Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ارتفاع الحرارة الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي: طريقة علاج مجدية في نموذج الساركوما العضلية المخططة للفئران

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64544
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 3,4, 5, 5, 1,2, 6, 6, 7, 3,8, 3,9, 1,3,4,10, 1,2,10
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children, 4Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 6Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary, 7Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 8Department of Medical Imaging, University of Toronto, 9Department of Pediatric Surgery, University of Toronto, 10Department of Surgery, University of Toronto

ERRATUM NOTICE

Summary

يظهر هنا بروتوكول لاستخدام ارتفاع الحرارة المتحكم فيه ، الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي ، لتحفيز إطلاق الدواء من الجسيمات الشحمية الحساسة للحرارة في نموذج فأر الساركوما العضلية المخططة.

Abstract

الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي (MRgHIFU) هي طريقة راسخة لإنتاج ارتفاع الحرارة الموضعي. نظرا للتصوير في الوقت الفعلي وتعديل الطاقة الصوتية ، تتيح هذه الطريقة التحكم الدقيق في درجة الحرارة داخل منطقة محددة. يتم استكشاف العديد من التطبيقات الحرارية باستخدام هذه التكنولوجيا غير الغازية وغير المؤينة ، مثل توليد ارتفاع الحرارة ، لإطلاق الأدوية من ناقلات الجسيمات الشحمية الحساسة للحرارة. يمكن أن تشمل هذه الأدوية العلاجات الكيميائية مثل دوكسوروبيسين ، والتي يكون إطلاقها المستهدف مرغوبا فيه بسبب الآثار الجانبية الجهازية التي تحد من الجرعة ، وهي السمية القلبية. دوكسوروبيسين هو الدعامة الأساسية لعلاج مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة ويستخدم عادة في الساركوما العضلية المخططة المنتكسة أو المتكررة (RMS). RMS هو الورم الرخو خارج الجمجمة في الأنسجة الصلبة الأكثر شيوعا لدى الأطفال والشباب. على الرغم من العلاج العدواني متعدد الوسائط ، ظلت معدلات البقاء على قيد الحياة RMS كما هي على مدى السنوات ال 30 الماضية. لاستكشاف حل لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، تم تطوير بروتوكول تجريبي لتقييم إطلاق دوكسوروبيسين الشحمي الحساس للحرارة (TLD) في نموذج فأر RMS متوافق مع المناعة باستخدام MRgHIFU كمصدر لارتفاع الحرارة لإطلاق الدواء.

Introduction

الساركوما العضلية المخططة (RMS) هي ورم عضلي هيكلي يحدث بشكل شائع عند الأطفال والشباب1. غالبا ما يتم علاج المرض الموضعي بالعلاج متعدد الوسائط ، بما في ذلك العلاج الكيميائي والإشعاع المؤين والجراحة. استخدام أنظمة العلاج الكيميائي متعدد الأدوية أكثر انتشارا في مرضى الأطفال ، مع نتائج محسنة مقارنة بنظرائهم البالغين2 ؛ ومع ذلك ، على الرغم من الجهود البحثية المستمرة ، لا يزال معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات عند حوالي 30 ٪ في الشكل الأكثر عدوانية من المرض 3,4. معيار الرعاية الكيميائي هو نظام متعدد الأدوية يتضمن فينكريستين وسيكلوفوسفاميد وأكتينومايسين د. في حالات المرض الانتكاسي أو المتكرر ، يتم استخدام العلاجات الكيميائية البديلة ، بما في ذلك دوكسوروبيسين القياسي (الحر) (FD) وإيفوسفاميد1. في حين أن كل هذه العلاجات الكيميائية لها سمية جهازية ، فإن السمية القلبية للدوكسوروبيسين تفرض قيودا على الجرعة مدى الحياة 5-7. لزيادة كمية الدواء الذي يتم تسليمه إلى الورم وتقليل السمية الجهازية ، تم تطوير تركيبات بديلة ، بما في ذلك تغليف الدهون. يمكن أن تكون هذه دوكسوروبيسين غير حساس للحرارة ، والذي تمت الموافقة عليه لعلاج سرطان الثدي وسرطان الخلايا الكبدية ، أو دوكسوروبيسين حساس للحرارة ، والذي تجري التجارب السريرية له8،9،10،11،12،13. تم تقييم الطرق البديلة لتوصيل الأدوية المغلفة بالجسيمات الشحمية مثل الجسيمات الشحمية متعددة الحويصلات والجسيمات الشحمية المستهدفة لليجند وتظهر نتائج واعدة لعلاج الأورام9. في هذه الدراسة ، فإن إضافة الحرارة لها تأثيرات متعددة العوامل ، بما في ذلك إطلاق الدواء14. إن الجمع بين ارتفاع الحرارة (HT) الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي (MRgHIFU) ودوكسوروبيسين الشحمي الحساس للحرارة (TLD) هو نهج علاجي جديد متعدد الوسائط لاستخدام هذا الدواء السام والفعال لعلاج RMS ، مع تقليل السمية التي تحد من الجرعة وربما زيادة الاستجابة المناعية للورم.

