Summary
Presentert her er en protokoll som bruker Leishmania store promastigoter for å bestemme binding, cytotoksisitet og signalering indusert av poredannende toksiner. Et proof-of-concept med streptolysin O er gitt. Andre toksiner kan også brukes til å utnytte de genetiske mutantene som er tilgjengelige i L. major for å definere nye mekanismer for toksinresistens.
Abstract
Å forstå funksjonen og mekanismen til poredannende toksiner (PFT) er utfordrende fordi celler motstår membranskader forårsaket av PFT. Mens biofysiske tilnærminger bidrar til å forstå poredannelse, er de ofte avhengige av reduksjonistiske tilnærminger som mangler det fulle komplementet av membranlipider og proteiner. Dyrkede humane celler gir et alternativt system, men deres kompleksitet og redundans i reparasjonsmekanismer gjør det vanskelig å identifisere spesifikke mekanismer. I motsetning til dette tilbyr det humane protozopatogenet som er ansvarlig for kutan leishmaniasis, Leishmania major, en optimal balanse mellom kompleksitet og fysiologisk relevans. L. major er genetisk trekkbar og kan dyrkes til høy tetthet in vitro, og enhver innvirkning av forstyrrelser på infeksjon kan måles i etablerte murine modeller. I tillegg syntetiserer L. major lipider som er forskjellige fra deres pattedyrs kolleger, noe som kan endre membrandynamikken. Disse endringene i membrandynamikk kan undersøkes med PFT fra den best karakteriserte toksinfamilien, kolesterolavhengige cytolysiner (CDC). CDCs binder seg til ergosterol i Leishmania-membranen og kan drepe L. store promastigoter, noe som indikerer at L. major er et egnet modellsystem for å bestemme de cellulære og molekylære mekanismene for PFT-funksjon. Dette arbeidet beskriver metoder for testing av PFT-funksjon i L. store promastigoter, inkludert parasittkultur, genetiske verktøy for å vurdere lipidfølsomhet, membranbindingsanalyser og celledødsanalyser. Disse analysene vil muliggjøre rask bruk av L. major som et kraftig modellsystem for å forstå PFT-funksjonen på tvers av en rekke evolusjonært forskjellige organismer og fellestrekk i lipidorganisasjon.
Introduction
Poredannende toksiner (PFT) er den største familien av bakterielle toksiner1, men mekanismene som de perforerer og ødelegger celler er dårlig forstått. Den best studerte familien av poredannende toksiner er kolesterolavhengige cytolysiner (CDC). CDC syntetiseres primært av gram-positive bakterier, inkludert det forårsakende middelet til nekrotiserende fasciitt, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes utskiller CDC streptolysin O (SLO), som binder seg til steroler i plasmamembranen til vertsceller som monomerer, oligomeriserer og setter inn ~ 20-30 nm porer i membranen1. Rollen som lipider spiller i denne prosessen forblir dårlig bestemt.
En tilnærming til å studere lipid-CDC-interaksjoner er bruken av kjemisk definerte liposomer. Mens definerte liposomer gir informasjon om de nødvendige tersklene av lipider for å opprettholde toksinbinding og poredannelse3,4, rekapitulerer de ikke fullt ut cellulære funksjoner. For eksempel mangler rekonstituerte liposomer lipidasymmetrien til pattedyrverter og lipidmodifikasjoner som respons på toksiner5. Et alternativ til liposomer er å bruke pattedyrcellelinjer. Selv om disse cellelinjene er mer fysiologisk relevante, er det en stor grad av redundans i toksinføler- og motstandsmekanismer2. Som en konsekvens forblir reparasjonsveiene som brukes til å motstå CDC-er, dårlig bestemt. Spesielt er Ca2+ tilstrømning den primære aktivatoren for membranreparasjon1. Nedstrøms for Ca2+ tilstrømning er flere veier engasjert, inkludert en ceramidavhengig reparasjon 6,7 og en MEK-avhengig reparasjonsvei6. Disse veiene interagerer med andre proteineffektorer, inkludert det endosomale sorteringskomplekset som kreves for transport (ESCRT)8, og anneksiner 6,9,10. Dissekering av disse veiene i pattedyrceller er utfordrende på grunn av redundansen, noe som forvirrer datatolkning.
En måte å balansere kompleksitet med enkelhet for dissekering av reparasjonsveier er bruken av enklere organismer, som protozopatogener i slekten Leishmania. Leishmania sp. forårsake leishmaniasis hos mennesker og andre dyr. Leishmaniasis varierer fra kutan leishmaniasis (selvbegrensede hudlesjoner) til dødelig visceral leishmaniasis (hepatosplenomegali), avhengig av art og andre faktorer11. Leishmania major, det forårsakende middelet til kutan leishmaniasis, overføres til mennesker via en sandflyvektor og brukes til å forstå Leishmania-funksjon og infeksjon12. I tillegg er Leishmania sp. digenic12. De eksisterer som intracellulære pattedyrmakrofagparasitter kalt amastigoter og som frittsvømmende, flagellerte promastigoter i sandflyet12. L. store promastigoter kan dyrkes i serum-supplerte medier som M199 til høy tetthet13. Promastigoter er også genetisk trekkbare; Mange gen knockouts eksisterer, inkludert de som retter seg mot lipidbiosynteseveier13. Disse knockoutene kan evalueres for vekst og forskjeller i smittsomhet og lesjonsutvikling via infeksjon av Balb/c mus13.
