Summary
T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.
Abstract
T 세포 수용체 자극에 대한 반응으로 칼슘 유입은 T 세포 신호 전달의 일반적인 척도입니다. 띠 통과 유세포 분석에 의한 칼슘 신호 전달을 평가하기 위해 여러 칼슘 지표 염료가 개발되었습니다. 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계되었습니다. 총 비장 세포는 세포 표면 분자에 대한 형광 색소 접합 항체 패널과 함께 비율 계량 칼슘 지표 염료 Indo-1로 표지됩니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석의 기능을 활용하면 Indo-1과 함께 다양한 세포 표면 염색을 활용할 수 있는 플랫폼이 제공됩니다. 이어서, 세포는 T 세포 수용체를 자극하기 위해 항-CD3 항체의 첨가 전후에 37°C에서 실시간으로 분석된다. 스펙트럼 신호를 혼합하지 않은 후, 칼슘 결합 대 칼슘이 없는 Indo-1의 비율이 계산되고 비장 세포의 각 게이트 집단에 대해 시간 경과에 따라 시각화될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포 집단에서 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.
Introduction
T 세포 수용체(TCR) 유도 칼슘 유입은 T 세포 활성화의 유용한 척도이며 T 세포 집단이 TCR 신호 전달 경로1의 근위 단계에서 손상된 반응을 갖는지 여부를 결정하는 데 자주 사용됩니다. 칼슘 유입의 측정은 일반적으로 하나 또는 한 쌍의 형광 칼슘 지시약 염료로 T 세포를 사전 표지한 다음 TCR 가교후 실시간으로 유세포 분석을 사용하여 형광 신호를 검사하여 수행됩니다 2,3,4. 비율 미터법 칼슘 염료인 Indo-1은 칼슘 결합5에 따라 두 가지 다른 파장에서 피크 방출로 UV 레이저에 의해 여기되며, 살아있는 림프구의 칼슘 반응에 대한 유세포 분석 분석에 일반적으로 사용되는 지표 염료입니다. Indo-1의 방출 프로파일이 매우 광범위하기 때문에 Indo-1 평가와 대역 통과 유세포 분석에 의한 여러 세포 표면 마커의 동시 분석을 결합하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 제한은 T 세포의 사전 정제된 집단 또는 제한된 세포 표면 분자 세트에 의해 식별된 집단에 대한 칼슘 반응의 유세포 분석 분석의 활용을 제한합니다.
띠통과 유세포 분석을 사용하여 원발성 림프구의 이질적인 집단에 대한 칼슘 반응 측정의 한계를 해결하기 위해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 Indo-1 형광을 측정하는 프로토콜이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화할 수 있으며, 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용할 수 있습니다. 기존의 유세포 분석에 비해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하면 형광 신호와 고도로 겹치는 염료를 구별할 수 있어 각 샘플에서 동시에 평가할 수 있는 표면 마커의 수가 증가한다는 장점이 있습니다. 종래의 유세포 분석은 대역통과 필터를 사용하며, 검출기 시스템당 하나의 형광색소로 제한된다6. 전체 스펙트럼 유세포 분석은 5-레이저 스펙트럼 유세포 분석 시스템 7,8에서 64개의 검출기를 사용하여 형광색소의 전체 스펙트럼에 걸쳐 신호를 수집합니다. 또한, 전체 스펙트럼 유세포 분석은 종래의 유세포 분석기에 존재하는 광전자 증배관 검출기에 비해 감도가 증가한 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기를 이용한다8. 결과적으로, 이 접근법은 칼슘 염료 표지 전에 특정 T 세포 집단을 분리할 필요가 없기 때문에 말초 혈액 단핵 세포 또는 쥐 이차 림프 기관 세포 현탁액과 같은 이종 세포 집단에 이상적입니다. 대신, 데이터 수집 후 세포 표면 마커 발현 프로필 및 유세포 분석 게이팅을 사용하여 각 관심 집단에서 칼슘 반응을 평가할 수 있습니다. 이 보고서에서 볼 수 있듯이 Indo-1은 8개의 형광색소 접합 항체와 쉽게 결합되어 총 10개의 고유한 스펙트럼 시그니처를 생성할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 선천적으로 구별되는 마우스 계통의 세포 혼합물에 쉽게 적용할 수 있어 유전자 표적 마우스 계통의 칼슘 반응과 비교하여 야생형 T 세포의 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.
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Protocol
마우스는 IACUC 프로토콜에 따라 콜로라도 대학교 안슈츠 메디컬 캠퍼스에서 유지되었습니다. 모든 마우스는 AAALAC 기준에 따라 안락사시켰다.
1. 마우스 비장에서 면역세포의 제조
참고: 순진한 마우스를 CO2 안락사로 안락사시킵니다. Jackson Laboratories에서 구입하여 사내에서 사육한 C57BL/6 마우스를 6-12주령의 실험에 사용합니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 실험에 활용됩니다.
- 외부 오염 물질이 샘플에 들어갈 가능성을 줄이기 위해 70% 에탄올로 마우스 피부를 소독합니다.
- 해부 도구, 수술용 가위, 집게를 사용하여 쥐 비장을 해부합니다. 비장을 채취하고 분리된 비장을 얼음 위에 ~5mL의 완전한 RPMI 배지(cRPMI)가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
참고: Complete RPMI는 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성됩니다.- 마우스 비장을 채취하려면 가위로 앞다리와 뒷다리 사이의 중간에 마우스 왼쪽을 따라 털과 피부를 5cm 절개합니다. 체강을 ~ 5cm 열고 집게를 사용하여 비장을 제거하십시오. 비장은 강낭콩의 색이며 인접한 신장보다 길고 평평합니다.
- 1.2단계의 내용물을 새 50mL 원뿔형 튜브에 부착된 멸균 70μm 필터에 붓습니다. 필터 표면에 비장 펄프가 남지 않을 때까지 5mL 주사기 플런저로 필터를 통해 비장을 밀어 비장을 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분리합니다.
- 4°C에서 5분 동안 500 x g 의 스윙 아웃 로터 조리대 원심분리기를 사용하여 비장세포를 펠렛화합니다.
- 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 펠렛화된 비장세포는 50mL 원추형 튜브의 바닥에 남아 있습니다.