يطلق دوكسوروبيسين بسرعة من TLD عند درجات حرارة >39 درجة مئوية ، أعلى بكثير من متوسط درجة حرارة جسم الإنسان البالغ 37 درجة مئوية ولكنه ليس مرتفعا بما يكفي للتسبب في تلف الأنسجة أو الاجتثاث ؛ يبدأ هذا في الحدوث عند 43 درجة مئوية ، ولكنه يحدث بسرعة أكبر مع اقتراب درجات الحرارة من 60 درجة مئوية15. تم استخدام طرق مختلفة لتوليد HT في الجسم الحي ، بما في ذلك الليزر وأفران الميكروويف والاجتثاث بالترددات الراديوية والموجات فوق الصوتية المركزة ، والعديد منها طرق تسخين غازية16. MRgHIFU هي طريقة تسخين غير جراحية وغير مؤينة تسهل إعدادات درجة الحرارة الدقيقة داخل الأنسجة المستهدفة في الموقع. يوفر التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) بشكل حاسم التصوير في الوقت الفعلي ، حيث يمكن استخدام برامج الكمبيوتر ، لحساب قياس الحرارة للأنسجة طوال فترة العلاج. بعد ذلك ، يمكن استخدام هذه البيانات للتحكم في العلاج بالموجات فوق الصوتية في الوقت الفعلي للوصول إلى نقطة ضبط درجة الحرارةالمطلوبة 17 والحفاظ عليها. تم اختبار MRgHIFU في أنواع مختلفة من الأنسجة ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من علاجات درجة الحرارة ، من HT الخفيف إلى الاستئصال ، وكذلك سريريا لعلاج النقائل العظمية المؤلمةبنجاح 18. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن HT يسبب السمية الخلوية للورم ، ويعدل تعبير البروتين ، ويغير الاستجابة المناعية في البيئة المكروية للورم19،20،21،22. جمعت إحدى الدراسات بين HT الخفيف و TLD ، يليه الاستئصال باستخدام MRgHIFU ، في نموذج الفئران R1التآزري 23 ، مما أدى إلى نخر في قلب الورم وتوصيل الدواء إلى الأطراف. تقليديا ، تم استخدام العلاج الإشعاعي كعلاج مساعد لتلف الخلايا السرطانية وتقليل تكرار المرض الموضعي. ومع ذلك ، فإن استخدامه محدود بسبب الجرعات مدى الحياة والضرر خارج الهدف1. وبالتالي ، فإن HT فريد من نوعه من حيث أنه يمكن أن يسبب بعض التأثيرات نفسها دون نفس السمية أو القيود.