I tillegg til den relative lettheten av Leishmania-kulturen og rekkevidden av lipidbiosyntese knockouts, har parasitten et enklere genom enn pattedyr. Den best karakteriserte arten av Leishmania er L. major, som har mange eksisterende genetiske verktøy, for eksempel mutanter med defekt lipidmetabolisme14. Spesielt er mange reparasjonsproteiner fraværende. L. major har ingen homologer identifisert til dags dato for viktige pattedyrreparasjonsproteiner som annexiner. Dette muliggjør karakterisering av evolusjonært konserverte reparasjonsveier uten kompleksiteten til pattedyrsystemer. Imidlertid har reparasjonsveier ikke blitt karakterisert i Leishmania til dags dato. Samtidig er viktige signalveier involvert i reparasjon, som MEK-banen6, bevart i Leishmania sp.15,16, selv om homologer må valideres. Den mitogenaktiverte proteinkinase (MAPK) -banen er godt studert i L. mexicana, hvor den bidrar til intracellulær overlevelse og termostabilitet i pattedyrceller og styrer metacyklogenese16. I Leishmania sp., 10 av de 15 MAPKs har blitt karakterisert17. LmMAPK9 og LmMAPK13 antas å være mest lik pattedyr ERK1/2 basert på identitet i den konserverte fosforyleringsleppesekvensen. Fosforyleringsleppesekvensen er TEY for både pattedyr ERK1/2 og LmMAPK9 og LmMAPK13. Imidlertid har åtte av Leishmania MAPKs et TDY fosforyleringsmotiv15. Minst to homologer av MEK er identifisert i Leishmania sp., LmxMKK18 og MEKK-relatert kinase (MRK1)19. Dette antyder at innsikt identifisert i Leishmania kan oversettes til pattedyrsystemer. Der de ikke oversetter til pattedyrsystemer, representerer de terapeutiske mål for behandling av leishmaniasis.
For å bruke L. store promastigoter til å studere membranreparasjon og interaksjoner med toksiner, er det nødvendig med middels gjennomstrømningsteknikker. Mens høyoppløselig levende celleavbildning muliggjør visualisering av merkede proteiner og membraner i sanntid, er det lav gjennomstrømning og kan ikke måle cellulær overlevelse. Middels gjennomstrømningsanalyser inkluderer fargestoffopptak målt ved flowcytometri, måling av mitokondriell aktivitet eller frigjøring av cellulære proteiner som laktatdehydrogenase (LDH). I pattedyrceller måler ikke LDH-analyser kvantitativt celledød20. Videre tillater populasjonsbaserte analyser som LDH-frigjøring eller mitokondriell aktivitet ikke robust encellet eller multiparametrisk analyse20. I motsetning til dette muliggjør flowcytometribaserte analyser multiparametrisk enkeltcelleanalyse20. Imidlertid har disse analysene ikke blitt brukt til å forstå toksinbiologi eller responser på toksiner i L. store promastigoter.
I denne studien brukes SLO som et verktøy for å forstå plasmamembranforstyrrelsen av sfingolipid nullmutanten av L. major i to forskjellige buffere - M199-mediet som rutinemessig brukes til å dyrke L. store promastigoter og den enklere Tyrodes buffer. En flowcytometrianalyse med middels gjennomstrømning beskrives og brukes til å generere toksindose-responskurver. Data fra flowcytometrisk analyse modelleres til en logistisk kurve for å bestemme LC50-verdiene. Med denne informasjonen kan en sublytisk dose SLO bestemmes slik at MAPK-antistoffer kan valideres ved bruk av western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle egnede retningslinjer og standard mikrobiologiske, sikkerhets- og cellekulturpraksis ble brukt for bruk og håndtering av RG2-patogenet Leishmania major og rekombinant DNA. Alle eksperimenter med levende L. major ble utført i et biosikkerhetsskap i et BSL-2-sertifisert laboratorium. Arbeidet ble overvåket av Texas Tech University Institutional Biosafety Committee.
MERK: Fra et sikkerhetsperspektiv er levende L. store promastigoter risikogruppe 2 patogener. Håndter bruk av passende inneslutning, forholdsregler og tilsyn fra Institutional Biosafety Committee (IBC). Håndtere giftige stoffer og kjemikalier i samsvar med institusjonelle prosedyrer for giftige stoffer. Hvis rekombinante toksiner brukes, kan IBC-godkjenning og tilsyn være nødvendig for rekombinant DNA-arbeid.
1. Dyrking og tilberedning av L. store promastigoter
- Oppnå, eller lage og validere, L. store genetiske mutanter som tidligere beskrevet ved hjelp av enten homolog rekombinasjon eller CRISPR-baserte metoder13,21. Bruk knockouts supplert med genet lagt tilbake på et plasmid for å sikre spesifisitet av knockout.
- Kultur vill type L. major og spt2- promastigoter ved 27 °C i komplett M199 medium. Dyrk de episomale addbackcellene (spt2-/+SPT2) i komplett M199 pluss 10 μg/ml G418 (se tabell 1 og materialtabell).
MERK: Hele eksperimentoppsettet som involverer eksperimenter med L. store celler må utføres i et BSL2-sertifisert biosikkerhetsskap. - Dyrk promastigotene i komplett M199 medium22 til de når loggfasen (2-8 x 106 celler/ml), som bestemt av L. store vekstkurveanalyser gjort tidligere23. Planlegg 1 x 10 5 celler for hver brønn for cytotoksisitet, pluss 5 x 105 celler for fargekontroll. For western blot, planlegg 2 x 107 celler per brønn.
MERK: Utfør cytotoksisitetsanalyse med to tekniske replikasjoner. - For å verifisere riktig celletetthet, bland en aliquot (10-40 μL) promastigoter med et likt volum fiksativ (3,7% paraformaldehyd i 1x PBS). Legg 10 μL av den faste prøven på hver side av hemacytometeret.
FORSIKTIG: Formaldehyd er et giftig kjemikalie. Håndtere i samsvar med institusjonelle retningslinjer for farlige kjemikalier. - Utfør celletelling ved hjelp av et mikroskop ved 20x forstørrelse. Tell alle cellene i de 25 små rutene i midten av hemacytometeret. Gjenta for rutene på begge sider og gjennomsnitt tellerne.