- 적혈구를 제거하려면 제조업체의 지침에 따라 1mL의 ACK 용해 완충액에 펠렛화된 비장세포를 3분 동안 다시 현탁합니다. 잘 섞다.
- ACK 용해 완충액을 15mL의 cRPMI로 소멸시킵니다.
- 1.4단계에서 지시한 대로 림프구를 펠렛화합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에서 5mL의 cRPMI에 세포 현탁액을 다시 현탁합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
- 세포 수를 계산하려면 세포 현탁액 10μL를 0.6mL 미세원심분리기 튜브에 옮기고 트리판 블루 용액으로 1:1 비율로 희석합니다. 그런 다음 혈구계 또는 자동 세포 계수 시스템으로 옮깁니다.
- 단계 1.9에서와 같이 세포 현탁액 중의 세포 농도에 따라 계수한 후, 세포를 탁상용 원심분리기에서 4° C에서 5 분 동안 5분 동안 첨가하여 Indo-1 AM 에스테르 염료를 함유하는 cRMPI 배지를 제조하였다.
- 10-12 x 106 cells/mL를 달성하기 위해 세포의 재현탁 부피를 계산합니다. 이것은 필요한 총 세포 수의 2배 농도입니다.
- 단계 1.11에서 계산된 cRPMI의 부피로 세포를 재현탁한다. 뚜껑이 통기된 50 mL 원뿔형 튜브 또는 조직 배양 플레이트에 세포를 5%CO2 와 함께 37°C에 놓습니다.
2. Indo-1 비율계량 염료 및 형광 항체 라벨링
- 제조업체의 지침에 따라 50μg의 Indo-1 AM이 들어 있는 바이알에 50μL의 DMSO를 추가합니다. 원액의 농도는 1μg/μL입니다.
알림: DMSO는 DMSO의 산화를 방지하기 위해 키트와 함께 마이크로 바이알에 제공됩니다. - 스톡 분취량(1μg/μL)을 2배 농도인 6μg/mL 농도의 cRPMI의 적절한 실험 부피(1.11에 설정됨)로 희석합니다. Indo-1을 수용액에 보관하지 마십시오.
참고: 칼슘이 첨가된 다른 완충액은 세포 필요에 따라 사용할 수 있습니다. - Indo-1이 포함된 완전한 배지를 37°C의 수조에 따로 보관합니다.
알림: 적절한 신호를 얻기 위해 필요한 최소 농도의 Indo-1 AM 에스테르를 사용하십시오. 이것은 다양한 세포 유형에 대해 적정되어야 합니다. 일반적으로 3-5 μM 사이의 농도로 충분합니다. 일차 T 세포의 경우, 농도 >5μg/mL의 Indo-1을 로딩하는 세포는 스펙트럼 유세포 분석기에서 평균 형광 강도(MFI)를 로그 6 이상으로 증가시킵니다. 이 경우 UV 레이저 강도를 줄이고 Indo-1을 더 낮은 농도로 적정하십시오. - 2.2단계에서 제조된 2x Indo-1 배지를 포함하여 이전에 제조된 세포 현탁액(단계 1.12)을 cRPMI에서 1:1로 희석한다. 세포가 5-6 x 106/mL 사이의 농도인지 확인하십시오.
참고: 염색되지 않은 단일 염색 대조군 또는 표면 마커 단일 염색 세포 대조군을 Indo-1로 염색하지 마십시오. 단일 염색 항체 대조군에 Indo-1을 추가하면 단일 염색 세포에 Indo-1이 추가되어 다중 색상 샘플이 생성됩니다. 2.6단계에서 생성된 샘플 플레이트에 indo-1(칼슘 무함유) EGTA 첨가 대조군을 포함시킨다. - 12-웰 조직 배양 플레이트에 1mL의 세포/웰/실험 조건을 추가합니다.
- 이전에 Indo-1 염료가 로드된 세포를 사용하여 Indo-1(칼슘 프리) 샘플에 대한 단일 염색 대조군을 만들고 EGTA를 최종 농도 2mM에 추가합니다. EGTA는 세포 현탁액에서 칼슘을 킬레이트화하여 더 깨끗한 대조군 샘플을 제공합니다.
- 유세포분석기에서 염료가 로드된 세포 현탁액에 50μM의 이오노마이신을 추가하여 Indo-1 양성 대조군(Indo-1 칼슘 결합)을 만듭니다. 이오노마이신은 칼슘 이온에 결합하고 칼슘 이온이 세포로 전달되는 것을 촉진하는 막 투과성 칼슘 이온단입니다.
- 형광단이나 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 조절을 위한 웰을 만듭니다.
- 유세포 분석 패널 설계에서 항체 접합 형광단을 사용하여 관심 있는 추가 세포 집단(항체 사용자 정의)에 대한 단일 염색 제어를 위한 웰을 만듭니다. 여기에는 Indo-1 비율계량 염료가 포함되지 않습니다.
- 표면 염색을 위해 형광색소 접합 항체를 추가하기 전에 제조업체의 지침에 따라 Fc 수용체 차단 항체(~2μg/1 x 106 세포)를 추가합니다.
- 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다.
- 15분마다 플레이트를 부드럽게 두드려 12웰 플레이트에 세포를 재현탁합니다.
- 배지에 현탁된 세포의 전체 부피를 12-웰 플레이트로부터 혼합하고 제거한다. 그런 다음 세포 현탁액을 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.
- 실온에서 5분 동안 500 x g 의 미세 원심분리기에서 세포를 펠렛화합니다. 상청액을 경사 제거하고, 예열된 cRPMI 1 mL를 첨가하여 세포를 세척한다. 다시 펠렛을 만들고 상청액을 디캔팅합니다.
참고: 세포를 세척하면 남아 있는 FC 차단 항체가 제거됩니다. - 1.7mL 미세원심분리기 튜브에 cRPMI 1mL의 세포를 재현탁하고 각 튜브를 37°C에서 5%CO2에서 추가로 30분 동안 배양하고 가스 교환을 허용하기 위해 튜브의 상단을 약간 열어 둡니다. 이를 통해 세포내 AM 에스테르의 완전한 탈에스테르화를 가능하게 합니다.