تشمل النماذج الحيوانية قبل السريرية ل RMS نماذج الكفاءة المناعية الاصطناعية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) في المضيفين الذين يعانون من نقص المناعة. في حين أن النماذج التي تعاني من نقص المناعة تسمح بنمو الأورام البشرية ، إلا أنها تفتقر إلى البيئة المكروية المناسبة للورم ومحدودة في قدرتها على دراسة الاستجابة المناعية24. تعد الطفرة المنشطة ل FGFR4 علامة واعدة لسوء التشخيص وهدفا علاجيا محتملا في RMS 1,25 للبالغين والأطفال. في نماذج RMS syngeneic التي تم تطويرها في مختبر Gladdy ، تكون الأورام قادرة على النمو في مضيف مناعي ، والذي يطور استجابات مناعية فطرية وتكيفية للورم26. نظرا لأن HT يؤثر على الاستجابة المناعية ، فإن ملاحظة التغيير في الاستجابة المناعية للفئران هي ميزة قيمة لنموذج الورم هذا. لاختبار كل من استجابة الورم ل TLD مقارنة ب FD ، بالإضافة إلى التغيير في الاستجابة المناعية للورم لكل من العلاج الكيميائي و HT ، تم تطوير بروتوكول واستخدامه لعلاج أورام الفئران الاصطناعية RMS في الجسم الحي باستخدام MRgHIFU و TLD ، وهو محور هذه الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للجان رعاية الحيوان مع بروتوكولات استخدام الحيوانات المعتمدة تحت إشراف طبيب بيطري مشرف في مرافق البحوث الحيوانية لمركز الظواهر (TCP) ومركز الموارد الحيوانية التابع لشبكة الصحة الجامعية (UHN). تم تنفيذ جميع الإجراءات ، باستثناء MRgHIFU ، التي تشمل الحيوانات في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) لتقليل تعرض الحيوانات للهواء الخارجي أو العدوى الحساسة.

1. تربية الفأر

ملاحظة: تم تضمين ما مجموعه 65 فأرا (السلالة B6.129S2-Trp53tm1Tyj / J) في الدراسة التجريبية (ذكر: ن = 23 ؛ أنثى: ن = 42). تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث في عمر 7-9 أسابيع. تم فطام صغارهم وتصنيفهم الجيني ، وتم استخدام الفئران غير المتجانسة p53 في التجارب.

  1. إيواء اثنين من الفئران الإناث مع كل فأر ذكر لإنشاء أقفاص تربية. احسب أعمار صغارهم منذ الولادة (الولادة = اليوم 0).
  2. في اليوم 10 ، حدد الجراء بشق الأذن. اجمع قصاصات الذيل للتنميط الجيني قبل حقن خط الخلية.

2. التنميط الجيني للفأر

  1. استخرج الحمض النووي من قصاصات الذيل التي تم جمعها مقاس 2 مم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي ونقاوته عن طريق قياس الامتصاص عند 260-280 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد).
  3. أداء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
    1. قم بإنشاء مزيج رئيسي يحتوي على مزيج PCR تجاري (يحتوي على Taq polymerase و dNTPS و MgCl 2 ؛ انظر جدول المواد) ، والتمهيدي ، و dH2O بنسبة 12.5: 0.25: 10.75 (μL) للعدد المطلوب من العينات. أضف 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي إلى كل أنبوب PCR وقم بتضمين dH2O ، وعينة فارغة (متماثل الزيجوت لطفرة p53) ، وعينة متغايرة الزيجوت (متغاير الزيجوت لطفرة p53) ، وعينة من النوع البري (متماثل الزيجوت ل p53 العادي) كضوابط PCR.
    2. أضف 24 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب PCR يحتوي على الحمض النووي. ماصة المحلول في كل أنبوب PCR لأعلى ولأسفل لتوزيع الحمض النووي في جميع أنحاء المزيج الرئيسي.
    3. ضع أنابيب التفاعل في دورة حرارية وقم بتدويرها وفقا للمواصفات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، ثم احتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتحليل على الجل.
  4. تحليل منتجات PCR باستخدام هلام الاغاروز الكهربائي.
    1. تحضير هلام 2 ٪ (50 مل من 1x TAE و 1 غرام من الأغاروز) عن طريق تسخين الأغاروز في TAE والخلط حتى يذوب. عندما تبرد ولا تزال سائلة ، أضف 2.5 ميكرولتر من صبغة هلام الحمض النووي إلى الأغاروز واخلطها. يلقي الجل في صندوق هلام مع مشط. ضع الجل في الجهاز الكهربائي (انظر جدول المواد) وقم بتغطيته ب 1x TAE.
    2. تحميل 10 ميكرولتر من 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي على الجل. تحميل 12.5 ميكرولتر من كل عينة. قم بتشغيل الجل لمدة 25 دقيقة عند 135 فولت.
    3. قم بتصوير الجل باستخدام الإعدادات المناسبة لصبغة هلام الحمض النووي المستخدمة على جهاز تصوير هلام (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