MERK: Hvis variasjonen mellom tellingene er >10, gjenfortell og gjennomsnitt. Hvis gjennomsnittlig antall er <10 eller >100, endrer du fortynningen og omtellingen, og beregner deretter kulturtettheten ved hjelp av følgende formel:
(Eq 1)
For eksempel, hvis det i gjennomsnitt er 250 Leishmania i 25 kvadrater, er kulturtettheten 5 x 106 celler / ml. - Etter telling, overfør 5 x 106 celler til et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 1,500 x g i 8 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.
- Kast supernatanten med en 10 ml pipette og virvle kort cellepelleten. Tilsett 5 ml 1x PBS i samme rør og vask cellene ved å snu forsiktig 3-6x. Sentrifuge ved 1,500 x g i 8 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.
- Kast supernatanten med en 10 ml pipette og resuspend 5 x 10 6-cellers pellet i 5 ml medium (f.eks. M199 eller 1x Tyrodes buffer) som ble brukt til forsøkene med en 5 ml pipette for å gi en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml.
(Eq 1)2. Cytotoksisitetsanalyse
- Eksperimentell forberedelse
- Rens giftstoffet som tidligere beskrevet24, eller kjøp giften fra en leverandør. Aliquot i engangs aliquots og lagre -80 ° C i opptil 1 år. Unngå flere fryse-tine-sykluser.
- Bestem den hemolytiske aktiviteten for hvert toksin ved hjelp av humane røde blodlegemer (se tabell over materialer)24.
MERK: Hemolytisk aktivitet brukes fordi den kontrollerer for forskjeller i aktivitet på grunn av rensing, mutasjoner, etc. Arten valg av erytrocytter kan endre hemolytisk aktivitet (f.eks intermedilysin krever humane røde blodlegemer). - Planlegg to tekniske replikasjoner for hver tilstand, syv fortynninger for dose-respons-kurven og en ikke-toksinkontroll.
MERK: Med villtype (WT), spt2- og spt2- / + SPT2-promastigoter, kan to behandlinger testes i en V-bunn 96-brønnplate. For eksempel kan følsomhet for medier sammenlignes (figur 1). I stedet for en V-bunnplate kan 1,2 ml mikrotiterrør (se materialtabell) brukes. På grunn av oppkjøpstidene på cytometeret anbefales det ikke å kjøre mer enn en plate om gangen. - Bestem hvilken analysebuffer som skal brukes basert på testforholdene som trengs og formålet med eksperimentet.
MERK: I dette eksemplet sammenlignes to analysebuffere: M199 og Tyrodes buffer supplert med levedyktighetsfargestoffet propidiumjodid (PI). Kolesterol i serum vil forstyrre CDC-aktivitet24. - Beregn mengden toksin som trengs basert på forholdene og antall behandlede genotyper. Sørg for at 50% spesifikk lysis oppstår halvveis ned i fortynningskurven.
MERK: For CDC-er vil en todelt seriell fortynning gi et godt utvalg for senere logistisk modellering. For spt2- promastigoter er 4000 HU/ml SLO anbefalt startfortynning. Hvor inaktive toksiner brukes, kan en masse tilsvarende den høyeste dosen brukes i stedet. - Planlegg et 200 μL sluttvolum per brønn, og legg til et lite volum ekstra (50-100 μL) for å ta hensyn til pipettefeil.
MERK: Med tre genotyper, hver gjort i duplikat, vil det være seks prøver for seriell fortynning. - Bestem den totale mengden toksin som trengs ved hjelp av følgende formel:
(EQ 2)
hvor ActivityMax er den høyeste konsentrasjonen som brukes (HU/ml); TotalFinalVolume er totalvolumet (for seks prøver, 200 x 6 + 100 = 1,300 μL); ActivityStock er aktiviteten til toksinlageret (HU/ml); og VolStockToxin er volumet av toksin lager nødvendig. - Forbered tilstrekkelig analysebuffer som trengs for eksperimentet. Suppler basalmediet med et levedyktighetsfargestoff og eventuelt Ca 2+ eller EGTA som trengs for å kontrollere Ca2+-nivåene. Vortex å blande.
MERK: For hver 10 ml tyrodes buffer, tilsett for eksempel 50 μL 2 mg/ml PI og 200 μL 100 mM CaCl 2, noe som gir endelige konsentrasjoner på henholdsvis 10 μg/ml og2 mM. - Sørg for at levedyktighetsfargen PI ikke er i konflikt med andre sonder som brukes, for eksempel for fluorescerende bindingsanalyser ved bruk av Cy5 eller AlexaFluor647-konjugerte toksiner20,25.
- Planlegg toksinfortynninger for å lage en 2x løsning av toksin. Tilsett analysebuffer til 1,5 ml sentrifugerør og avkjøl på is. Tilsett bare toksinet umiddelbart før du starter analysen.
MERK: I dette eksemplet vil 1,3 ml analysebuffer bli tilsatt for den øverste fortynningen, og 650 μL vil bli tilsatt for serielle fortynninger for å klargjøre 2x toksinoppløsningen.
- Eksperiment
- Reserver 0,5 ml bearbeidede promastigoter fra trinn 1.8 i et separat rør som "Unstained control".
MERK: Denne prøven vil bli brukt til å sette opp gating på flowcytometeret. - Tilsett 2 mg/ml PI til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml til de resterende promastigotene. Vortex for 3 s.
MERK: Etter tilsetning av PI til de behandlede promastigotene, kan disse cellene bare brukes i en tidsperiode på 2,5 timer. Etter 2,5 timer begynner cellene å dø, og resultatene blir feilaktige. - Tilsett 1 x 105 (i 100 μL / brønn) bearbeidede promastigoter til hver brønn på en V-bunn 96-brønnplate eller 1,2 ml mikrotiterrør (figur 1). Plasser platen eller rørstativet på is i ca. 45° vinkel fra visning. Utfør arbeidet i et biosikkerhetsskap ved håndtering av Leishmania promastigotes.
