Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות רקמת השומן החום לאחר ארוחה בבני אדם ובחיות מעבדה.
Abstract
מדידת פעילות רקמת שומן חום (BAT) על ידי טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים (PET-CT) באמצעות הצטברות של 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) לאחר ארוחה או בחולים שמנים או סוכרתיים נכשלת כשיטת הבחירה. הסיבה העיקרית היא כי 18F-FDG מתחרה עם ריכוז פלזמה גלוקוז גבוה לאחר הלידה עבור אותו מוביל גלוקוז על הממברנה של תאי BAT. בנוסף, BAT משתמש בחומצות שומן כמקור אנרגיה גם כן, אשר אינו נראה עם PET-CT ויכול להשתנות יחד עם ריכוז גלוקוז בחולים שמנים וסוכרתיים. לכן, כדי להעריך את החשיבות הפיזיולוגית של BAT בבעלי חיים ובבני אדם, מיושמת שיטת תרמוגרפיה אינפרא אדומה חדשה המשמשת בפרסומים האחרונים.
לאחר צום לילה, פעילות BAT נמדדה על ידי תרמוגרפיה אינפרא אדומה לפני ואחרי ארוחה במתנדבים אנושיים ובנקבות עכברי בר. תוכנת המצלמה מחשבת את טמפרטורת האובייקט באמצעות מרחק מהאובייקט, פליטות העור, טמפרטורת החדר המוחזרת, טמפרטורת האוויר והלחות היחסית. בעכברים, האזור המגולח מעל ה-BAT היה אזור עניין שעבורו נמדדו טמפרטורות ממוצעות ומקסימליות. שלב מחזור הייחום בנקבות עכברים נקבע לאחר ניסוי על ידי מריחות נרתיקיות מוכתמות בתמיסת כתמים סגולה קרזילית (0.1%). במתנדבים בריאים נבחרו שני אזורי עור בצוואר: האזור הסופרקלאביקולרי (מעל עצם הבריח, שם נמצאים תאי BAT) והאזור הבין-קלאביקולרי (בין עצמות הבריח, שם לא זוהתה רקמת BAT). פעילות BAT נקבעת על ידי החיסור של שני ערכים אלה. כמו כן, ניתן לקבוע את הטמפרטורה הממוצעת והמקסימלית של אזורי העור בבעלי חיים ובמשתתפים אנושיים.
שינויים בפעילות ה-BAT לאחר ארוחה שנמדדה על ידי תרמוגרפיה אינפרא-אדומה, שיטה לא פולשנית ורגישה יותר, הוכחו כמין, גיל ושלב במחזור הייחום התלוי בחיות מעבדה. כחלק מהתרמוגנזה הנגרמת על ידי דיאטה, הפעלת BAT בבני אדם הוכחה גם כתלויה במין, גיל ומדד מסת הגוף. קביעה נוספת של השינויים הפתופיזיולוגיים בפעילות BAT לאחר ארוחה תהיה בעלת חשיבות רבה למשתתפים עם ריכוזי פלזמה גבוהים של גלוקוז (השמנת יתר וסוכרת מסוג 2), כמו גם בחיות מעבדה שונות (עכברי נוק-אאוט). שיטה זו היא גם כלי משתנה לקביעת תרופות מפעילות אפשריות שיכולות להצעיר את פעילות BAT.
Introduction
רקמת שומן חומה (BAT), בניגוד לרקמת שומן לבנה (WAT), אינה אוגרת אלא מוציאה אנרגיה. לאחר גירוי סימפתטי, BAT מנצל חומצות שומן וגלוקוז ומייצר חום על ידי הפעלת חלבון uncoupling 1 (UCP1). התפקיד של UCP1 הוא להשתמש בשיפוע H+ בין שני קרומים מיטוכונדריאליים כדי לייצר חום במקום ATP. תפקידו של BAT הוא להגדיל את ייצור החום בתנאי קור, מה שמוביל לעלייה בהוצאות האנרגיה1. לאחר חשיפה לקור, קלט חושי מהעור מעכב נוירונים רגישים לחום בגרעין הפרה-אופטי החציוני (MnPO) של האזור הפרה-אופטי ההיפותלאמי (POA), מה שמקטין את ההשפעה המעכבת של נוירוני POA על רוסטרל רפה פלידוס (rRPa). ההפעלה של נוירוני rRPa מגבירה את הפעילות הסימפתטית, ואחריה עלייה בפעילות BAT 2,3. הפעלת BAT הנגרמת על ידי קור משפרת את הרגישות לאינסולין בבני אדם4, ופעילות זו מופחתת בבני אדם עם עלייה במדד מסת הגוף (BMI) ובגיל 1,5,6,7.