3. إعداد نموذج الورم (الشكل 1)

  1. قم بزراعة خط خلايا M25FV24C (الممر 12-15) قبل أسبوع واحد من تاريخ الحقن في وسائط نمو كاملة (وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] مع إضافات: 10٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 2 مللي مول L-alanyl-L-glutamine dipeptide) في دورق 75 مل ، عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بمجرد أن تصبح الخلايا ~ 80٪ متقاربة ، قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا 1x مع 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
    ملاحظة: M25FV24C هو خط خلايا الفئران المصمم للتعبير المفرط عن FGFR4V550E الطافر ، والذي لوحظ في RMS 1,26 للأطفال والبالغين.
  2. ارفع الخلايا بإضافة 0.5 مل من محلول التربسين 0.25٪ إلى جانب اللوحة واحتضان الوعاء لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تظهر الخلايا منفصلة ، أضف 2.5 مل من وسائط النمو الكاملة في درجة حرارة الغرفة لتعطيل التربسين. استخدم حصة عينة 10 ميكرولتر لتحديد تركيز الخلية للخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم واستبعاد التريبان الأزرق.
  3. قم بإعداد الحجم الصحيح للخلايا المعلقة DPBS للحقن ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل: الحجم إلى جهاز الطرد المركزي = (عدد الفئران × عدد الخلايا لكل فأر) / (تركيز الخلايا) ، حيث عدد الفئران = الفئران المراد حقنها + 10 فئران إضافية للخطأ ، وعدد الخلايا لكل فأر = 104.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 153 × جم. أعد تعليق حبيبات الخلية بالحجم المناسب (10 ميكرولتر لكل فأر × عدد الفئران) من المخزن المؤقت لحقن العضل (وسائط F10 + 0.5٪ FBS) وحقن الفئران في غضون 1 ساعة من تحضير هذا التعليق.

4. حقن الخلايا العضلية

ملاحظة: يتم حقن خلايا M25FV24C في الطرف الخلفي الأيمن للفئران التي يتراوح عمرها بين 4 و 6 أسابيع. ينتج عن الحقن في 4 أسابيع فأرا صغيرا مصابا بورم قد يكون من الصعب علاجه نظرا لوجود أنسجة محيطة أقل لتشتت HT. الانتظار حتى 6 أسابيع ينتج عنه فأر أكبر ، مما يسهل علاج الورم.

  1. اقلب تعليق الخلية عدة مرات قبل الشفط للمساعدة في توزيع الخلايا بالتساوي داخل المحلول. نضح 10 ميكرولتر (104 خلايا) باستخدام حقنة ميكرولتر (انظر جدول المواد). الماوس. بمجرد ضبط النفس ، يمكن الوصول إلى عضلات الفخذ الذيلية عن طريق تمديد الساق الخلفية. حلق الساق باستخدام كليبرز وامسح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. حقن معلق الخلايا M25FV24C (10 ميكرولتر ، 10 4 خلايا) في عضلات الفخذ الخلفي الأيمن لفأر يبلغ من العمر4-6 أسابيع باستخدام حقنة ميكرولتر محكمة الغلق بإبرة 26 ثانية.
    ملاحظة: يجب إدخال الإبرة بالتوازي مع عظم الفخذ باتجاه الركبة ، مع الحرص على عدم إصابة العصب الوركي. أدخل فقط نقطة الإبرة (حوالي 2 مم) بسبب كتلة العضلات الصغيرة للطرف الخلفي.
  3. إدارة الحل في حركة ثابتة. قم بإزالة الإبرة وتأكد من عدم حدوث نزيف. أعد الماوس إلى قفص ثان.
  4. تقييم الحيوانات يوميا ومراقبة أطرافها الخلفية لنمو الورم من خلال الجس. القتل الرحيم للفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون إذا واجهت أي من نقاط النهاية المبكرة التالية: حجم الورم الذي يتجاوز قطره 1.5 سم ، أو تقرح الورم ، أو العلامات الجهازية للمرض (الانتصاب ، أو الموقف المنحني ، أو الخمول ، أو انخفاض تناول الطعام أو الماء).