- Legg til 100 μL analysebuffer med PI i hver kontroll uten toksin (siste rad). Kontroller at kontrollen ble riktig lagt til ved å visuelt identifisere rør med et totalt volum på 200 μL som ser mørkere ut i fargen.
- Fjern giftaliquets fra -80 ° C, tine på is og basseng etter behov. Tilsett toksinvolumet beregnet i trinn 2.1.5 til den høyeste fortynningen (fremstilt i trinn 2.1.10). Fortynn deretter toksinet serielt (figur 1). Pipette opp og ned minst 8x for å sikre blanding.
MERK: Utfør på is fordi CDC-er raskt inaktiveres ved romtemperatur. - Fra den laveste toksinkonsentrasjonen tilsettes raskt 100 μL toksin til riktig rad (figur 1 og figur 2) og fortsetter til alt toksinet er tilsatt cellene.
- Forsegl platen med tetningsbånd. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Etter inkubasjonsperioden, pakk og transporter platen til flowcytometeret.
- Reserver 0,5 ml bearbeidede promastigoter fra trinn 1.8 i et separat rør som "Unstained control".
- Datainnsamling
- Sett opp flowcytometeret (se Materialtabell) og anskaffelsesprogramvare i henhold til produsentens instruksjoner og i henhold til anleggspolicyen. Ikke utfør flowcytometriprosedyren uten forutgående opplæring på cytometeret.
MERK: I dette eksemplet ble en 4-laser Attune NxT brukt. PI ble samlet på YL-1-kanalen (begeistret av en 561 nm laser, passert gjennom en 577 LP, reflektert fra 600 DLP og filtrert gjennom 585/16 båndpass), selv om det brede spekteret av PI tillater innsamling på andre kanaler. - Bruk den ufargede L. major promastigote-prøven, sett portene for fremover- og sidespredning og de første fluorescerende parametrene basert på de valgte fargestoffene.
- Ta med én ekstra parameter hvis ønskelig for punktdiagrammer for å kontrollere autofluorescens (f.eks.
MERK: I dette eksemplet ble BL-1-kanalen (opphisset av en 488 nm laser, passert gjennom 495 DLP og 503 LP, reflektert fra 555 DLP og filtrert via 530/30 båndpass) brukt. - Ved hjelp av enkeltfargede kontroller, sett portene for levedyktighetsfargestoffet (PI i denne studien) og eventuelle fluorescerende merkede toksiner. Overvåk fremoverspredning versus tid for mikro-tresko.
MERK: PI vil svakt flekke alle cellene over ufargede kontroller. Døde celler vil være lett separerbare, med forbigående permeabiliserte celler mellom populasjoner. - Få > 10 000 inngjerdede hendelser for hver prøve på cytometeret.
MERK: Det anbefales å lese fra mest sensitiv til minst følsom, men rekkefølgen på anskaffelsen kan reverseres for å bestemme hvilken innvirkning leserekkefølgen har på prøveresultatene. - Lagre dataene og eksporter etter behov for analyse.
- Sett opp flowcytometeret (se Materialtabell) og anskaffelsesprogramvare i henhold til produsentens instruksjoner og i henhold til anleggspolicyen. Ikke utfør flowcytometriprosedyren uten forutgående opplæring på cytometeret.
- Data analyse
Merk: I denne studien Excel med Solver plug-in (se Tabell over materialer) ble brukt til dataanalyse (se Tilleggsfil 1).- Gate totalt, enkeltcelle L. store promastigoter ved gating på forover og side scatter og tid etter behov (figur 3). Bruk høyde eller område som anbefalt for flowcytometeret.
MERK: For flowcytometeret som brukes her, er høyde den anbefalte parameteren i stedet for området. - Identifiser og gate døde celler som "PI høy". Gate mellomliggende celler som "PI lav". PI høye celler er døde celler, mens PI lave celler er forbigående permeabilisert26.
MERK: PI høye celler viser vanligvis et 2-3 loggskift fra negative celler. - Eksportere dataene til Excel. Få tak i prøvenavnet/ID-en og %PI høy for å fastslå drap.
MERK: Hvis fluorescerende toksiner ble brukt, vil median fluorescerende intensitet (MFI) av levende, forbigående permeabiliserte og negative populasjoner være nødvendig. %PI lav kan eksporteres for forbigående permeabilisering. - Bestem gjennomsnittet% PI høy for hver tilstand mellom de to tekniske replikaene.
MERK: Hvis gjennomsnittlig MFI er nødvendig for fluorescerende toksiner, beregne dette også. - Beregn% spesifikk lysis fra% PI høy ved å bruke følgende formel24,25:
(EQ 3)
hvor PIhighxpt er% PI høy for den eksperimentelle tilstanden; og PIhighctl er %PI-høyden for ikke-toksinkontrollen. - Plot %Spesifikk lysis mot toksinkonsentrasjon for dose-respons-kurven (figur 4).
- Organiser dose-responskurven i Excel for logistisk modellering. Inkluder toksinkonsentrasjon og gjennomsnittlig% spesifikk lysis sammen med eksperimentelle detaljer og / eller rå% PI høye beregninger (tabell 2).
- Kontroller at Problemløser-tillegget er aktivert.
Hvis du vil aktivere problemløseren i skrivebordsversjonen av Excel, går du til Alternativer for fil> > tillegg og merker av for Problemløser . Start Excel på nytt. - Merk ytterligere fire kolonner som "modellert", "rester", "parametere" og "parameterverdier". Kontroller at de første kolonnene samsvarer med forsøksparametrene, toksinkonsentrasjonen og %spesifikk lysis (tabell 2).
- Legg til følgende parametere i kolonnen "parametere": L, k, c, SUM og LC50. Initialiser parameterne L, k og c ved å skrive inn følgende verdier i kolonnen "parameterverdier": 100, 0,05, 1 000.