מלבד תפקידו בתרמוגנזה הנגרמת על ידי קור, לאחר ארוחה, ספיגת גלוקוז ב- BAT עולה באוכלוסיית הגברים הרזים, ותורמת לתרמוגנזה הנגרמת על ידי דיאטה (DIT), שהיא גבוהה יותר בקרב נבדקים זכרים חיוביים ל- BAT 8,9. הטכניקה החדישה ביותר המשמשת למדידת פעילות BAT היא טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים, המכונה PET-CT. שיטה זו קובעת את פעילות BAT על ידי מדידת הצטברות של radiotracer fluorodeoxyglucose (18F-FDG). עם זאת, PET-CT נכשל כשיטת הבחירה לגילוי ההפעלה של BAT לאחר ארוחה. אחת הסיבות לכך היא שלאחר ארוחה, 18F-FDG מתחרה עם היפרגליקמיה לאחר הארוחה עבור אותו מוביל גלוקוז, מה שהופך אותו ללא מתאים לקביעת הפעלת BAT לאחר ארוחה, במיוחד כאשר משווים פעילות BAT בקרב משתתפים בריאים וסוכרתיים עם הבדלים אפשריים בריכוזי הגלוקוז בדם. יתר על כן, BAT משתמש בחומצות שומן כמקור אנרגיה לייצור חום שאינו נראה לעין עם PET-CT. 18 הצטברות F-FDG ב- BAT לאחר ארוחה בקושי נראיתלעין 10 ולכן מתפרשת כתוצאה שלילית ברוב המקרים. באופן לא מפתיע, לאחרונה הוצע כי הפעלת BAT בולטת יותר באוכלוסייה האנושית ממה שחשבנו בעבר; לכן, יש צורך בגישה חדשה לזיהוי פעילות BAT ומעורבותה בהפרעות מטבוליות7. ניסיון לפתור בעיה זו הוא למדוד את נפח ה- BAT באמצעות דימות תהודה מגנטית (MRI) בחולים טרום סוכרתיים ובחולים עם סוכרת מסוג 2 (T2DM) עם עמידות לאינסולין11. עם זאת, נפח BAT שנמדד על ידי MRI אינו אינדיקטור מספיק להערכת התפקוד היומיומי והשימוש בגלוקוז ובחומצות שומן על ידי BAT. לכן, כדי להעריך הבדלים אמיתיים בפעילות BAT בחולי סוכרת סוג 2 בריאים לעומת חולי סוכרת סוג 2, יש צורך בגישה חדשה המציעה אפשרות לגלות את המנגנון הפתולוגי של תקלה ב- BAT בחולי סוכרת סוג 2.
כדי לקבוע את ההפעלה של BAT, ביצענו מדידות של ייצור חום BAT לפני ואחרי ארוחה באמצעות תרמוגרפיה אינפרא-אדומה (IR) (איור 1)12,13. לביסוס תרמוגרפיית IR כשיטת בחירה למדידת פעילות BAT לאחר ארוחה אצל אנשים בריאים ושמנים או חולים עם סוכרת תהיה השפעה עצומה על התחום. עד היום, תרמוגרפיה IR משמש לקביעת הפעלה הנגרמת על ידי קור של BAT13,14,15. בהיסטוריה האנושית הקרובה, פעילות ה-BAT הנגרמת על ידי קור כבר אינה בולטת במיוחד (עקב חימום נכון של בתי גידול, ביגוד מתאים), בעוד שהפעלת BAT לאחר ארוחה מתרחשת מדי יום. יתר על כן, הוויסות הפיזיולוגי של שני תפקודי BAT אלה באמצעות ההיפותלמוס שונה לחלוטין. לאחר ארוחה, הפעלת תאי עצב המבטאים פרופיומלנוקורטין (POMC) בגרעין ארקואט ההיפותלמוס (Arc) מובילה לעלייה בפעילות העצבים הסימפתטיים באמצעות rRPa16. הפעלה קרה של BAT הנמדדת על ידי תרמוגרפיית IR או PET-CT אינה תקינה כאשר משתמשים בה כמדד לפעילות BAT יומיומית. פעילות מוגברת של BAT לאחר ארוחה מלווה בניצול גלוקוז, אשר בסופו של דבר חשוב לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז, רגישות לאינסולין וויסות יומי של ריכוז גלוקוז. הפעלת BAT לאחר הלידה מובילה לעלייה בצריכת הגלוקוז לאחר הארוחה, ואחריה עלייה בייצור החום ובטמפרטורת הגוף (DIT). זה הוכח כתלוי מין, גיל ו-BMI12. הבדלים מגדריים דומים בהפעלת BAT לאחר ארוחה נצפים בעכברי מעבדה זכרים ונקבות17. ממצאים אלה תואמים הבדלים מגדריים שהתגלו לאחרונה בוויסות של BAT על ידי Burke et al., שהראו כי הוויסות ההיפותלאמי של השחמת BAT באמצעות תת-אוכלוסייה של נוירוני POMC שונה בעכברים זכרים ונקבות18. ההפעלה שלאחר הלידה של BAT קטנה יותר אצל נשים, אוכלוסיות מבוגרות ואנשים שמנים. חוסר הפעלת BAT לאחר ארוחה (ירידה בניצול גלוקוז) עלול להוביל לשכיחות גבוהה יותר של סובלנות גלוקוז לקויה אצל נשים 19,20,21,22. למרבה הצער, רוב המחקרים על הפעלת BAT נעשו רק על גברים. על ידי הפעלת BAT לאחר ארוחה, ספיגת גלוקוז עולה באוכלוסיית הגברים הרזים. אין זה מפתיע שלאחר הפעלת BAT, DIT גבוה יותר בקרב גברים חיוביים ל-BAT 8,9. יתר על כן, השתלת BAT בעכברים זכרים משפרת את הסבילות לגלוקוז, מגבירה את הרגישות לאינסולין ומפחיתה את משקל הגוף ואת מסת השומן23.
PET-CT נכשל כשיטת בחירה למדידת פעילות BAT, במיוחד לאחר ארוחה. לכן פותחה שיטה לא פולשנית ורגישה יותר. תרמוגרפיה IR מאפשרת להעריך את פעילות ה-BAT בחיות מעבדה שונות (עכברי נוק-אאוט), כמו גם במשתתפים אנושיים, ללא קשר למין, גיל או השפעות של תנאים פתולוגיים שונים על פעילות BAT. יתרון נוסף של שיטה זו הוא הפשטות עבור המשתתפים וחיות המעבדה, המאפשרת לנו להעריך את היתרונות הפוטנציאליים של טיפול מאיץ BAT. המחקרים האחרונים המשתמשים בתרמוגרפיה IR לקביעת ההתנהגות הפיזיולוגית של BAT לאחר חשיפה לקור או ארוחה מתוארים בפרסום האחרון של Brasil et al.24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי בחיות מעבדה אושרו על ידי ועדת האתיקה הלאומית ומשרד החקלאות (EP 185/2018). הניסויים נערכו בהתאם לקודקס האתי של האגודה הקרואטית למדעי חיות מעבדה והנחיות ARRIVE . כל ההליכים שבוצעו במחקרים שכללו משתתפים אנושיים היו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת זאגרב, בית הספר לרפואה (UP/I-322-01/18-01/56). במחקר זה אנו מציגים את התוצאות של שלוש משתתפות (BMI: 29 ק"ג/מ"ר 2 ± 5 ק"ג/מ"ר2). התקבלה הסכמה מדעת מכל המתנדבים האנושיים להשתתפותם במחקר ולהצגת הנתונים.