5. فحص التصوير بالرنين المغناطيسي

  1. تخدير الماوس ، إلى مستوى لا توجد فيه حركة مع ضغط مخلب ، مع isoflurane تحت المعلمات التالية: حث في غرفة مع 4 ٪ في 1.5 LPM ، ثم نقل إلى مخروط الأنف على مزلقة الماسح الضوئي التصوير بالرنين المغناطيسي ومواصلة صيانة isoflurane على مخروط الأنف مع 1.5 ٪ -2 ٪ في 0.75 LPM. نعلق جهاز مراقبة الجهاز التنفسي. استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  2. تخيل الماوس المخدر باستخدام ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي (انظر جدول المواد). في الصورة المرجحة T2 (اكتساب Ax_Screen ، الجدول 1) ، لاحظ الأبعاد داخل المستوى وعدد الشرائح المحورية التي يظهر الورم بداخلها. لاحظ موقع الورم في إشارة إلى عظم الفخذ والسطح الجانبي للفخذ ، حيث تدخل الموجات فوق الصوتية.
    ملاحظة: يظهر الورم ككتلة شديدة داخل العضلات غير متماثلة من الجانب الآخر. حجم الورم الأولي الجيد للعلاجات المتعددة هو 2 مم × 2 مم × 2 مم للدراسات الحادة أو دراسات البقاء على قيد الحياة. إذا كان أكبر من ذلك بكثير ، فسيكون جيدا فقط للدراسات الحادة حيث سيصل الورم إلى نقطة نهاية الحجم قبل إكمال ثلاثة علاجات أسبوعية. تشمل معايير الاستبعاد لعلاج HIFU: ملفوفة حول عظم الفخذ ، قريبة جدا من عظم الفخذ ، خلفية جدا على الماوس ، وسطية لعظم الفخذ ، قريبة جدا من المستقيم.
  3. قم بإزالة الماوس من الماسحة الضوئية واحصل على وزن أساسي. احلق الفأر من منتصف جسمه إلى أقدامه تحت التخدير باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يتم الحلاقة قبل 1 يوم من العلاج ، لأنها تسمح للفأر بأداء الاستمالة مما يسمح لكريم مزيل الشعر بالعمل بكفاءة أكبر.
  4. استعادة الماوس في BSC ، وذلك باستخدام وسادة التدفئة تحت أحد طرفي القفص. أعد الفأر إلى قفصه عندما يستعيد الاستلقاء القصي.