- I kolonnen "modellert" oppretter du logistikkmodellen ved hjelp av følgende formel:
(EQ 4)
Sett L, k og c til cellene som inneholder disse parameterne i kolonnen "parameterverdier".
Sett x til cellen som inneholder toksinkonsentrasjonen.
MERK: For tabell 2, celle G4, er formelen som følger: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5))) - Bruk denne ligningen på alle %Specific Lysis-verdiene unntatt no-toksin-kontrollen.
- I kolonnen "rester" beregner du kvadratet av forskjellen mellom det modellerte tallet og den faktiske spesifikke lysisen ved å bruke følgende ligning:
(Eq. 5)
hvor y er den eksperimentelle% spesifikke lysis; og m er den tilsvarende verdien i kolonnen "modellert" beregnet i trinn 2.4.10-2.4.11. - I kolonnen "parameterverdier" ved siden av "SUM" summerer du alle verdiene i restkolonnen.
- I kolonnen "parameterverdier" ved siden av "LC50" initialiserer du ligningen for å beregne LC50 fra de bestemte verdiene. Dette løser Eq 4 for x når m = 50.
(EQ 6)
For tabell 2 er Excel-formelen som følger: =J5- (LN(J3/(50)-1))/J4 - Åpne problemløseren fra Data-fanen. Velg Angi mål som skal være cellen som inneholder summen av de beregnede restene. Sett den til Min.
- Endre de variable cellene for parameterverdiene L, k og c.
MERK: Problemløseren kan oppføre seg bedre hvis "Gjør ubegrensede variabler ikke-negative" er merket av. - For negative k-verdier endrer du Eq 4 og Eq 6 ved å faktorisere ut −1 fra k for å endre k til positiv. Bruk GRG ikke-lineær løsningsmetode. Klikk Løs.
- Kontroller kurven og at LC50 beregnes automatisk ved hjelp av Eq 6 (tabell 2). Bekreft tilpasningen ved å plotte både %Spesifikk lysis grafisk og modellering mot toksinkonsentrasjon.
MERK: Det kan også kontrolleres ved å beregne R2 for kurven.
- Gate totalt, enkeltcelle L. store promastigoter ved gating på forover og side scatter og tid etter behov (figur 3). Bruk høyde eller område som anbefalt for flowcytometeret.
(EQ 2)
(EQ 3)
(EQ 4)
(Eq. 5)
(EQ 6)3. Proteinanalyse av toksin-utfordrede L. store promastigoter
- Forbered L. store promastigoter som beskrevet i avsnitt 1.
- Resuspend 2 x 107 WT, spt2-, og spt2-/+SPT2 L. major promastigoter i 2 ml av ønsket analysebuffer ved hjelp av en 5 ml pipette (f.eks. serumfri M199). Tilsett toksin i en endelig sublytisk konsentrasjon og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
MERK: For eksempel er en sublytisk dose SLO for spt2- promastigoter 500 HU / ml. - Inkluder andre genotyper og ikke-toksinkontroller.
- Sentrifuger promastigotene ved 1,500 x g i 10 minutter for å pelletere cellene. Kast supernatanten med en 10 ml pipette. Kjør det lukkede røret som inneholder cellepelleten raskt tre ganger over en uregelmessig overflate, for eksempel grillen på biosikkerhetsskapet, for å bryte opp cellepelleten.
MERK: Cellepelleten er nesten usynlig for det blotte øye. - Rekonstituer 1x SDS-PAGE prøvebuffer med 2-merkaptoetanol umiddelbart før bruk og varme til 95 °C i 10 minutter før tilsetning til cellepelleten. Resuspend cellepelleten i varm 1x SDS-PAGE prøvebuffer, og bland godt ved pipettering opp og ned. Varm opp den resuspenderte cellepelleten i 1x prøvebuffer ved 95 °C i 10 minutter.
MERK: Etter oppløsning i prøvebuffer, oppbevar prøvene på lang sikt ved -20 ° C om nødvendig. - Forbered oppløsningsgelen. Degas alle komponentene unntatt ammoniumpersulfat (APS) og TEMED i 15 min.
- Tilsett APS og TEMED umiddelbart før du støper gelen. Legg forsiktig på oppløsningsgelen med vann. La oppløsningsgelen polymerisere, ~ 30-45 min.
- Dekanter vannet og tilbered stablingsgelen. Tilsett stablingsgelen, pass på å unngå bobler. Sett inn en kam med relevant antall brønner, og la polymerisere i 5 minutter. Overvåk polymerisasjon ved hjelp av en hvilken som helst gjenværende stablingsgel.
- Monter gelen for å kjøre SDS-PAGE og legg til reservoarbuffer i kammeret.
- Last inn 10 μL av hver prøve per brønn, eller 8 μL av proteinstigen. Kjør ved 180 V til prøvene kommer inn i oppløsningsgelen, og reduser deretter spenningen til ~ 160 V og kjør til fargestofffronten er ~ 0,5 cm fra kanten av platen.
MERK: Tiden det tar for prøvene å nå bunnen kan variere mellom 1-1,5 timer. Tiden kan forlenges ved å redusere spenningen. Reduser aldri spenningen til null. Høyere spenninger kan øke gel "smilende" og sprekke platene. - Overfør gelen enten til Coomassie-flekk (for proteinfarging) eller til 1x overføringsbuffer (for vestlig blotting). For Coomassie farging, flekker over natten, og deretter destain, image, og tørr.
- For western blot, klargjør overføringssystemet i henhold til produsentens instruksjoner.
- For en våt overføring, bruk kald 1x overføringsbuffer og pre-våtputer, filterpapir og nitrocellulose. For Bio-rad Protean III-systemet (se materialtabell) som brukes her, kan filterpapiret kuttes til 10 cm x 7,5 cm. Skjær nitrocellulosen til 9 cm x 6,75 cm.