- 필요한 경우 세포를 12웰 조직 배양 플레이트로 다시 옮깁니다. 추가적인 사용자 정의 적정 형광색소 접합 항체는 휴지기에 추가될 수 있습니다.
참고: 분석법 패널에 사용된 마커에는 Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 및 CD1d/α-galcer tetramer가 포함됩니다. 마커는 T 세포 하위 집합을 분석하기 위해 선택됩니다.- 관심 있는 세포 유형에 따라 사용자 정의된 모든 형광색소 접합 항체의 마스터 믹스를 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 미리 적정한 부피로 만듭니다.
- 휴지기 세포에 대한 적정된 항체에 따라 세포 부피 1mL에 대해 계산된 마스터 믹스를 추가합니다.
참고: 이후 단계 2.18 대신 단계 2.15에서 염색하면 단계 2.15에서 염색하면 실험의 전체 배양 시간이 단축된다는 장점이 있습니다. 그러나 2.15 단계에서 총 부피 1mL로 염색하면 항체 사용량이 증가합니다.
- 휴식 후, 실온에서 5분 동안 500 x g 에서 세포를 펠렛화한다.
참고: 12웰 조직 배양 플레이트의 세포는 플레이트 원심분리기 액세서리를 사용하여 플레이트에서 펠릿화할 수 있습니다. 그렇지 않으면 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 세포를 펠릿화합니다. - 펠렛을 4°C의 차가운 cRPMI에 1 mL에 재현탁하여 세포를 세척하고, 단계 2.16에서와 같이 세포를 다시 펠렛화한다. 세포를 얼음 위에 놓습니다.
참고: 세포 표면을 별도로 염색하는 경우 2.18단계에서 탈에스테르화 후 더 적은 항체 부피가 필요합니다. 이 단계에서의 표면 염색은 저온 유동 완충액(1% FBS가 첨가된 1x DPBS)에서 휴지 단계 후에 사용자 정의 항체를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 수행할 수 있습니다. 단계 2.17에서와 같이 cRPMI로 염색한 후 세포를 세척한다.- DPBS에서 1:7,500으로 희석된 생존력 얼룩 Ghost540을 제조업체의 지침에 따라 샘플에 추가합니다. 열은 단일 염색 된 살아 있거나 죽은 통제를 위해 온난화 블록에서 55 ° C에서 세포를 죽입니다.
참고: 유세포 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위한 Viability functional dye 염색은 FBS 없이 수행됩니다. FBS는 제조업체의 지침에 따라 아민 염료와 상호 작용할 수 있습니다.
- DPBS에서 1:7,500으로 희석된 생존력 얼룩 Ghost540을 제조업체의 지침에 따라 샘플에 추가합니다. 열은 단일 염색 된 살아 있거나 죽은 통제를 위해 온난화 블록에서 55 ° C에서 세포를 죽입니다.
- 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 플로우 튜브를 사용하여 500μL의 cRPMI(페놀 레드 프리)에 개별 샘플을 재현탁합니다.
참고: 세포는 최대 한 시간 동안 4°C에 보관할 수 있습니다. - 세포를 함유하는 5 mL 튜브마다 개별적으로, 7분 동안 비드 배스를 사용하여 37°C로 가온하여 샘플 간의 시간을 일정하게 유지하는 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 타이머를 사용합니다.
3. 비드 목욕 튜브: 칼슘 플럭스 분석 중 온도 유지
- 물을 첨가하지 않은 작은 수조에 목욕 구슬을 추가하십시오. 37 °C까지 예열합니다.
- 면도날로 50mL 원뿔형 튜브를 25mL 표시에서 조심스럽게 반으로 자릅니다. 튜브의 상단을 버리십시오.
- 반으로 자른 튜브의 3/4을 목욕 구슬로 채 웁니다.
- 3.2단계에서 만든 튜브를 3.1단계에서 만든 비드 배스에 넣습니다. 튜브와 비드를 37°C로 가져옵니다.
- 시료 분석을 준비하기 위해 온도를 유지하기 위해 유세포 분석기 옆의 전기 콘센트에 비드 배스를 꽂습니다.
- 유세포 분석기에서 실행하는 동안 튜브를 제자리에 배치하기 위해 하나의 튜브를 고정하기 위해 자른 50mL 원뿔형 스티로폼 랙을 추가합니다. 이렇게 하면 곡선 분석 기간 동안 튜브를 수동으로 잡을 필요가 없습니다.
4. 유세포 분석을 이용한 칼슘 유입량 획득
- 유세포 분석기에서 유세포 분석기 소프트웨어에 로그인합니다.
- 라이브러리 탭을 클릭하여 Indo-1(칼슘 결합) 및 Indo-1(칼슘 없음) 형광 태그를 추가합니다. 왼쪽의 소프트웨어 메뉴에서 Fluorescent Tags를 선택합니다. 형광 태그 그룹에서 UV 레이저를 선택하고 +추가를 클릭하여 라이브러리에 형광 태그 이름(Indo-1(칼슘 포함)/Indo-1(칼슘 없음))을 추가합니다. 레이저 여기 파장과 방출 파장을 선택한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 실험 설정을 계속합니다.
참고: Indo-1은 355nm 파장의 UV 레이저에 의해 여기됩니다. Indo-1 (칼슘 결합)의 방출 파장은 372 nm입니다. Indo-1(칼슘 프리)의 방출 파장은 514nm입니다. - 획득 탭을 클릭합니다. 새 실험을 열거나 만들고 원하는 형광 태그를 실험에 추가합니다.
- 실험에 대한 참조 그룹 과 새 샘플 그룹을 만듭니다. 필요에 따라 샘플과 참조 그룹 모두에 레이블을 지정합니다.
- 획득 탭에서 기록할 이벤트를 최대값(10,000,000)으로 설정합니다.
- 정지 부피를 최대 부피인 3,000μL로 설정합니다.
- 정지 시간을 최대 시간인 36,000초로 설정합니다.
- 다색 패널에 포함된 정의된 접합 항체에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.
- Indo-1 기능성 염료에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.
- 50μM의 이오노마이신을 칼슘 결합 Indo-1 양성 대조군에 추가합니다. 소용돌이 섞는다. 플로우 튜브를 샘플 주입 포트에 추가하고 Record(기록)를 클릭합니다.