1. מדידת ההפעלה של רקמת שומן חומה לאחר ארוחה בבני אדם
הערה: בצע את הניסויים במהלך הקיץ כאשר הטמפרטורה היומית אינה מתחת 22 °C (75 °F) כדי לשמור על פעילות BAT בסיסית נמוכה ככל האפשר.
- בחר בקפידה את המשתתפים הבריאים בבקרה (אם יש להעריך את פעילות ה- BAT בתנאים פתולוגיים) מכיוון שפעילות BAT היא מין, גיל, BMI ואפילו השלב של מחזור הייחום התלוי בו.
- כדי להעריך את שלב המחזור החודשי של המשתתפות, שאל אותן שאלות על אורך המחזור החודשי הממוצע שלהן ועל תאריך היום הראשון של הווסת האחרונה שלהן. אל תשכחו לציין את תאריך הניסויים.
הערה: בחירה נכונה של נבדקי ביקורת תואמים היא החלק הקשה ביותר במחקרים קליניים מכיוון שקבוצת ביקורת בריאה ומשתתפים עם מצבים פתולוגיים צריכים להיות דומים ככל האפשר ושונים רק במחלה הנחקרת.
- כדי להעריך את שלב המחזור החודשי של המשתתפות, שאל אותן שאלות על אורך המחזור החודשי הממוצע שלהן ועל תאריך היום הראשון של הווסת האחרונה שלהן. אל תשכחו לציין את תאריך הניסויים.
- בקשו מהמשתתפים לנוח היטב, לא לאכול ארוחת בוקר (צום - ללא צריכת קלוריות), להתכנס בשעות הבוקר לניסויים, ולנוח לפחות 30 דקות כדי למנוע הפעלה אפשרית של BAT במהלך פעילות שרירים באמצעות הפעלה סימפתטית.
- בקשו מהמשתתפים להסיר את בגדיהם העליונים 15 דקות לפני המדידות כדי למנוע את ההשפעות האפשריות של חימום פני העור (השפעות תרמיות של בגדים) תוך קביעת פעילות ה- BAT הבסיסית. בצע מדידות בטמפרטורת החדר המתאימה (22-27 מעלות צלזיוס).
- בצע מדידות אינפרא אדום.
- בזמן שהמשתתפים נחים, הרכיבו את המצלמה התרמית (סוג גלאי: מיקרובולומטר לא מקורר; גובה הגלאי: 17 מיקרומטר; טווח ספקטרלי של המצלמה: 7.5-14.0 מיקרומטר; רגישות תרמית: 20 mK ב-30°C; עדשות: 36 מ"מ; רזולוציה: 1024 פיקסלים x 768 פיקסלים; שדה ראייה מיידי [IFOV]: 0.47 mRad) על החצובה ומקמו אותה במרחק של 1 מ' מהמקום שבו ישב המשתתף.
הערה: אם המדידות מבוצעות במזג אוויר קר יותר (טמפרטורות אוויר חיצוניות מתחת ל-15°C בלחות של 50%), הניחו את המצלמה בטמפרטורת החדר והפעילו אותה למשך שעה לפחות לפני ביצוע המדידות. מכשירים קרים יכולים לתת תוצאות שונות לאחר התחממות לטמפרטורת החדר עקב כיול אוטומטי. - חבר את המצלמה התרמית למחשב ולתוכנה בהתאם להוראות היצרן. רשום רדיד אלומיניום (רדיד אלומיניום מקומט ואז מתוח) במרחק מוקד של 1 מ 'כדי לקבוע את הטמפרטורה המשתקפת של החדר, המוצגת כטמפרטורה נמדדת. בתוכנת המצלמה, הזן מרחק של 0 מ 'ופליטות של 1.
הערה: הטמפרטורה הנראית המשתקפת היא פרמטר המתקבל כאשר הפליטות של המצלמה מוגדרת ל -1.0 והמרחק ל -0 מ 'והמדידות נלקחות על רדיד אלומיניום מקומט ואז מתוח. הטמפרטורה הנראית לעין המוחזרת מייצגת קירוב של סך הקרינה האינפרא אדומה על הגלאי מהסביבה. - רגע לפני תחילת המדידות, לקבוע את טמפרטורת האוויר בחדר ואת לחות האוויר (הכרחי לניתוח מאוחר יותר). במקום לצלם תמונה תרמית אחת, הקלט סרט. מתוך הסרט, מאוחר יותר לבחור את מסגרת התמונה הטובה ביותר האפשרית לניתוח כדי להפחית את האפשרות לאבד נתונים יקרי ערך.
- לפני תחילת ההקלטה, הגדר את הפרמטרים הבאים: משך הקלטת הווידאו ב 10-15 שניות (או כל ערך רצוי אחר), קצב המסגרות ב 5 fps (מסגרות לשנייה) או כל ערך אחר (בידינו, 5 fps הוא המקסימום הדרוש), ומיקום בדיסק שבו הסרט יישמר, כמתואר להלן.
- בתוכנה שמעל חלון המצלמה הראשי, בחר את הסמל השלישי משמאל. בתפריט המוקפץ, בחר Edit Record Settings, ולאחר מכן ייפתח חלון חדש.
- במצב רשומה, בחר הקלט לדיסק ומתחתיו הגדר את הרשומה למשך זמן זה בזמן הרצוי. באפשרויות ההקלטה של אותו חלון, הגבל את קצב ההקלטה ל- 5 (הרץ) ובחר את המיקום שבו יישמרו ההקלטות.