MERK: Nitrocellulose er svært brannfarlig. Unngå åpen ild og andre potensielle antennelseskilder. - Legg ut overføringskassetten med pads, filterpapir og nitrocellulose. Rull ut luftbobler. Tilsett gelen forsiktig.
- Tilsett filterpapiret og rull ut luftbobler. Legg puten, lukk kassetten og sett den inn i holderen i riktig retning (sørg for at nitrocellulose vender mot den røde terminalen). Tilsett en rørestang og en ispakke til siden, og topp reservoaret med kald 1x overføringsbuffer. Overfør ved 110 V i 90 min.
MERK: Varmen som genereres under overføringen kan påvirke overføringen negativt. For å sikre en god overføring, bruk alltid kald 1x overføringsbuffer. - Fjern nitrocellulose og flekk med Ponceau-løsning i ~ 5 minutter. Skyll med ultrarent vann. Merk proteinstigen med blyant og trim flekken etter behov. Destain flekken ved hjelp av gjenværende overføringsbuffer.
MERK: Ponceau kan gjenbrukes mange ganger. - Blokker nitrocellulosen i 25 ml 5% BSA i 1x TBST ved 4 °C, med risting, over natten. Kast deretter blokkeringsoppløsningen og legg til primært antistoff (1: 1000) i 1% BSA i 1x TBST. Rist ved 4 °C over natten.
MERK: Det primære antistoffet kan lagres ved −20 °C og gjenbrukes flere ganger. - Vask nitrocellulosen 3x i 10 minutter hver i 1x TBST med risting. Kast vasken og tilsett 10 ml HRP-konjugert sekundært antistoff (1:10 000) i 1 % BSA i 1x TBST. Rist ved romtemperatur i 1 time. Vask nitrocellulosen 3x i 10 minutter hver i 1x TBST med risting.
- Klargjør ECL-reagens umiddelbart før avbildning av nitrocellulosen. Umiddelbart før avbildning, dekanter TBST og tilsett ECL-reagenset til nitrocellulosen. Rist i 1 min. Bilde gelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Økt promastigotfølsomhet for SLO i Tyrodes buffer sammenlignet med M199
SLO-følsomheten til L. major promastigoter ble sammenlignet mellom forskjellige analysebuffere. Wild-type, spt2- og spt2-/+SPT2-promastigoter ble utfordret med SLO i serumfri M199 eller Tyrodes buffer supplert med 2 mM CaCl2 i 30 minutter før analyse på et flowcytometer. Egnede parasitter for analyse var enkeltceller identifisert ved frem-/sidespredningsprofiler (figur 3A,B). Data ble samlet inn ved hjelp av kanalene BL1 (488 eksitasjon, 530/30 utslippsfilter) som en autofluorescenskontroll og YL1 (561 nm eksitasjon, 585/16 utslippsfilter) for PI. BL1 ble brukt til å identifisere potensielle autofluorescens- eller kompensasjonsproblemer (x-aksen i figur 3C-E). Bruken av 561 nm-linjen reduserte gjennomblødning fra PI til BL1-kanalen. Fraksjonen av døde celler ble bestemt for hver tilstand, og% spesifikk lysis ble bestemt. Wildtype og spt2-/+SPT2 promastigoter var resistente mot SLO i serumfri M199, men hadde mindre (<20%) spesifikk lyse i Tyrodes buffer (figur 4A). De sfingolipidfattige spt2-promastigotene var følsomme for SLO i både serumfri M199 og Tyrodes buffer (figur 4). For å kvantifisere økningen i følsomhet fra Tyrodes buffer sammenlignet med serumfri M199, var dose-responskurven tilpasset en logistisk modell, og LC50 ble beregnet for hver tilstand (figur 4B). Spt2-promastigotene var omtrent åtte ganger mer følsomme for SLO i Tyrodes buffer enn i M199 (figur 4B). Disse dataene viser at toksinfølsomheten kan variere basert på bufferen som brukes. Kurvetilpasning gjør det mulig å sammenligne endringer i hele dose-responskurven. Dermed muliggjør flowcytometri en middels gjennomstrømningsanalyse for å sammenligne toksinfølsomheten til L. major promastigoter under forskjellige forhold.
MEK-veiaktivering i L. major uavhengig av toksinutfordring
Enkeltcelledataene om cellulær overlevelse fra cytotoksisitetsanalysen muliggjør nedstrømsanalyser ved sublytiske toksindoser. For eksempel kan L. major analyseres for biokjemiske veier ved vestlig blotting etter toksinutfordring. MEK-banen aktiveres under membranreparasjon i pattedyrceller6. Det er ukjent om denne banen aktiveres etter SLO-utfordring i L. major eller om de kommersielt tilgjengelige antistoffene gjenkjenner noen L. major MAPK-homologer. WT-, spt2- og spt2-/+SPT2-promastigoter ble utfordret med en sublytisk (500 HU/ml) dose SLO og analysert ved western blotting. Et ~120 kDa-bånd ble observert for fosfo-MEK i L. major promastigotes (figur 5). For total MEK ble det observert bånd på ~120 kDa og ~55 kDa (figur 5), som samsvarer med størrelsene MRK1 og LmxMKK. Fosfo-ERK påviste lignende bånd, mens ERK-antistofffargingen ikke var robust i denne analysen (figur 5). Lipofosfoglykan (LPG) og tubulin ble også blottet som lastekontroller. Disse dataene avslører viktigheten av å validere antistoffer for bruk i L. major.