- 칼슘이 없는 Indo-1 음성 대조군을 유세포 분석기에 추가하고 기록을 클릭합니다. EGTA는 단계 2.6에서 첨가되었다.
- Unmix 버튼을 클릭하여 단일 염색된 컨트롤을 혼합을 해제합니다.
참고: 모든 접합 항체 및 기능성 염료의 모든 단일 염색 대조군은 샘플을 혼합 해제하기 전에 기록해야 합니다. Unmix 버튼이 작동하려면 먼저 모든 참조 컨트롤을 녹음해야 합니다. 혼합은 시료 채취 전후에 수행할 수 있습니다.
- 혼합 해제가 완료되면 혼합되지 않은 워크시트를 사용하여 순차적 플롯을 만듭니다. SSC-A 대 FSC-A는 샘플에서 파편을 제거하고, SSC-A 대 SSC-H는 이중선을 제거합니다. 그 다음에는 관심 인구에 대한 추가 게이팅과 함께 생존 가능성 정화 게이트가 이어집니다. 게이트를 생성하려면 플롯을 클릭합니다. 워크시트에 플롯을 추가하고 게이트 내부를 두 번 클릭하여 다운스트림 게이트 모집단을 만듭니다. 관심 있는 모든 모집단이 설명될 때까지 계속합니다.
- 순차적 분석을 위해 단일 염색된 대조군 샘플(섹션 Indo-1 비율계량 염료 및 형광 항체 표지의 단계 2.6-2.9로부터)을 37°C로 따뜻하게 합니다. 유세포 분석 소프트웨어를 설정합니다.
- 유세포 분석기의 유체 안정성을 보장하기 위해 유세포 분석기에서 2-3분 동안 DI 물을 실행합니다.
- Polygon, Rectangle 또는 Ellipse gate 버튼을 사용하여 게이트를 생성하여 혼합되지 않은 워크시트에 순차적 플롯을 설정합니다. 관심 모집단(즉, SSC-A 대 FSC-A를 사용하는 림프구[크기/림프구 식별])을 포함하는 게이트. 음수 모집단은 0 주위에 모여 있는 것처럼 보이지만 양성 모집단은 MFI를 증가시켜 시각화할 수 있습니다. 관심 모집단은 생물학적 질문에 따라 사용자가 정의합니다.
- 생성된 게이트 내부를 두 번 클릭하고 Y축 및 X축 매개변수를 SSC-A 대 SSC-H(단일항 식별)로 변경합니다. 축의 단어를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 축 매개변수 정의를 완료합니다.
- SSC-A 대 생존도 염료 신호(생존도 게이트 파라미터)를 사용하여 플롯을 생성합니다. 아민 염료 염색에 음성인 살아있는 세포에 대한 게이트 . 살아있는 죽은 염색에 대해 음성인 살아있는 세포는 Y축과 X축 모두에서 0 표시에 클러스터링됩니다.
- 내부 플롯을 두 번 클릭하여 단세포 살아있는 림프구만 포함하는 새 플롯을 만듭니다. 칼슘 유입을 시각화하기 위해 X축에서 시간 대비 Y축을 Indo-1(경계 칼슘)(V1) 및/또는 Indo-1(자유 칼슘)(V7)로 변경합니다.
- 데워진 생물학적 샘플을 기계 SIT에 놓고 샘플을 2,500-3,000 events/s로 실행하여 제한된 세포 수 집단(예: iNKT)에서 칼슘 유입을 시각화할 수 있습니다.
참고: 세포를 1 x 106/mL의 농도로 재현탁함으로써 중간 유속으로 수집된 세포 이벤트는 2,500-3,000 events/s와 같아야 합니다. 드롭다운 메뉴를 클릭하여 수집 제어 하에 있는 유속을 낮추거나 세포 현탁액의 농도가 증가한 경우 샘플을 희석하십시오. 높은 유속으로 샘플을 실행하면 패널의 한 형광단에서 다른 형광단으로 신호가 확산되는 것을 증가시킬 수 있습니다. - 다음 튜브를 비드 배스에 추가하여 37°C로 예열합니다.
- Acquisition Control에서 Record를 눌러 30초 동안 초기 데이터를 기록하여 샘플에서 칼슘 신호의 기초 수준을 얻습니다.
- Acquisition Control(수집 제어)에서 Stop(중지)을 클릭하고 Sample Injection Port(SIP)에서 튜브를 제거합니다.
- 30μg의 비접합 항-CD3를 샘플 튜브에 직접 추가하여 칼슘 유입을 시작합니다. 튜브당 최종 농도는 60μg/mL입니다.
참고: 항-CD3 첨가 후 세척 단계가 없습니다. - 가능한 한 빨리 튜브를 기계 SIP에 다시 놓고 소프트웨어에서 녹음 을 누릅니다.
- 7분 동안 데이터를 기록하고 소프트웨어의 획득 제어에 따라 경과된 시간을 관찰하여 샘플 모집단 내에서 칼슘 유입의 시간 경과를 관찰합니다.
- 7분 후 소프트웨어에서 중지 를 누르고 1μg/mL의 이오노마이신을 추가합니다. 관심 세포에서 최대 칼슘 신호를 얻기 위해 30초 동안 기록합니다. 이오노마이신의 다음 샘플로의 이월을 제한하려면 샘플 사이에 기기에서 두 번의 SIT 플러시를 완료하십시오.
- 다음 샘플을 계속 진행하고 모든 샘플이 수집될 때까지 워크플로를 반복합니다.
- 실험을 저장하고 zip 파일 내보내기 를 클릭합니다. 비혼합 파일(.fsc)은 외부 유세포 분석 소프트웨어에 업로드됩니다.
5. 칼슘 곡선 분석
- 유세포 분석을 위한 분석 소프트웨어6 를 사용하여 Indo-1 형광 신호를 타임랩스 칼슘 측정을 위한 비율로 변환합니다. 선형 스케일을 사용하여 참조 Indo-1(칼슘 결합)/Indo-1(자유 칼슘)을 삽입하여 도구 탭 아래에 매개 변수를 파생합니다. 최소값을 0으로 설정하고 칼슘 유입 비율에 따라 최대값을 설정(일반적으로 약 10)합니다. 최대 비율은 Indo-1의 세포 유형 및 MFI에 따라 다릅니다.