- כדי להגדיר את קצב המסגרות, סגור את החלון הקיים, פתח את Edit בתפריט הראשי ובחר Preferences. בחלק הימני של החלון הפתוח, הזן 5 בקצב פריימים יעד. באותו חלון למטה, בחר מקש קיצור / התחלה מרחוק יכולה לעצור הקלטה, ומהתפריט הנפתח, בחר במצב התחלה / עצירה.
הערה: נסה ליצור את הסרטים הקצרים ביותר האפשריים עם קצב הפריימים הנמוך ביותר האפשרי מכיוון שהוא צורך זיכרון. בהגדרות אלה, רשומה אחת תכיל כ- 100 Mb.
- בזמן שהמשתתפים נחים, הרכיבו את המצלמה התרמית (סוג גלאי: מיקרובולומטר לא מקורר; גובה הגלאי: 17 מיקרומטר; טווח ספקטרלי של המצלמה: 7.5-14.0 מיקרומטר; רגישות תרמית: 20 mK ב-30°C; עדשות: 36 מ"מ; רזולוציה: 1024 פיקסלים x 768 פיקסלים; שדה ראייה מיידי [IFOV]: 0.47 mRad) על החצובה ומקמו אותה במרחק של 1 מ' מהמקום שבו ישב המשתתף.
- מקמו את המשתתף כך שהאזור הסופרקלוויקולרי של הצוואר, מעל עצם הבריח שבה BAT ממוקם (איור 1), יהיה במרחק מוקד של 1 מטר והקלט סרט קצר (10-15 שניות) בקצב פריימים של 5 פריימים לשנייה על-ידי לחיצה על מקש F5 . ההקלטה תיפסק בשעה היעודה.
- בחדר בזמן המדידות, יש לוודא שרק המשתתף והאדם המבצע את המדידות נוכחים. הימנעו מתנועת אוויר או טיוטה (למשל, ממיזוג אוויר). ודאו שהמשתתפים רחוקים מטיוטה קרה, מאור שמש (ישיר או עקיף) או מכל מקור חום כמו נורות.
- אם מתאים, למדוד את ריכוזי הגלוקוז בדם נימי מקצה האצבע עם glucometer סטנדרטי ואת טמפרטורת הגוף באמצעות מדחום בית השחי.
- ודא שכל המשתתפים אוכלים את אותה ארוחה. שימו לב למגבלות המזון ולדרישות של הנבדקים (למשל, הארוחה לחולי סוכרת). כל המשתתפים, כולל קבוצת ביקורת (בריאה) ומשתתפים עם הפרעות מטבוליות, צריכים לאכול את אותה ארוחה.
הערה: לפרטים נוספים על ארוחות שחולי סוכרת יכולים לצרוך, צרו קשר עם אנדוקרינולוג מקומי או שוחחו על כך עם המשתתפים הסובלים מסוכרת. - בזמן הרצוי לאחר ארוחה, בצע את ההקלטה החדשה על ידי הקשה על F5 באמצעות אותם ערכי הגדרה. אל תחזור על הפרוטוקול שנקבע להקלטות. חזור על המדידות לאחר 30 דקות, שעה, שעתיים ושלוש שעות לאחר ארוחה12. עבור תכנון המחקר הספציפי שלך, הזמן לאחר הארוחה יכול להיות קצר יותר או ארוך יותר, אך אנו ממליצים לפחות על שלוש נקודות הזמן הראשונות.
הערה: המגבלה של מספר המשתתפים היא ארבעה עד שישה, למרות שהמדידות נעשות מהר. עם מספר גבוה יותר של משתתפים, זמן העיכוב עבור חלקם יהיה ארוך מדי.
2. מדידת הפעלת רקמת שומן חום לאחר ארוחה בחיות מעבדה
הערה: מכיוון שבעלי החיים שוכנים במתקן לבעלי חיים עם טמפרטורת חדר מווסתת ומחזור יום/לילה של 12 שעות/12 שעות, ניתן לבצע ניסויים בכל עונה. טמפרטורת החדר במהלך ניסויים צריך להיות בין 22 °C (75 °F) ו 27 °C (77 °F). במחקר זה נבדקו שש נקבות חיות בדיסטרוס ושש חיות בר זכריות (WT) C57Bl/6NCrl.
- להרדים את בעלי החיים בהתאם להנחיות האתיות של המוסד. במחקר זה, ההרדמה בוצעה באמצעות זריקות I.P של קטמין/קסילזין (80-100 מ"ג/ק"ג ו-6-8 מ"ג/ק"ג, בהתאמה). יש למרוח ג'ל עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההרדמה. גלחו את האזורים הבין-סקפולריים של חיות הניסוי יום לפני הניסויים (אזור העור בין השכמות) באמצעות גוזם חיות קטן.
- יום לפני הניסויים, גם לקבוע את השלב של מחזור הייחום אצל חיות נקבה.
הערה: השלב של מחזור הייחום נקבע על ידי מריחות בנרתיק.- טובלים צמר גפן בתמיסת מלח סטרילית בטמפרטורת החדר (0.9% NaCl) ומחדירים לנרתיק. מגרדים בעדינות את דופן הנרתיק עם המקלון, מורחים את התאים המחוברים על מגלשת זכוכית ומאפשרים לו להתייבש באוויר.
- החזירו את החיות לכלובים שלהן. מכתימים את התאים עם 500 μL של 0.1% cresyl סגול אצטט במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם 3 פעמים עם מים.
- צפו בתאים תחת מיקרוסקופ אור עם הגדלה של פי 100 ותאורת שדה בהיר. לקבוע את השלב של מחזור הייחום מבוסס על מספר leukocytes ותאי אפיתל nucleated ו cornified שנצפו בכתם25.
- הוציאו את מזונם של בעלי החיים בערב שלפני הניסויים (צום לילה) עם מים עד ליביטום. הדרך הטובה ביותר היא להעביר את בעלי החיים לכלובים נקיים חדשים כדי למנוע שאריות מזון אפשריות בכלובים.