Figur 1: 96-brønnsplater muliggjør et bestilt oppsett for cytotoksisitetsanalyser. Cytotoksisitetsanalysen er delt inn i seks kolonner med to tekniske replikasjoner hver. Med kontroller tillater dette at to forhold kan testes per plate. I dette eksemplet sammenlignes L.major promastigoter resuspendert i serumfri M199 med de i Tyrodes buffer. Genotypene følger rekkefølgen av villtype (WT) (grønn), spt2- (rød) og spt2-/+SPT2 (blå). Toksinet (SLO) tilsettes slik at konsentrasjonen går fra den høyeste konsentrasjonen øverst på platen til bunnen, og etterlater den siste raden som en ikke-toksinkontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Konsekvent oppsett muliggjør reproduserbare cytotoksisitetsresultater. Etter beregning av mengden toksin som trengs, fremstilles volumet av analysebuffer som er nødvendig for en 2x-løsning. Levedyktighetsfargestoffet (PI) og CaCl2 tilsettes etter behov og bufferen dispenseres i 1,5 ml rør. Etter vask og resuspendering i analysebuffer, dispenseres like mange L. store promastigoter i hver brønn på 96-brønnsplaten. Toksinet tilsettes analysebufferen og fortynnes serielt fra høyeste toksindose (1. tube) ned til laveste dose (7. tube) rett før tilsetning til cellene. Toksinet tilsettes celler i 96-brønnsplaten som begynner fra bunnen av platen ved laveste toksindose (7. rad) og arbeider opp til høyeste dose (1. rad). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gating-strategien skiller levende og døde populasjoner av celler. L. store promastigoter farget med PI og utfordret med SLO ble analysert ved flowcytometri. (A,B) Gating-strategien identifiserer enkeltceller fra total L. major basert på fremover- og sidespredning. (CE) PI-farging blir deretter vurdert, og celler er inngjerdet i PI høy, PI lav og PI negative populasjoner. Representative data for (C) ingen toksin, (D) 1 000 HU/ml og (E) 4 000 HU/ml SLO vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tyrodes buffer øker følsomheten til L. major promastigoter sammenlignet med M199. Wildtype (WT), spt2- og spt2-/+SPT2 L. store promastigoter i serumfri M199 eller Tyrodes buffer supplert med 2 mM CaCl2 ble utfordret med SLO ved de angitte konsentrasjonene ved 37 °C i 30 minutter, og PI-opptak ble analysert ved flowcytometri. Den %spesifikke lysis ble beregnet. En logistisk modell ble konstruert og LC50 beregnet for spt2- mutantene. Grafer viser (A) gjennomsnittlig ± SEM eller (B) individuelle eksperimenter fra tre uavhengige eksperimenter. En students uparret t-test med Welchs korreksjon ble brukt for LC50-verdiene. ** p < 0,01 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fosfo-ERK og fosfo-MEK1/2 påviser L. hovedproteiner uavhengig av sfingolipider eller toksinutfordring. Wildtype (WT), spt2- og spt2-/+SPT2 L. store promastigoter ble utfordret i 30 minutter ved 37 °C med eller uten 500 HU/ml SLO i serumfri M199 supplert med 2 mM CaCl2. Cellelysatene ble løst ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og undersøkt for fosfo-MEK (pMEK), total MEK, fosfo-ERK (pERK), total ERK, lipofosfoglykan (LPG) eller tubulin, etterfulgt av HRP-konjugerte sekundære antistoffer og ECL. En representativ flekk fra to uavhengige eksperimenter er vist i hvert tilfelle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Buffer og mediesammensetninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Eksempeloppsett for Excel-beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Excel-regneark med formler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble metoder for å studere molekylære mekanismer og funksjoner av PFT beskrevet, ved hjelp av det humane patogenet Leishmania major som et modellsystem. En medium-gjennomstrømningscytometribasert cytotoksisitetsanalyse for å måle encellet levedyktighet ble utviklet. Levedyktigheten er kvantitativ på populasjonsnivå fordi LC50-verdier kan beregnes ut fra dose-respons-kurven ved hjelp av logistisk modellering. Som et prinsippbevis ble en flowcytometrisk analyse brukt for å illustrere at valg av medier kan endre villtype og sfingolipid-mangelfull L.major-følsomhet for SLO og for å bestemme den sublytiske toksindosen i hvert medium. Som et prinsippbevis i nedstrømsanalyser ble fosfo-MAPK og fosfo-ERK-antistoffer testet i L. store promastigoter under toksinutfordring. Samlet sett er L. store promastigoter et patogent relevant og genetisk trekkbart modellsystem som kan brukes til å bedre forstå mekanismene og funksjonene til toksinmediert skade på celler.
Flowcytometrianalysen gir høy fleksibilitet. Andre levedyktighetsfarger kan erstattes av PI hvis ønskelig. I pattedyrceller ble det ikke observert forskjeller i rapporteringsevnen for en rekke levedyktighetsfarger20. Valget av toksin, L. major genotype, tillegg av eventuelle behandlinger, og valg av analyse buffer kan varieres etter behov. Toksinbinding kan vurderes enten parallelt med eller i stedet for cytotoksisitet hvis toksinet som brukes er konjugert til en fluorofor, slik som Cy5. For L. store genotyper er det viktig å inkludere komplementerte stammer for å sikre at fenotypen skyldes genet som er slått ut. I denne proof-of-concept-studien ga basismediet som ble brukt til dyrking av L. major, M199, mer beskyttelse til L. store promastigoter enn Tyrodes buffer. Tyrodes buffer økte følsomheten til spt2-mutanten til L. major promastigoter sammenlignet med bruken av serumfri M199, et basalmedium som brukes til å forplante L. major promastigotes in vitro. Dette antyder at det er en eller flere cytoprotektive komponenter i M199. To potensielle cytoprotektive midler er glycin eller alanin, som er cytoprotektive i andre pattedyrsystemer27,28. Samlet sett gir flowcytometri cytotoksisitetsanalysen en fleksibel plattform for å analysere forskjellige toksiner, tilstander og parasittgenotyper.