- 선택한 매개변수를 강조 표시합니다. 도구(tools)에서 키네틱 분석(kinetic analysis)을 추가하고 키네틱스(Kinetics) 탭을 클릭하여 파라미터를 선택합니다. Y축을 derived로 설정합니다.
- Kinetics 탭에서 MFI(mean fluorescent intensity)를 선택합니다.
- 원하는 경우 가우스 스무딩을 추가합니다. 가우스 스무딩을 추가하려면 흐름 분석 소프트웨어의 풀다운 통계 메뉴에서 옵션을 선택합니다. 분석의 칼슘 유입 곡선의 시각화를 매끄럽게 하기 위해 가우스 평활화를 추가할 수 있습니다.
- 샘플 내에서 생물학적 비교를 위해 칼슘 플럭스 시간 경과를 따라 통계에 대한 여러 범위를 만듭니다.
- 샘플을 레이아웃 편집기로 드래그하고 원하는 대로 통계를 추가합니다. 통계 분석은 생물학적 질문에 따라 다릅니다. 출판을 위해 t-검정 또는 분산 분석을 사용하여 여러 반복실험을 분석합니다.
- 시간 분석의 순간을 위해, 칼슘 플럭스를 따라 특정 순간에 게이트를 설정하십시오. 관심 모집단에 대한 원하는 표면 마커와 게이트를 검사합니다. 그런 다음 시간 영역의 해당 순간에 개폐된 세포에 대해 Indo-1(칼슘 없음) 대 Indo-1(칼슘 결합)의 2차원 도트 플롯을 평가합니다.
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Representative Results
다중화 표면 염색이 있는 Indo-1 비율계량 염료를 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 평가하는 실험 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 마우스 비장세포를 채취하여 단일 세포 현탁액으로 처리한 후, 세포를 Indo-1 AM 에스테르로 염색하고 표면을 형광 색소 결합 항체로 염색합니다. 염료 로딩 및 항체 염색이 완료되면 림프구 샘플을 생물학적 온도(37°C)로 예열합니다. 그런 다음 분석 전에 샘플을 분류할 필요 없이 원하는 개별 세포 유형에 대한 게이팅 후 Indo-1 형광에 대한 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 샘플을 분석합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석기 내에서 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기를 사용하려면 nm 단위로 측정된 대역통과 필터 파장의 피크 방출 파장을 APD의 해당 채널로 변환해야 합니다. 그림 2 에 표시된 표는 지침을 제공하지만 Indo-1의 두 가지 형광 시그니처(칼슘 결합 대 칼슘 없음)에 대한 최적의 검출기는 경험적으로 결정해야 합니다. 이는 Indo-1(칼슘 결합) 신호를 생성하기 위해 Ionomycin을 사용하고 Indo-1(칼슘 무함유) 신호를 생성하기 위해 칼슘 킬레이트제인 EGTA를 사용하여 단일 염색된 Indo-1 샘플을 준비함으로써 달성됩니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용한 분석 후 각 Indo-1 시그니처에 대한 피크 형광 강도를 표시하는 채널을 시각화할 수 있습니다(그림 3A). 양성 집단의 MFI를 음성 집단의 MFI로 정규화함으로써 Indo-1 형광이 칼슘이 없는 상태에서 칼슘 결합으로 이동하는 것을 결정할 수 있습니다(그림 3B). 이 표시는 바운드 및 자유 Indo-1 모두에 대한 참조 컨트롤을 사용하여 통합 문서(.xls)에서 생성되며, 그림 3A와 같이 MFI 정규화를 위한 명확한 포지티브 및 네거티브 게이트가 있는 음수 및 포지티브 간격 게이트를 그립니다. 샘플 MFI 통계는 통계 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 얻을 수도 있습니다. 소프트웨어에서 양성 모집단과 음수 모집단을 나누어 MFI 비율을 결정하고 단일 디스플레이에 두 스펙트럼을 오버레이합니다(그림 3B, 오른쪽). 노란색 점선 화살표는 결합된 Indo-1과 자유 Indo-1의 스펙트럼 서명 사이의 정규화된 스펙트럼 차이를 보여줍니다.
T 세포 수용체 자극 후 칼슘 반응을 평가하기 위해 그림 4와 같이 관심 세포 집단에 대한 게이팅 후 Indo-1 형광을 평가합니다. 먼저, 유체 안정성을 평가하기 위해 시간 대 측면 산란(SSC-A) 플롯을 검사합니다. 시간 축에 걸쳐 안정적이고 일관된 신호는 안정성을 나타냅니다(그림 4A). 다음으로, 전방 대 측면 산란(FSC-A 대 SSC-A)을 시각화하고 림프구 집단을 게이트합니다(그림 4B). 림프구 게이트 후, 측면 산란 높이 대 면적(SSC-H 대 SSC-A)의 플롯을 생성하여 단일 세포 식별 게이트를 적용하고, 대각선에 속하는 싱글렛은 그림 4C와 같이 게이트됩니다. 그런 다음 특이점의 생존 염료로 염색을 검사하고 음성 집단에 대한 게이팅을 통해 생존력을 평가합니다(그림 4D). 마지막으로, T 세포를 분석하기 위해 CD19 음성 집단에 게이팅하여 B 세포 덤프/내부 음성 대조군 게이트를 적용합니다(그림 4E). 그런 다음 CD19 음성 집단을 CD4 및 CD8에 대한 항체를 사용하여 T 세포 하위 집합에 대해 평가합니다(그림 4F). 표시된 예는 시간 대비 Indo-1(칼슘 결합) 형광을 시각화하여 칼슘 반응에 대해 CD4+ T 세포를 검사합니다(그림 4G). 시간 세그먼트에서 게이팅한 후 Indo-1(칼슘 없음) 대 Indo-1(칼슘 결합) 플롯도 생성할 수 있습니다(그림 4H). 이 분석은 나중에 Indo-1 비율을 도출하는 데 사용됩니다(유세포 분석 소프트웨어에서 칼슘 유입 곡선 분석 방법 참조).