- בבוקר יום הניסוי, הכינו את המצלמה התרמית ואת הגדרות ההקלטה כפי שנעשו לבדיקת המשתתפים האנושיים.
- אין להפריע או לגרום לחץ לבעלי החיים לפני ביצוע מדידות IR. הניחו בזהירות את בעל החיים בכלוב נקי (מוודא שאין השפעות של ריח של בעלי חיים אחרים על המערכת הסימפתטית של החיה). מקם את הכלוב מתחת למצלמה התרמית במרחק מוקד של 1 מ '. הקלט סרט על-ידי הקשה על F5.
- שקלו את כדורית המזון לפני נתינתה לכל בעל חיים, כך שניתן יהיה לחשב את צריכת המזון. אפשרו לבעל החיים לאכול במשך 30 דקות בכלוב שלו ושקלו שוב את כדורית המזון לאחר הארוחה. במחקר זה, נקבות בעלי חיים אכלו 0.038 ± 0.004 גרם מזון/משקל גוף.
הערה: אם תחליט למדוד את ריכוזי הגלוקוז בדם, בצע את המדידות לפני הארוחה אך לאחר מדידות IR כדי להבטיח שהדבר לא יוביל להפעלת BAT על ידי המערכת הסימפתטית. - חזור על מדידות IR בזמן הרצוי לאחר תחילת הארוחה (בדרך כלל 30 דקות, שעה ושעתיים לאחר ארוחה)17,26.
- לאחר השלמת כל הניסויים, בדקו שוב את שלב מחזור הייחום בנקבות בעלי חיים כמתואר לעיל (נקבות עשויות לצאת מהשלב הרצוי של מחזור הייחום מוקדם מהצפוי).
3. ניתוח ההקלטות התרמיות
הערה: תוכנת המצלמה התרמית מחשבת את טמפרטורת האובייקט באמצעות חמישה משתנים.
- הגדר את המשתנים הבאים בתוכנה לפני הניתוח: פליטות עור, e = 0.9815,27, טמפרטורת החדר המשתקפת (כפי שמחושבת מהתמונה של רדיד אלומיניום), טמפרטורת אוויר, לחות יחסית, מרחק לאובייקט = 1 מ '. בצע את הניתוח באמצעות התוכנה עם ערכים אלה.
הערה: פלטת הצבעים המועדפת היא קשת מכיוון שהיא משתמשת ביותר גוונים, מה שמאפשר זיהוי קל יותר של עטלף מעל עצם הבריח. - עבור כל סרט, הזן את המשתנים המפורטים בתוכנת המצלמה בצד ימין של החלון הראשי. בחר את המסגרת (תמונה) המתאימה מהסרט על-ידי הזזת ראש ההפעלה בתחתית המסך או לחיצה על לחצן השהה .
- בחר את אזור העניין (ROI) על ידי בחירת הצורה הרצויה של האזור בצד שמאל של החלון הראשי. בחר את הצורה המתאימה ביותר לאזור העור מעל או בין עצמות הבריח.
- כאשר נבחר החזר ההשקעה, הטמפרטורות המינימליות, המקסימליות והממוצעות של החזר ההשקעה מוצגות בצד ימין. בתמונה, המשולש האדום מייצג את נקודת הטמפרטורה המרבית המתועדת, והמשולש הכחול מייצג את הטמפרטורה המינימלית המתועדת. חזור על שלב זה במשך מספר פריימים כדי לוודא שהטמפרטורה הנמדדת יציבה במהלך מספר שניות של ההקלטה.
- הפחיתו את הטמפרטורות המקסימליות של אזור העור מעל BAT לפני ארוחה מהטמפרטורות המקסימליות לאחר ארוחה כדי לקבוע את העלייה בפעילות BAT לאחר הארוחה בחיות מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדרך הקלה ביותר לקבוע את פעילות ה-BAT היא להפחית את טמפרטורת העור המקסימלית מעל ה-BAT לפני ואחרי ארוחה בבני אדם. דרך טובה יותר לחשב את פעילות ה-BAT היא לבחור שני אזורי עניין: אזור העור מעל ה-BAT, הממוקם באזור הסופרקלוויקולרי, ואזור האינטרקלאביקולרי של העור שבו לא נמצאה רקמת BAT בבני אדם, המיועד כאזור ייחוס (על פי PET-CT; איור 1). פעילות BAT נקבעת בקלות על ידי החיסור של שתי טמפרטורות אלה. כפי שניתן לראות באיור 1, פעילות BAT נקבעה כ-1.8°C. כדי לקבוע את ההפעלה של BAT לאחר האכלה, זה חזר על עצמו בנקודות זמן ייעודיות לאחר ארוחה12. במחקר זה ערכנו ניסויים עם שלוש משתתפות. תוצאות דומות התקבלו ממשתתף 1 וממשתתף 2 עם BMI של 23 ק"ג/מ"ר 2 ו-34 ק"ג/מ"ר2, בהתאמה. למשתתף 3 היה ה-BMI הנמוך ביותר (18 ק"ג/מ"ר2) והעלייה הגבוהה ביותר בפעילות BAT לאחר ארוחה (איור 1B, משמאל). הטמפרטורה המקסימלית באזור הסופרקלוויקולרי של העור אינה מייצגת היטב את פעילות ה-BAT, מאחר שאין ירידה בטמפרטורת העור אפילו 3 שעות לאחר ארוחה (איור 1B, מימין). בשל הבדלים בפעילות BAT בקרב האוכלוסייה האנושית, ניתוח התוצאות צריך להיעשות באופן פרטני, ו / או בחירת המשתתף למחקר צריך להיעשות בזהירות רבה. אין הבדל כזה בפעילות BAT בחיות מעבדה מכיוון שהן קרובות זו לזו.