Koblingen av flowcytometrisk analyse med logistisk modellering gir forbedret informasjon om cellefølsomhet for PFT. Først ble hemolytiske enheter brukt i stedet for masse for aktive toksiner. Dette tillot normalisering av dataene på tvers av forskjellige toksinpreparater og konsistente analyseresultater og muliggjorde en direkte sammenligning av drap mellom toksiner og mål. Mens spesifikk lysis ble brukt til å analysere toksinets bidrag til dødelighet, gir kontrollene som trengs for hver tilstand informasjon om baseline drap. Hvis et middel er spesielt giftig, vil det vises i disse kontrollene. Spesifikk lysis over flere konsentrasjoner gjør det mulig å skape en dose-respons-kurve. Dose-responskurver er avgjørende for å tolke toksinaktivitet. I mange tilfeller vil laboratorier rapportere forskjeller i toksinfølsomhet ved en enkelt konsentrasjon. Avhengig av hvilken del av dose-responskurven som er valgt, kan denne forskjellen forvrenges for å gi ethvert inntrykk av ønsket følsomhet eller motstand. Analyse av hele dose-responskurvene kan gjøres gjennom logistisk modellering. Logistisk modellering er enkel ved hjelp av lett tilgjengelig programvare og gir ytterligere informasjon om LC50, kurvens bratthet (k) og maksimal lysis (L). Forskjeller i alle disse parametrene kan brukes til å bestemme statistisk signifikans mellom kurvene. Endringer i maksimal lyse kan være nyttig for delvis aktive toksiner, inaktive toksiner eller resistente celletyper. Samlet sett ble kvantitative metoder for å måle endringer i cytotoksisitet gitt.
Til tross for fordelene ved å bruke en kvantitativ, medium-gjennomstrømningscytometrisk cytotoksisitetsanalyse, er det forbehold å vurdere når du bruker denne analysen. Spesielt begrenser mangelen på serum inkubasjonstider til 1-2 timer. På senere tidspunkter kompliserer høyere bakgrunnsdød tolkningen av resultatene. Fjerning av serum er nødvendig for CDC fordi kolesterolet i serumet hemmer CDCs24. Andre serumfaktorer kan også endre cellefølsomheten for toksiner. En annen utfordring er konsentrasjonen av kalsium som brukes i analysen. Mens membranreparasjonsanalyser vanligvis bruker 2 mM Ca 2+ for å etterligne ekstracellulær Ca2+, kan høykalsiumbuffere risikere kalsiumavsetning i flowcytometeret, noe som kan forårsake celleklumping og/eller tette mikrofluidikkene. Rengjøring av cytometeret med 2 mM EDTA før rengjøring med Hellmanex III (se materialtabell) og/eller blekemiddel reduserer Ca2+ oppbygging. En siste advarsel er til den logistiske modelleringen. Problemløser-plugin-modulen vil til tider bli "sittende fast" i en lokal minimumsverdi som ikke gir en optimal passform. I slike tilfeller kan manuell endring av parameterne og kjøre problemløseren forbedre modellen. Når den fullstendige logistiske kurven ikke er angitt, kan problemløseren også ekstrapolere store verdier for L. Det er viktig å samle nok datapunkter for å generere en komplett logistisk kurve. Hvis dose-responskurven ikke lett kan modelleres med en logistisk kurve, kan LC 50-verdiene forbli udefinerte (f.eks. >4000 HU/ml), eller en annen kurve kan passe til dataene.
Når den sublytiske dosen av SLO ble bestemt, kunne cellulære responser på SLO testes. Et prinsippbevis ble gitt ved å teste antistoffer i MEK-ERK-banen i L. major fordi MEK-aktiveringskontroller ~ 70% av reparasjon mot SLO i pattedyrceller6. Fosfo-MEK-antistoffet påviste et ~120 kDa-bånd som er forenlig med MRK1. Robust fosforylering av LmxMKK-homologen, forventet ved 55 kDa, ble ikke påvist. MEK-antistoffet påviste imidlertid bånd som var konsistente med både MRK1 og LmxMKK. Fosfo-ERK-antistoffet påviste også bånd ved ~120 kDa og 55 kDa. 55 kDa-båndet er i samsvar med størrelsen på MAPK5. ERK-antistoffet var ikke robust i denne analysen. Massespektrometri eller andre metoder vil være nødvendig for å bekrefte identiteten til disse proteinene. Fosforyleringen av leishmaniale homologer av MEK1/2 og ERK1/2 ble påvist uavhengig av toksinutfordringen. Totalt ble en sublytisk dose toksin bestemt ved flowcytometri brukt til å påvise kinaser i en nedstrømsanalyse, som western blotting.
Det finnes også forbehold med western blot-analysene. Spesielt er de fleste kommersielle antistoffer ikke hevet spesielt mot leishmaniale proteiner. I stedet må antistoffer rettet mot homologer i andre organismer valideres og titreres først. Prøvepreparering kan ha innvirkning på det endelige flekkresultatet. Reduksjonsmiddelet i prøvebufferen, 2-merkaptoetanol, må tilsettes umiddelbart før tilsetning av SDS-prøvebufferen til cellepelleten. Mens resuspenderte cellepellets kan lagres ved -20 ° C, overlever de ikke mange fryse / tine sykluser. Primære antistoffer som retter seg mot homologe proteiner som MAPK i Leishmania , må inkuberes med flekkene over natten for bånd av høyere kvalitet på vestlige flekker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy And Infectious Diseases fra National Institutes of Health grant R21AI156225 til PAK og KZ (co-I) og R01AI139198 til KZ (co-I). CH ønsker å anerkjenne Institutt for biovitenskap for undervisningsassistentskapet som tilbys i løpet av denne studien.
Virkemiddelapparatet hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyse eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet; heller ikke i beslutningen om å publisere resultatene. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis finansieringsorganenes offisielle synspunkter. Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmer av Keyel- og Zhang-laboratoriene for deres kritiske gjennomgang av manuskriptet. Forfatterne takker College of Arts and Sciences Microscopy for bruk av fasiliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G.
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