분석의 이 시점에서 관심 있는 개별 세포 집단의 시간 대 Indo-1(칼슘 결합)의 2차원 플롯 내에서 시간의 모멘트를 분석하는 것이 유용할 수 있습니다. 최적의 시점에는 TCR 자극 전 Indo-1에 결합된 기준선 칼슘, 피크 반응, 세포내 칼슘 수치가 감소함에 따라 피크 반응 몇 분 후의 시점, 마지막으로 이오노마이신을 추가하여 유도된 칼슘 반응이 포함됩니다(그림 5A). 항-CD3 항체 첨가 전의 기준선 샘플에서, 약한 Indo-1 (칼슘 결합) 신호가 검출된다. 피크 반응 동안 세포는 강한 Indo-1(칼슘 결합) 신호와 Indo-1(칼슘 없음)의 감소된 형광을 보여줍니다. 피크 후 5분에 Indo-1 형광은 거의 기준선으로 돌아왔습니다. 이오노마이신이 샘플에 첨가된 후 Indo-1(칼슘 결합)의 강력한 신호를 시각화하여 세포의 적절한 염료 로딩을 보장할 수 있습니다. 희귀 세포 집단(<1%)은 파생 분석에 어려울 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 CD4+ 세포, TCRb+ 세포, TCRyg+ 세포, CD25+ 세포, iNKT 세포 및 CD19+ 세포와 같은 각 관심 집단에 대한 게이팅 후 Indo-1(칼슘 결합) 대 Indo-1(칼슘 없음)을 플로팅하여 희귀 집단 분석을 수행할 수 있습니다(그림 5B, C). TCRγδ+ T 세포 및 iNKT 세포(CD1d/α-galcer+)에서 쉽게 검출할 수 있는 칼슘 반응에 주목하십시오. 혼합된 쥐 T 세포 집단 내의 표면 단백질을 비교하기 위해 관심 하위 집합을 보여주는 2차원 플롯을 만들었습니다. 아래에는 각 하위 집합에 대한 전체 시간 경과에 대한 칼슘 반응 분석이 표시됩니다(그림 5C).
이 분석은 또한 야생형 대 유전자 표적 마우스의 T 세포 또는 치료되지 않은 T 세포와 약리학적 억제제로 치료된 T 세포의 생물학적 차이를 확립하는 데 사용할 수 있습니다. 도 6에 나타낸 예에서, T 세포는 T-세포 티로신 키나아제, ITK 및 RLK 9,10의 소분자 억제제인 PRN694로 처리되었다. ITK/RLK의 억제는 T 세포 수용체 신호 전달을 약화시켜 T 세포 수용체 자극 후 칼슘 반응을 감소시킨다11(그림 6A). ITK/RLK 억제의 효과를 정량화하기 위해 Indo-1(칼슘 결합) 대 Indo-1(칼슘 무함유) 형광의 비율을 표시하는 곡선을 각 조건에 대한 곡선 아래 면적(AUC) 또는 곡선의 기울기에 대해 분석할 수 있습니다(그림 6B, C). 이 정량화는 칼슘 반응의 시간 경과를 개별 세그먼트로 분할하고(그림 6A), 그림과 같이 곡선 아래 면적 또는 각 세그먼트에 대한 곡선의 기울기를 평가하여 수행됩니다(그림 6B, C). 전반적으로, 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석이 조사 중인 면역 세포 집단에서 여러 세포 표면 마커와 함께 칼슘 유입을 측정하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 결과는 전체 모집단의 1% 초과로 대표되는 세포 하위집합이 시간 경과에 따른 칼슘 유입에 대해 평가될 수 있음을 보여준다. 대조적으로, 덜 풍부한 세포 하위 집합은 시간 모멘트를 사용하는 대체 분석이 필요합니다.
칼슘 반응 데이터의 통계 분석은 실험 질문 및 수행중인 생물학적 분석에 따라 다릅니다. 원고에 제시된 데이터에서 실험의 정확성과 방법론의 견고성을 보장하기 위해 반복실험으로 실험을 수행했습니다. 그러나, 상이한 날에 상이한 생물학적 샘플에 대한 다중 실험은 수행되지 않았다. 따라서 제시된 데이터에 대해 통계 분석을 수행하는 것은 적절하지 않습니다.
그림 1: 칼슘 분석 워크플로우의 개략도. Indo-1 AM 에스테르 칼슘 지표 염료의 사용은 면역 세포와 그 하위 집단에서 칼슘의 유입을 시각화하는 도구를 제공합니다. 이 도식은 쥐의 비장 T 세포에서 칼슘 반응을 분석하기 위한 워크플로우를 간략하게 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PMT 파장을 APD 채널로 변환. 전체 스펙트럼 유세포 분석기에는 UV 레이저에 의한 여기 후 형광 방출을 감지하는 16개의 검출기가 있습니다. 각 감지기의 사양은 표에 표시되어 있습니다. 강조 표시된 것은 단일 염색 대조군을 사용하여 경험적으로 결정된 Indo-1 형광 평가에 사용된 두 개의 검출기입니다. APD 파장으로의 변환 및 스펙트럼 유세포 분석기에 대한 사용자 매뉴얼을 사용할 수 있습니다11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Indo-1 스펙트럼 시그니처의 시각화. (A) 상단: 칼슘의 강력한 유입을 유도하기 위해 이오노마이신 도입 후 CD8+ T 세포에서 Indo-1 형광의 스펙트럼 시그니처. Indo-1 (칼슘 결합)의 피크는 UV1에서 시각화 할 수 있습니다. 하단: UV7에서 피크 형광을 보여주는 Indo-1(칼슘 프리)의 스펙트럼 시그니처. 이 대조군 샘플은 Indo-1-로딩된 세포를 EGTA12로 처리하여 임의의 세포외 유리 칼슘을 킬레이트화함으로써 생성되었다. (B) Indo-1 시그니처의 5 개의 레이저 스펙트럼 오버레이를 결합하여 왼쪽에는 원시 스펙트럼 MFI를, 오른쪽에는 Indo-1 바인딩 대 자유 Indo-1의 정규화 된 스펙트럼을 보여줍니다. 주황색의 Indo-1(칼슘 무함유)에서 파란색의 Indo-1(칼슘 결합)로의 전환을 시각화하면 쉽게 감지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 칼슘 반응의 시각화를 위한 게이팅 전략. 샘플의 순차적 게이팅을 위한 워크플로가 간략하게 설명되어 있습니다. (A) 유체 안정성은 시간 대 SSC-A 게이트를 사용하여 검사됩니다. (B) FSC-A 대 SSC-A는 림프구를 게이트하는 데 사용되며, 이에 따라 샘플에서 세포 파편 및 잔류 적혈구를 제거합니다. (C) 단일 세포는 SSC-H 대 SSC-A 플롯을 사용하여 게이트됩니다. 