6. التجربة: إعداد الحيوانات يوم علاج HIFU

  1. لتحضير نظام HIFU ذو التجويف الصغير (انظر جدول المواد) ، قم بتشغيل المولد واملأ محول الطاقة بما يكفي من الماء منزوع الأيونات حتى يتم توسيع الغشاء أسفل محول الطاقة ، ولكن ليس صلبا لدرجة أنه سيضغط الماوس. قم بإزالة الغاز من الماء في دائرة محول الطاقة لمدة 30 دقيقة لإزالة الأكسجين المذاب من الوسط.
  2. قم بإعداد نظام الكمبيوتر المرتبط.
    1. قم بتشغيل الكمبيوتر المتحكم وتأكد من توصيله عبر إيثرنت بمولد HIFU وعبر USB بشاشة المسبار الحراري. ابدأ تشغيل البرنامج وانقر فوق Home to home محول الطاقة قبل إدخال الماوس.
    2. معايرة مجسات الألياف الضوئية الحرارية: احصل على درجات حرارة الغرفة الأساسية ولاحظ تغير درجة الحرارة في غرفة التصوير بالرنين المغناطيسي. لاحظ حجم انحراف درجة الحرارة لكل مسبار بسبب شدة المجال المغناطيسي. أدخل مسبار درجة حرارة أنبوب الانجراف في أنبوب زجاجي مملوء بالجادولينيوم لمعايرة درجة الحرارة أثناء المسح وتأمين أنبوب الانجراف بشريط.
      ملاحظة: تتم إضافة درجة حرارة الغرفة الأساسية (أنبوب الانجراف) يدويا كمعلمة قياس الحرارة في واجهة المستخدم الرسومية في البرنامج. يتم تعيين منطقة الاهتمام (ROI) داخل أنبوب الانجراف في صورة MR لاكتشاف أي انحراف في درجة الحرارة وسيقوم تلقائيا بتصحيح صور قياس الحرارة.
    3. اسحب الدواء المراد حقنه في حقنة سعة 1 مل وضعه في مضخة التوصيل الأوتوماتيكية (انظر جدول المواد). قم بتجهيز الخط الذي سيتصل بقسطرة الوريد الخلفي للفأر حتى يملأ الدواء الخط بالكامل عن طريق الضغط على زر التسليم اليدوي في مضخة التوصيل التلقائي.
    4. استخدم مصباح حراري لتدفئة الفئران في الأقفاص لمدة ~ 20 دقيقة قبل نقلها إلى غرفة التخدير.
      ملاحظة: التسخين المسبق يعزز توسع الأوعية ، والذي سيتم مواجهته بمجرد تخدير الفأر ويساعد في وضع القسطرة.
  3. تخدير الفأر بالإيزوفلوران (الحث: 4٪ عند 1.5 LPM ؛ الصيانة: 1.5٪ -2٪ عند 0.75 LPM) ونقله إلى مخروط الأنف. ضع مادة تشحيم القرنية على العينين لمنع التلف بسبب عدم وجود منعكس وميض تحت التخدير.
  4. ضع كريم مزيل الشعر على المنطقة المحلوقة ، بما في ذلك الطرف الخلفي الأيمن بالكامل ، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لإزالة الشعر.
    ملاحظة: ضع الماوس تحت مصباح حراري أثناء وجودك في BSC للمساعدة في التنظيم الحراري أثناء إزالة الشعر تحت التخدير.
  5. بعد غسل كريم مزيل الشعر بالماء الدافئ ، قم بوزن الماوس على مقياس رقمي وسجل جرعات الدواء.
  6. حرك الماوس إلى مخروط أنف متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي على زلاجة التصوير بالرنين المغناطيسي. ضع مصباحا حراريا على الماوس لإبقائه دافئا أثناء التحضير للتصوير بالرنين المغناطيسي. ضع الفأر في وضع الاستلقاء الجانبي مع الجانب غير الحامل للورم لأسفل والورم العلوي داخل حامل فأر مطبوع 3D على الزلاجة (الشكل التكميلي 1 والشكل 2). تأكد من تحديد الموضع الصحيح للورم (أي في وسط الملف أفقيا ورأسيا ، مع الارتفاع فوق حواف حامل الماوس مباشرة لحساب الضغط بواسطة محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، قم بقص قطعة وسادة جل مضغوطة بالموجات فوق الصوتية لوضعها تحت الماوس ، مع تبطين الجزء السفلي من الحامل ، بسمك لتسوية الورم إلى أعلى الحامل.
  7. ضع الساق غير المصابة بعيدا عن ساق الورم ، إما تحت الماوس أو ممتدة مع ثني ساق الورم. تأكد من أن القدمين ليست في المجال القريب أو المجال البعيد للورم ومسار شعاع الموجات فوق الصوتية. ضع المصباح الحراري على بعد 15 سم من الذيل للتدفئة لإدخال القسطرة في الوريد الخلفي.
  8. أدخل مسبار درجة حرارة المريء.
    1. خيط مسبار المريء من خلال مخروط الأنف عنق الفأر. قم بإمالة أنف الفأر لأعلى لإنشاء خط من فمه مباشرة إلى بطنه عن طريق تمديد الرأس. حرك المسبار الحراري فوق اللسان حوالي 0.5 سم في مريء الفأر واستبدل مخروط الأنف حول أنف الفأر. قم بتأمين مسبار المريء ومخروط الأنف في الجزء العلوي من الزلاجة.
      ملاحظة: راقب علامات الضائقة التنفسية مباشرة بعد إدخالها حيث يمكن إدخالها بشكل غير صحيح في القصبة الهوائية.
  9. أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم.
    ملاحظة: يجب أن تكون مجسات درجة حرارة المستقيم والمريء في حدود 3 درجات مئوية من بعضها البعض.