היתרון הראשון של שיטה זו בהשוואה לשימוש ב- PET-CT (18F-FDG) הוא שהיא מודדת את פעילות ה- BAT ללא קשר למקור החום. מסיבה זו, תרמוגרפיה IR היא הרבה יותר רגישה ומייצגת בצורה אמיתית יותר את פעילות BAT בתנאים פיזיולוגיים או פתופיזיולוגיים שונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את התנאים הפיזיולוגיים המובילים לשינויים בפעילות BAT, כגון גיל, מין, או שלב של מחזור הייחום. בבני אדם, יתרון נוסף הוא היכולת לקבוע את השינויים הפתופיזיולוגיים בפעילות BAT במחלות מטבוליות כמו השמנת יתר וסוכרת מסוג 2. יתרון מיוחד ניתן לראות כאשר משווים את פעילות ה- BAT של אנשים עם ריכוז גלוקוז גבוה בדם לבקרות בריאות, שכן ב- PET-CT, הגלוקוז הרדיואקטיבי מתחרה עם אותם מובילי גלוקוז כמו גלוקוז בגוף, מה שמוביל לתוצאות שליליות כוזבות או מצגי שווא של פעילות BAT.
חשש אפשרי אחד הוא ההבדלים בעובי העור, במיוחד ברקמת השומן הלבן התת עורית, אשר יכולים לשנות את טמפרטורת העור מעל BAT בנבדקים שונים28. ניתן להימנע מבעיה זו על ידי השוואת הפעלת BAT לפני ואחרי ארוחה. בדרך כלל, הפעילות והחשיבות הבאה למצבים פתופיזיולוגיים שונים נקבעים על ידי הפעלת BAT לאחר חשיפה לקור. עם זאת, סוג זה של הפעלת BAT הוא עונתי, ובבני אדם (בהשוואה לבעלי חיים במדבר), לא חשוב מאוד. כדי לקבוע את ההשפעות של פעילות BAT על חיי היומיום, כמו גם הומאוסטזיס גלוקוז, הפעלת BAT לאחר ארוחה ואחריה ניצול גלוקוז וחומצות שומן היא הדרך הנכונה.
יש לשים לב למדידות המבוצעות בסביבה חמה או מוקדם מדי לאחר פעילות השרירים. פעילות השרירים מעלה את טמפרטורת הגוף, מה שמוביל להרחבת כלי הדם בעור (איור 2). כאשר אין אזור עור חם נראה לעין מעל ה- BAT בהשוואה לאזורי העור שמסביב, אל תכלול את ההקלטות מהמחקר.
פעילות ה-BAT בחיות מעבדה נקבעת על ידי הטמפרטורה המקסימלית של ה-BAT הממוקמת בין עצם השכמה (interscapular BAT, iBAT) לבין הטמפרטורה הממוצעת של העור מעל ה-iBAT. קל יותר למדוד את הטמפרטורה הממוצעת של העור מעל BAT בחיות מעבדה מאחר שהוא מקומי יותר מאשר בבני אדם (איור 3). במחקר זה, השינויים בפעילות BAT לאחר ארוחה נמדדו אצל נקבות חיות WT בדיסטרוס (28.2 ± 0.5 שבועות). כפי שניתן לראות באיור 3, שינויים מובהקים סטטיסטית בפעילות BAT נקבעו 30 דקות לאחר ארוחה, אך רק כאשר נמדדה הטמפרטורה המרבית (p < 0.05). כאשר פעילות ה-BAT הוצגה כשינויים בטמפרטורות הממוצעות, השינוי לא היה משמעותי (p = 0.066). לכן, הצגת פעילות ה-BAT באמצעות שינויים בטמפרטורה המקסימלית של אזור העור הבין-סקפולרי היא דרך טובה יותר להציג את התוצאות. שינוי זה בפעילות BAT נמצא בקורלציה חיובית עם כמות המזון שנבלע (r = 0.65).
הדאגות העיקריות עבור שתי קבוצות הנבדקים הן ההבדלים הביולוגיים בהפעלת BAT אצל זכרים ונקבות וחיות צעירות וזקנות, כמו גם ההבדלים בפעילות BAT במהלך מחזור הייחום17. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לכמות הזמן שחלף מהארוחה האחרונה, אשר יהיה קשה להעריך אם הפרוטוקול הנ"ל לא אחריו. ביצוע ניסויים בו זמנית בבוקר אינו מדויק מספיק17.
דאגה נוספת בעת מדידת פעילות BAT היא להימנע ככל האפשר מלחץ אצל בעלי החיים. כל הפרעה תגביר את הפעילות הסימפתטית ולכן פעילות BAT16. יתר על כן, רוב הטעויות הקשורות לרישומי טמפרטורה עשויות להופיע אם האזור הבין-סקפולרי של העכברים אינו מגולח כראוי, מה שעלול להוביל למדידת האזור הלא נכון של העור.