그런 다음 일중항 게이트는 살아있는 죽은 Ghost540 대 SSC-A의 플롯에 적용됩니다. Ghost540 음성 세포에 대한 게이팅은 후속 분석에서 생존할 수 없는 세포를 제거합니다. (E) 살아있는 세포를 CD19 대 SSC-A에 대해 분석하고, CD19 음성 세포(비-B 세포)를 게이팅한다. (F) CD19 음성 세포를 CD4 대 CD8 염색에 대해 검사합니다. (G) 그런 다음 CD4+ 세포를 게이트하여 Indo-1(칼슘 결합)에 대한 시간을 시각화합니다. (H) Indo-1(칼슘 무함유) 대 Indo-1(칼슘 결합) 형광을 시각화하여 항-CD3 항체 첨가 후 칼슘 유입 반응의 개시를 나타내기 위해 순간을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 칼슘 반응의 개별 시점에서 쥐 흉선세포의 게이트 개체군에서 Indo-1 형광의 시각화. 총 흉선 세포는 샘플 수집 6분 후에 항-CD3 항체에 이어 이오노마이신으로 자극되었습니다. Indo-1(칼슘 결합)에 대한 2차원 시간 플롯에 윤곽이 그려진 직사각형 상자에 표시된 바와 같이 4개의 개별 시점에서 흉선 세포의 다른 하위 집단에서 칼슘 반응에 대해 조사되었습니다. (A) 기준선 Indo-1 신호에 대한 게이팅, 피크 반응, 피크 후 5분 반응 및 이오노마이신에 대한 반응을 보여주는 2차원 플롯. 각 플롯 아래에는 게이트 CD4 단일 양성(SP) 흉선세포에 대한 CD4 대 CD8 염색(왼쪽)과 Indo-1(칼슘 무함유) 대 Indo-1(칼슘 결합)의 플롯이 나와 있습니다. (B) 흉선 세포의 개폐 하위 집합에 대한 Indo-1(칼슘 없음) 대 Indo-1(칼슘 결합)의 플롯은 (A)에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 4개의 시점 각각에 표시됩니다. (C) 표시된 항체로 전체 흉선 세포의 염색을 보여주는 2차원 플롯이 생성되었습니다. 특정 하위 집합(맨 위 줄)을 게이트하고 시간 대비 칼슘 반응(아래)을 조사했습니다. 연한 파란색(SP) CD8+ 개체군, 칼슘 유입이 가장 큰 빨간색(SP) CD4 개체군, 주황색 CD4+CD8+ 이중 양성 흉선세포, 짙은 녹색 iNKT 세포, 연한 녹색 CD25+, 보라색 TCRγδ+ T 세포 및 검은색 CD19+ B 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ITK/RLK의 소분자 억제제로 처리된 CD8+ T 세포에서 칼슘 반응 억제. Indo-1 염료 로딩 동안, 비장 세포는 PRN694, 100 nM (짙은 회색) 및 200 nM (밝은 회색)의 두 가지 용량으로 처리 되었다. (A) Indo-1 비율(칼슘 결합/칼슘 무함유)은 처리되지 않은 세포(빨간색) 및 PRN694로 처리된 세포에 대한 시간 대비 표시됩니다. 곡선은 개폐된 CD8+ T 세포의 칼슘 반응을 보여줍니다. 검은색 선은 Indo-1이 로드되고 표면이 염색되었지만 항-CD3 항체로 자극되지 않은 비장 세포의 음성 대조군을 나타냅니다. (나,씨) 데이터는 (A)에 표시된 시간 축을 8개의 세그먼트로 나누고 검은색 점선으로 시각화한 후 곡선 아래 면적(AUC)(B) 또는 각 곡선의 기울기(기울기)(C)를 응답의 각 시간 간격에서 계산하여 분석할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석 7,8을 사용하여 적정된 Indo-1 비율계량 지표 염료가 로드된 1차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계된 최적화된 분석을 설명합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 칼슘 플럭스 분석을 수행하는 이점은 Indo-1 형광 평가와 함께 표면 세포 마커 염색을 멀티플렉싱할 수 있다는 것입니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석은 고도로 중첩되는 염료를 사용할 수 있어 패널에 사용할 수 있는 마커의 수를 늘릴 수 있다는 장점이 있습니다. 이는 전체 스펙트럼 유세포 분석기가 하나의 형광 색소 전용 검출기를 사용하는 것이 아니라 분석된 각 샘플에 대해 검출기 어레이에서 방출되는 모든 레이저 광을 수집하기 때문입니다. 각 형광체의 전체 스펙트럼을 사용하면 분석의 감도를 높일 수 있으며 대역 통과 유세포 분석기에서 수집할 경우 중첩 신호를 가질 수 있는 스펙트럼적으로 고유한 형광색소를 식별할 수 있는 수단을 제공합니다. 이것은 또한 조사 중인 세포 하위 집합의 사전 분리에 대한 필요성을 제거합니다.
이 연구에서, 세포 표면 마커 패널은 형광 색소 접합 항체로 평가되었다. 이 패널에는 αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 및 CD1d-αgal-cer 사량체-APC가 포함되었습니다. 또한 패널에는 살아있는 죽은 Ghost540 염료가 포함되었습니다. 이러한 형광색소 각각을 검출하기 위한 최적의 채널은 전체 스펙트럼 유세포 분석기 사용자 매뉴얼(13)에서 확인할 수 있습니다. 대조적으로, Indo-1(칼슘 무함유) 및 Indo-1(칼슘 결합)의 검출은 경험적으로 결정되었지만, 각 형광 시그니처의 검출을 위한 대략적인 피크 채널은 Indo-1의 두 가지 형태에 대해 알려진 피크 방출 파장을 기반으로 추정되었습니다. 또한 기존 유세포분석기에서 사용되거나 nm 단위로 측정된 대역통과 필터 파장에서 피크 방출 파장을 전체 스펙트럼 유세포분석기에서 사용하는 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기의 해당 채널로 변환할 수 있습니다. 이것은 또한 각각 Indo-1(칼슘 무함유) 및 Indo-1(칼슘 결합)을 검출하기 위한 최적의 채널 추정치를 제공할 수 있습니다. 각 형광 태그에 대해 단일 염색 대조군이 포함되어 있기 때문에 혼합 해제 공정은 형광 시그니처를 디콘볼루션하여 각 샘플의 세포에서 각 형광색소의 강도를 시각화할 수 있습니다. 이 방법에 설명된 바와 같이, 데이터 분석은 관심 있는 세포 하위 집합에 대한 게이팅하고 검출 Indo-1(칼슘 무함유) 및 Indo-1(칼슘 결합) 대 시간의 비율을 시각화하여 수행할 수 있습니다.