  10. ضع جهاز مراقبة الجهاز التنفسي مع كابل التوصيل باتجاه رأس الماوس حتى لا يتداخل مع وضع محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية. آمن بشريط لاصق.
  11. أدخل قسطرة وريد ذيل إبرة الفراشة 27 جيجا في وريد ذيل جانبي متصل بالأنابيب الدقيقة مع 20 ميكرولتر من المساحة الميتة والشريط اللاصق بإحكام. بعد التسجيل ، تأكد من أن القسطرة لا تزال تتدفق جيدا.
  12. استخدم شخصين لحمل الماوس المجهز ، وزلاجة الماوس ، وخط التخدير ، وخط الجهاز التنفسي ، وقسطرة الوريد الخلفي ، وأسلاك المسبار الحراري في ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي ، ووضعها في حامل زلاجة التصوير بالرنين المغناطيسي.
  13. اطلب من مشغل برنامج HIFU (انظر جدول المواد) تحريك الغضروف المفصلي لمحول الطاقة مباشرة فوق الورم عن طريق الفحص البصري للمحاذاة الأولية27. ضع مادة تشحيم العين أو جل الموجات فوق الصوتية المنزوع الغازات على الجلد الخالي من الشعر فوق الورم وقم بإقران محول HIFU بمنطقة الورم.
  14. قم بتوصيل خط توصيل الدواء من المضخة الأوتوماتيكية إلى قسطرة الوريد الذيل. احسب مقدار المساحة الميتة في خط الوريد الخلفي وخط الاتصال. حرك الماوس HIFU الزلاجة على قضبان التصوير بالرنين المغناطيسي في وسط التصوير بالرنين المغناطيسي.
  15. اضبط كمية ضخ الدواء على المضخة ، اعتمادا على نوع الدواء وتركيزه ووزن الحيوان ، وأضف مقدار المساحة الميتة. اضبط المضخة على معدل ضخ 200 ميكرولتر / دقيقة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام FD و TLD بتركيز 2 ملغم / مل وجرعة 5 ملغم / كغم من وزن الجسم.
  16. سجل درجات حرارة المسبار الحراري الأساسي.
  17. ضع جهاز تسخين الهواء بالحمل الحراري (انظر جدول المواد) على الإعداد الأكثر دفئا. وجه الأنبوب الذي ينفخ الهواء نحو الماوس في وسط تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي وثبته بشريط. سيتم تشغيل جهاز الاحترار لاحقا إلى أدنى إعداد له (32 درجة مئوية) لمنع ارتفاع درجة حرارة الماوس أثناء الصوتنة.
  18. الحصول على صور المسح MR (Ax_Loc ، Sag_Loc ؛ الجدول 1) لتحديد موقع الورم لاستهداف صوتنة بما في ذلك العمق. اضبط موضع محول الطاقة وفقا لذلك باستخدام برنامج HIFU عن طريق إدخال مسافة الحركة المطلوبة كما تم قياسها على الصورة ثم النقر فوق اتجاه السهم للتحرك (الشكل 3 أ). لاحظ أيضا موقع أنبوب الانجراف. كرر حسب الضرورة.
  19. تحديد موقع النقطة البؤرية للمحول في المستوى الإكليلي عن طريق إجراء صوتنة "لقطة اختبار" مستمرة قصيرة السعة 5 ثانية × 50 مللي فولت أثناء اكتساب قياس الحرارة Test_Shot (الجدول 1).
  20. قم بمحاذاة صور استطلاع التصوير بالرنين المغناطيسي مع العرض الإكليلي للنقطة البؤرية داخل برنامج HIFU. راجع الصور الخاصة بموقع الورم ، بالنسبة للبنية العظمية والمستقيم ، وراجع موضع محول الطاقة حسب الضرورة.
  21. كرر صوتنة لقطة الاختبار أثناء التصوير الحراري بتسعة تكرار (الجدول 1) لتأكيد ما إذا كان هناك تسخين متساو ودقيق في حجم الورم مع الحد الأدنى من التسخين خارج الهدف. اضبط موقع الشريحة وموقع محول الطاقة وعمق التوجيه ، وتأكد من أداء التسخين من خلال تكرار "لقطات الاختبار" حسب الضرورة.
  22. باستخدام برنامج مراقبة معالجة HIFU ، حدد عائد الاستثمار لمراقبة قياس الحرارة ضمن ملف تعريف التسخين النهائي عن طريق قياس المسافة للتحرك ثم تغيير إحداثيات الشبكة في البرنامج. قم بتعيين عائد استثمار حول أنبوب الانجراف لتصحيح الانجراف. أدخل درجة حرارة خط الأساس بناء على درجة حرارة مسبار المستقيم لقياسات قياس الحرارة. يستخدم نظام HIFU لبدء صوتنة علاج HIFU ومراقبة قياس الحرارة.
  23. افتح مواصفات علاج ارتفاع الحرارة لمدة 20 دقيقة في البرنامج وابدأ الصوتنة بمجرد جمع صور MR المرجعية ويبدأ قياس الحرارة.
  24. قم بإجراء علاج لمدة 20 دقيقة (الشكل 3 ب) أثناء التصوير الحراري (الجدول 1) باستخدام برنامج التحكم المدمج في المشتق النسبي التكاملي (PID). حقن الدواء المحدد في 1.5 دقيقة ، بعد ارتفاع درجة الحرارة في عائد الاستثمار إلى درجة الحرارة المطلوبة (40 درجة مئوية).
  25. مراقبة درجة الحرارة الأساسية طوال فترة العلاج. إذا كانت درجة حرارة المستقيم تزداد بسرعة أثناء العلاج ، فقد تكون هناك حاجة إلى تغيير موضع الماوس لتجنب ارتفاع درجة حرارة المستقيم خلال مدة العلاج التي تبلغ 10 أو 20 دقيقة. توقف عن العلاج إذا ارتفعت درجة حرارة المستقيم إلى >40 درجة مئوية.