איור 1: תרמוגרפיה אינפרה-אדומה. (A) נבחרים שני אזורי עור: אחד מעל רקמת השומן החומה (BAT; אזור סופרקלאביקולרי) והשני באזור הבין-קלאביקולרי (אין רקמת BAT מתחת לעור של נקודת ייחוס זו של אזור זה). מיקום ה-BAT מוצג כאזור החם ביותר מעל עצם הבריח. הייצוג הסכמטי של מיקום ה- BAT בצוואר על פי PET-CT מוצג באיור השמאלי. טמפרטורות הן טמפרטורות מקסימליות הנמדדות באזורי עור מוקפים. הסרגל מייצג 5 ס"מ. (B) ההבדלים בין הטמפרטורות המקסימליות בשני אזורי העור מוצגים עבור כל משתתף, ומראים את העלייה בפעילות BAT שעתיים לאחר ארוחה (משמאל). פעילות BAT אינה יכולה להיות מוצגת על ידי טמפרטורות מקסימליות של העור מעל BAT (מימין). התוצאות מוצגות כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. * p < 0.05 בהשוואה לערך התחלתי (ANOVA זוגי). קיצור: SC = suprascapular. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התנאים שבהם לא ניתן למדוד פעילות BAT. האיור מייצג את התנאים שבהם לא ניתן לקבוע את פעילות BAT עקב הרחבת כלי דם מוגברת של העור. הסרגל מייצג 5 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: רקמת שומן חום בעכברי מעבדה. (A,B) רקמת שומן חום אינטרסקפולרי (BAT) מופעלת לאחר חשיפה לקור ורק אז מוצגת כהצטברות של 18F-FDG על-ידי PET-CT. ניתן היה לראות את פעילות ה-BAT באמצעות מצלמה תרמית ללא חשיפה לקור. (C) מיקום ה-BAT בסריקה התרמית תואם ל-BAT המוצג בתמונת PET-CT באמצעות חץ. האזור המגולח גדול יותר מה-BAT כדי להיות מסוגל לראות את כל השינויים בטמפרטורה (לא ניתן היה לחזות באופן מושלם את המיקום של Tmax, ובחלק מהמחקרים ניתן למדוד את הטמפרטורה הממוצעת). הסרגל מייצג 1 ס"מ. (D) מוצגות הטמפרטורות המקסימליות והממוצעות הנמדדות של העור מעל BAT עבור שש נקבות עכברים בדיסטרו. התוצאות מוצגות כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. * p < 0.05 בהשוואה לערך התחלתי (ANOVA זוגי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים עדכניים מציגים עדויות הולכות וגדלות לגבי הוויסות הפיזיולוגי והחשיבות של פעילות BAT בבני אדם בוגרים ובבעלי חיים בהתפתחות השמנת יתר וסוכרת. יתר על כן, הפעלה אפשרית של BAT על ידי מפעילים אקסוגניים הופכת למטרה עבור חברות תרופות. כדי להיות מסוגל להעריך את הוויסות הפיזיולוגי ואת החשיבות הפתופיזיולוגית של BAT במחלות מכבידות מאוד, כמו גם לגלות גישה טיפולית פוטנציאלית, תרמוגרפיה אינפרא אדום הופך את השיטה המועדפת. למרות שטכנולוגיית IR מסתמנת כשיטת בחירה חדשה במדידת פעילות BAT 12,13,14,15,17, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לא לשיטה היישומית עצמה אלא לתכונות הפיזיולוגיות של הפעלת BAT. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת למין, גיל, שלב במחזור הייחום, מצב האכלה ולחץ אפשרי אצל משתתפים אנושיים וחיות מעבדה.
המדידות של העלייה בפעילות BAT לאחר ארוחה שבוצעה על בני אדם וחיות מעבדה דומות למדי12,17. צעדים קריטיים בביצוע מדידות אלה כוללים הימנעות מלחץ ופעילות שרירים (אין להפריע לבעלי חיים לפני ביצוע מדידות). עבור המשתתפות, יש לקחת בחשבון את ההבדלים התפקודיים בפעילות BAT במהלך המחזור החודשי. יתר על כן, העור צריך להיות חשוף (בעלי חיים יש לגלח יום לפני ביצוע ניסויים כדי למנוע מתח מיותר). יתר על כן, חשוב מאוד להגדיר את תוכנת המצלמה כראוי כדי לקבל את הרזולוציה התרמית הטובה ביותר האפשרית. כדי להציג את הנתונים כתמונות תרמיות, הדרך הטובה ביותר היא לבחור לוח צביעה מתאים שמתאים למחקר המסוים. אם עוקבים אחר הפרוטוקול כראוי, יש פחות אפשרות לבצע שגיאות בביצוע תרמוגרפיה IR.
מגבלת השיטה היא שלא ניתן, ללא חשש קל, להשוות את פעילות ה-BAT בין אנשים עם כמויות שונות של שומן תת עורי (או בעלי חיים שמנים לבעלי חיים בעלי משקל גוף תקין). כדי למנוע בעיה זו, אותו נושא צריך לשמש כבקרה על ידי מדידת פעילות BAT לפני ואחרי ארוחה. חישוב העלייה בפעילות ה-BAT לאחר ארוחה יבטל את ההבדלים בפיזור החום מה-BAT התת עורי אל פני העור.
דיווח על פעילות BAT באמצעות שינויים בין טמפרטורות העור המקסימליות של שני אזורי העור הוא, מנקודת מבטנו, דרך טובה יותר מכיוון שהוא מבטל את ההבדלים בגודל BAT ו / או באזור העור המיועד בתוצאות שהתקבלו על ידי מדידות טמפרטורה ממוצעות29.
כאמור, שיטת הבחירה למדידת פעילות BAT עד כה היא PET-CT באמצעות גלוקוז רדיואקטיבי (18F-FDG). שיטה זו הוכיחה לאורך זמן שהיא אינה רגישה מספיק, השימוש בה בחומר רדיואקטיבי מדאיג והוא יקר מאוד. PET-CT הוא חסר תועלת בקביעת הפעלת עטלף לאחר ארוחה. 18 הצטברות F-FDG ב- BAT לאחר ארוחה בקושי נראית10 ונחשבת לתוצאה שלילית. לאחרונה הוצע כי הפעלת BAT בולטת יותר באוכלוסייה האנושית, ולכן חשובה יותר ויותר בהתפתחות והתפשטות מחלות מטבוליות7. ניסיון לפתור בעיה זו הוא למדוד את נפח ה- BAT על ידי MRI בחולי טרום סוכרת ובחולים עם סוכרת סוג 2 עם תנגודת לאינסולין11. עם זאת, כמות ה- BAT אינה נותנת מידע על פעילות ה- BAT וניצול גלוקוז וחומצות שומן, דבר חשוב בחולי סוכרת.