이 분석에는 한계가 있습니다. 예를 들어, 1μM 미만의 Indo-3 농도는 T 세포에서 칼슘 유입 반응을 성공적으로 시각화할 수 없었습니다. 이 분석은 또한 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 이질적인 세포 집단에 대한 다중 세포 표면 마커 분석과 함께 칼슘 반응의 다중 측정을 수용하기 때문에 단일 염색 대조군에 사용되는 항체를 포함하여 사용된 모든 형광 표지 항체를 신중하게 적정하는 것이 필수적입니다. 이는 고감도 선형 언믹싱 알고리즘(14)의 성공적인 구현에 중요하다. 또한, 칼슘 유입의 완전한 시간 경과는 분석되는 전체 집단의 1% 미만을 나타내는 세포 하위 집합에 대해 시각화할 수 없었습니다. 대신, 이러한 희귀 하위 집합에서 칼슘 반응을 평가하려면 순간15을 사용하는 대체 분석 전략이 필요했습니다. 시간 분석의 순간은 반응의 전체 시간 경과가 아닌 칼슘 반응의 개별 단계에서 Indo-1(칼슘 무함유) 대 Indo-1(칼슘 결합)의 형광 신호에 대한 스냅샷을 제공합니다. 마지막으로, T 세포의 하위 집합을 정의하기 위해 단일 표면 마커를 사용하는 것의 한계를 인식하는 것도 중요합니다. 예를 들어, α-CD25 항체로 흉선 세포를 염색하는 것만으로는 CD4+ 조절 T 세포를 다른 모든 흉선 세포 집단과 구별하기에 충분하지 않습니다. 이것은 초기 흉선 세포 전구 세포 (CD4-CD8-) 세포의 대부분이 CD2516을 발현한다는 사실 때문입니다. 이것은 개폐 CD4+CD25+ 흉선 세포에서 검출 가능한 칼슘 유입 반응이 없는 것을 설명할 가능성이 있습니다.
이 프로토콜의 최적화를 위해서는 분석 성공의 핵심인 몇 가지 변수에 대한 신중한 평가가 필요했습니다. 여기에는 사용된 항-CD3 항체의 특이적 클론 최적화, 이 항체의 최적 농도 적정, 기존 비오틴/스트렙타비딘 시스템을 사용한 항체 가교의 필요성이 포함됩니다. 쥐 T 세포의 경우, 500 μL 부피의 6 x 106 세포에 대한 30 μg/샘플의 농도가 최적의 칼슘 반응에 필요한 항체의 최소량인 것으로 밝혀졌습니다. 흥미롭게도, 강력한 칼슘 반응은 항 -CD3 항체 클론 17A2에서 관찰되었지만 클론 145-2C11에서는 관찰되지 않았습니다. 또한, 클론 17A2를 사용할 때, 2차 가교 시약을 첨가하는 것은 불필요하였다17. 스트렙타비딘을 포함하거나 포함하지 않는 비오티닐화 항-CD3 클론 17A2를 사용한 시험은 스트렙타비딘 가교결합의 존재 하에서 칼슘 반응의 향상을 나타내지 않았다. 이 항체가 응집체를 포함하고, 이들 응집체가 명백한 가교결합이 없을 때 항체의 자극 효능을 설명했을 가능성이 있다. 그러나 이러한 실험이 이 항-CD3 항체의 다른 바이알을 사용하여 수개월에 걸쳐 수행되었기 때문에 얻은 결과는 재현성이 높았습니다. 따라서 T 세포를 자극하는 이 항체의 능력은 사용자에 따라 다를 수 없습니다.
일차 T 세포에서 강력한 칼슘 반응은 샘플 획득 전반에 걸쳐 세포를 37°C의 생물학적 온도로 유지해야 합니다. 대조적으로, 일차 B 세포는 실온에서 항-IgM 항체에 대한 칼슘 반응을 보일 것입니다. 온도에 대한 T 세포 칼슘 반응의 민감도에 따라 각 샘플이 동일하게 처리되도록 하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 각 샘플은 동일한 방법과 동일한 시간 동안 37°C로 가열해야 합니다. 이러한 일관성이 없는 경우 칼슘 반응의 변화가 관찰될 수 있지만 샘플 간의 생물학적으로 관련된 차이를 나타내지 않을 수 있습니다.
요약하면, 이 프로토콜은 다중 표면 세포 마커 염색과 함께 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 Indo-1 형광 평가를 기반으로 칼슘 플럭스 분석을 수행하는 세부 사항을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자는 칼슘 염료 표지 전에 특정 세포 집단을 분리하거나 분류할 필요가 없습니다. 또한, 이 프로토콜은 별개의 세포 하위 집단 내에서 이산 순간에 칼슘 반응을 시각화하는 데 사용되는 추가 분석 방법론을 설명합니다. 시간 모멘트 분석은 희귀한(전체의 <1%) 세포 집단에 성공적으로 적용될 수 있으며, 칼슘 반응 곡선 전체를 평가할 때 검출할 수 없습니다. 앞으로 이 분석은 전체 스펙트럼 유세포 분석기의 광범위한 기능을 활용하여 추가 형광 색소 결합 항체의 사용으로 확장될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro 유세포 분석 공유 리소스, RRID:SCR_021321, Aurora 및 SpectroFlo 소프트웨어에 대한 전체 스펙트럼 세포 분석 분석에 대한 지속적인 논의를 해주신 Cytek의 동료들에게 깊은 감사를 드립니다. 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
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