanması, EB bağlantısını iyileştirir, böylece kültürün ömrünü uzatır. EB kültürü 4 aya kadar korunmuştur, bu noktada birden fazla EB ayrılır ve ölür. Bununla birlikte, diğer araştırmacılar EB'leri 1 yıla kadar 12 yıla kadar kültürleştirdiklerinibildirmektedir. Ellerimizde, 3 aylık EB kültürlerinden üretilen iMG'ler, genç kültürlerden farklılaşan iMG'lerle benzer fonksiyonel özelliklere sahiptir; 3 aydan eski kültürler fonksiyonel deney için kullanılmamıştır.
Yukarıda açıklanan orijinal protokollerden mikroglia farklılaşmasının son aşamasını optimize etmek için, iMG ortamına 100 ng / mL interlökin (IL)-34,7 5 ng / mL koloni stimülasyon faktörü 1 (M-CSF) 10 ve 50 ng / mL dönüştürücü büyüme faktörü-beta (TGF-β) dahil ettik. IL-34 ve M-CSF, mikroglia kaderini ve sağkalımını korumak için çok önemli olan CSF1 reseptörüne bağımlı yolları uyarır8, TGF-β ise mikroglia homeostazı9'u destekler, böylece PMP'nin mikroglia kaderine bağlılığı için daha fizyolojik bir ortam sağlar. Not olarak, burada açıklanan tüm farklılaşma işlemi, serumun iMG davranışı üzerindeki olası etkilerini ve aşağı akış uygulamalarındaki değişiklikleri önleyen serumsuz koşullarda gerçekleştirilir. iMG'lerle fonksiyonel deneyler için, 10 ila 12 günlük terminal farklılaşması arasında deneyler yapılması önerilir. iMG'ler, hücre canlılığının mütevazı bir şekilde azalmasıyla 14 güne kadar kültürlenmiştir, bu noktadan sonra hücre sağlığı önemli ölçüde tehlikeye girer.
Mikroglia'nın kanonik fonksiyonlarından biri fagositoz olduğundan, in vitro fagositik aktiviteyi araştırmak için bir test bu protokole dahil edilmiştir. İnsan hücresi tabanlı bir sistem geliştirmek için, insan i3LMN'lerinden türetilen sinaptozomlar kullanıldı. Bu çalışmada sinaptoz preparatının kalitesi, sinaptik belirteçlerin western blot analizi ile değerlendirilmiştir. Ek olarak, sinaptozom preparatının diğer yapısal ve fonksiyonel özellikleri, fagositoz testinden önce elektron mikroskobu veya immün boyama ile araştırılabilir. İnsan sinaptozomlarını elde etmek için burada açıklanan protokol, nispeten yüksek sayıda nöron veren i3LMN'lere büyük ölçüde dayanmaktadır. Bununla birlikte, diğer farklılaşma yöntemlerini (yani, küçük moleküllerin kokteyllerini gerektiren protokoller) kullanıldığında nöronal verimler muhtemelen daha düşük olacaktır. Özellikle, fagositoz testi, fare-beyin kaynaklı sinaptozomlar, toplanmış proteinler veya ölü hücreler gibi diğer birçok substratla gerçekleştirilebilir ve bunların hepsi fagositozu benzer şekilde izlemek için pH'a duyarlı boyalarla etiketlenebilir. PH'a duyarlı boyaların kullanılması önerilmektedir, çünkü floresan sinyal esas olarak sinaptozomlar lizozomlarda fagozom işleme ve bozunma sırasında asit bölmeleri içinde lokalize edildiğinde yayılır21. Bu özellik, hücrelerin dışındaki sinaptozomlardan gelen arka plan sinyalini azaltır ve otomatik niceleme yöntemlerinin kullanımını kolaylaştırır. Ek olarak, pH'a duyarlı boyalar, substrat yapışması veya hücre zarına kenetlenmesinin aksine gerçek fagositoz olaylarının tespit edilmesini sağlar.
Burada kuyu başına ~ 35 μg sinaptozom kullanılması önerilmekle birlikte, optimal koşullar iPSC hattına ve deneysel koşullara bağlı olduğundan, insan sinaptozomlarının ve diğer substratların spesifik miktarı optimize edilmelidir. İdeal bir sinaptozom aralığı, fagositoz testinde bir doz-yanıt ile sonuçlanmalıdır. Çok fazla sinaptozom sistemi doyurabilir ve genotip veya tedavi grubunun bir fonksiyonu olarak anlamlı farklılıkların tespit edilmesini zorlaştırır. Çok az malzeme, tahlilde zayıf bir çıkış sinyaline neden olur. Bu nedenle, bir çalışma testi oluşturmak için her bir substratın çoklu konsantrasyonlarının test edilmesi önerilir. Ek olarak, hücre sağlığını korumak için % DMSO'yu güvenli bir aralıkta tutmak önemlidir.
Bu protokolde, fagositoz, hücrelerin yutulma kapasitesi hakkında kinetik bilgi sağladığı için canlı hücre görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak izlenmiştir. Canlı hücre görüntülemeyi destekleyebilen ve sabit sıcaklık, nem ve CO2 konsantrasyonlarını koruyabilen mikroskoplar ve görüntüleme sistemleri de bu analiz için uygundur. Burada açıklanan tüm fagositoz deneyleri% 85 -% 95 nem ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de görüntülendi. Sabit hücrelerin görüntülenmesi veya akış sitometrisi gibi diğer tespit yöntemleri, canlı hücre görüntülemenin mümkün olmadığı veya istenmediği durumlarda, aynı materyalleri ve hücre kültürü protokollerini (iMG'lerin ve etiketli sintozomların üretilmesine kadar ve dahil) kullanarak fagositozu değerlendirmek için de kullanılabilir. Benzer şekilde, ImageJ veya CellProfiler gibi veri analizi için diğer açık kaynaklı yazılımlar da kullanılabilir; ikincisi, burada kullanılan yazılımla karşılaştırılabilir otomatik bir analize izin verecektir.
Özetle, mikroglia benzeri hücreleri insan iPSC'lerinden ayırt etmek için sağlam bir protokolün uygulanması gösterilmiştir, böylece insan mikrogliasının sınırlı kaynağının üstesinden gelinmiştir. Diferansiye mikroglia, nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Dahası, insan gelişimi ve hastalığı bağlamında mikroglia fonksiyonunun ve işlev bozukluğunun incelenmesine daha fazla yardımcı olacak tamamen "insancıllaştırılmış" bir fagositoz testi dahil edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, motor nöron farklılaşması için WTC11 hNIL iPSC hattını sağladığı için Michael Ward'a ve mikroglia farklılaşması için kullanılan KOLF2.1J WT klonu B03 iPSC hattını tedarik ettiği için Jackson Laboratuvarlarına teşekkür eder. Ayrıca, protokollerin uygulanması sırasındaki desteği için Dorothy Schafer'e, canlı hücre görüntüleme sistemine yardımları için Anthony Giampetruzzi ve John Landers'a, revizyonlar sırasındaki teknik katkıları için Hayden Gadd'e ve bu çalışmadaki işbirliği için Jonathan Jung'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, UMASS Chan Tıp Fakültesi'nden Dan ve Diane Riccio Sinirbilim Fonu ve Angel Fund, Inc. tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F.
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