לביסוס תרמוגרפיה IR כשיטת בחירה למדידת פעילות BAT, במיוחד בנבדקים אנושיים עם ריכוז גלוקוז גבוה בדם, תהיה השפעה עצומה על התחום. תרמוגרפיה IR משמשת לקביעת הפעלה הנגרמת על ידי קור של BAT 13,14,15, ולאחרונה, הפעלת BAT לאחר ארוחה במתנדבים בריאים 12 וחיות מעבדה 17. הפעלת ה-BAT לאחר הלידה קטנה יותר אצל נקבות ונבדקים מבוגרים יותר, ללא קשר למין. למרבה הצער, רוב המחקרים על הפעלת BAT ומחקרים מטבוליים בוצעו רק על נבדקים זכרים (חיות מעבדה זכרים או גברים). הבעיה עם גישה זו היא שהיא מתעלמת מהשפעת השלב של מחזור הייחום על פעילות BAT30.
לבסוף, תרמוגרפיה IR תאפשר לחקור את החשיבות הפיזיולוגית והפתופיזיולוגית של BAT באוכלוסיות אנושיות שונות, במיוחד אצל נשים לפני ואחרי גיל המעבר, מחקרים שחסרים עבורם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק המחקר של הקרן הקרואטית למדע (IP-2018-01- 7416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% cresyl violet acetate | Commonly used chemical | ||
| Device for measuring air temperature and humidity | Kesterl | Kestrel 4200 | Certificat of conformity |
| External data storage | Hard Drive with at least 1 TB | ||
| Glass microscopic slides | Commonly used | ||
| Small cotton tip swab | Urethral swabs | ||
| Software for analysis | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR Tools | |
| Software for meassurements | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | ResearchIR software | FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit) |
| Thermac Camera | FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA | FLIR T-1020 |
References
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Morrison, S. F., Nakamura, K. Central neural pathways for thermoregulation. Frontiers in Bioscience. 16 (1), 74-104 (2011).
- Contreras, C., et al.
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Ouellet, V., et al. Outdoor temperature, age, sex, body mass index, and diabetic status determine the prevalence, mass, and glucose-uptake activity of 18F-FDG-detected BAT in humans. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 96 (1), 192-199 (2011).
- Pfannenberg, C., et al. Impact of age on the relationships of brown adipose tissue with sex and adiposity in humans. Diabetes. 59 (7), 1789-1793 (2010).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Vosselman, M. J., et al. Brown adipose tissue activity after a high-calorie meal in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 98 (1), 57-64 (2013).
- Hibi, M., et al. Brown adipose tissue is involved in diet-induced thermogenesis and whole-body fat utilization in healthy humans. International Journal of Obesity. 40 (11), 1655-1661 (2016).
- Fenzl, A., Kiefer, F. W. Brown adipose tissue and thermogenesis. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 19 (1), 25-37 (2014).
- Koksharova, E., et al. The relationship between brown adipose tissue content in supraclavicular fat depots and insulin sensitivity in patients with type 2 diabetes mellitus and prediabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (2), 96-102 (2017).
- Habek, N., Kordić, M., Jurenec, F., Dugandžić, A. Infrared thermography, a new method for detection brown adipose tissue activity after a meal in humans. Infrared Physics & Technology. 89, 271-276 (2018).
- Lee, P., Ho, K. K. Y. Hot fat in a cool man: Infrared thermography and brown adipose tissue. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13 (1), 92-93 (2011).
- Ang, Q. Y., et al. A new method of infrared thermography for quantification of brown adipose tissue activation in healthy adults (TACTICAL): A randomized trial. Journal of Physiological Sciences. 67 (3), 395-406 (2017).
- Jang, C., et al. Infrared thermography in the detection of brown adipose tissue in humans. Physiological Reports. 2 (11), 12167 (2014).
- Dodd, G. T., et al. Leptin and insulin act on POMC neurons to promote the browning of white fat. Cell. 160 (1-2), 88-104 (2015).
- Habek, N., et al. Activation of brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis is GC-C dependent. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 472 (3), 405-417 (2020).
- Burke, L. K., et al. Sex difference in physical activity, energy expenditure and obesity driven by a subpopulation of hypothalamic POMC neurons. Molecular Metabolism. 5 (3), 245-252 (2016).
- Glumer, C., Jorgensen, T., Borch-Johnsen, K. Prevalences of diabetes and impaired glucose regulation in a Danish population: The Inter99 study. Diabetes Care. 26 (8), 2335-2340 (2003).
- Sicree, R. A., et al. Differences in height explain gender differences in the response to the oral glucose tolerance test-the AusDiab study. Diabetic Medicine. 25 (3), 296-302 (2008).
- van Genugten, R. E., et al. Effects of sex and hormone replacement therapy use on the prevalence of isolated impaired fasting glucose and isolated impaired glucose tolerance in subjects with a family history of type 2 diabetes. Diabetes. 55 (12), 3529-3535 (2006).
- Williams, J. W., et al. Gender differences in the prevalence of impaired fasting glycaemia and impaired glucose tolerance in Mauritius. Does sex matter. Diabetic Medicine. 20 (11), 915-920 (2003).
- Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 215-223 (2013).
- Brasil, S., et al. A systematic review on the role of infrared thermography in the brown adipose tissue assessment. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 21 (1), 37-44 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Crane, J. D., Mottillo, E. P., Farncombe, T. H., Morrison, K. M., Steinberg, G. R. A standardized infrared imaging technique that specifically detects UCP1-mediated thermogenesis in vivo. Molecular Metabolism. 3 (4), 490-494 (2014).
- Hartwig, V., et al. Multimodal imaging for the detection of brown adipose tissue activation in women: A pilot study using NIRS and infrared thermography. Journal of Healthcare Engineering. 2017, 5986452 (2017).
- James, L., et al. The use of infrared thermography in the measurement and characterization of brown adipose tissue activation. Temperature. 5 (2), 147-161 (2018).
- Folgueira, C., et al. Hypothalamic dopamine signaling regulates brown fat thermogenesis. Nature Metabolism. 1 (8), 811-829 (2019).
- Ratko, M., Habek, N., Kordić, M., Dugandžić, A. The use of infrared technology as a novel approach for studies with female laboratory animals. Croatian Medical Journal. 61 (4), 346-353 (2020).