7. التجربة: تصوير نموذج الماوس وإجراء صوتنة للدراسات الحادة

  1. بعد الانتهاء من العلاج ، قم بإزالة الماوس من تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يضمن الإرقاء في موقع إدخال قسطرة الوريد الذيل. انقل الماوس إلى BSC وضعه على مخروط الأنف للتخدير المستمر.
  2. ضع الفأر على ظهره على وسادة ماصة زرقاء مع تقييد أطرافه وكشف القلب.
  3. القتل الرحيم للفئران من خلال الاستنزاف عن طريق ثقب القلب يليه إزالة القلب. أخذ الدم على الفور وأجهزة الطرد المركزي لفصل البلازما عند 10621 × جم لمدة 10 دقائق.
  4. إجراء التشريح وتخزين الأعضاء كما هو مطلوب للتحليل. قم بتجميد الأعضاء في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لعدة أشهر أو على المدى الطويل في خزان النيتروجين السائل.
  5. تجانس أنسجة الورم ميكانيكيا عن طريق إضافة فائض تسعة أضعاف (وزن / وزن) من الماء منزوع الأيونات وتحطيم الأنسجة باستخدام خالط ضرب الخرزة. استخرج دوكسوروبيسين من 600 ميكرولتر من الأنسجة المتجانسة عن طريق إضافة 75 ميكرولتر بالتتابع من 300 مجم / مل نترات الفضة ، و 75 ميكرولتر من 10 مللي مول من حمض الكبريتيك ، و 2.5 مل من 1: 1 إيزوبروبانول: كلوروفورم. دوامة لمدة 20 دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية طوال الليل.
  6. لتحضير عينات للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، قم بطرد المحلول من الخطوة 7.5 عند 4500 × جم ، وقم بإزالة طبقة المذيبات العضوية ، وجفف الأيزوبروبانول: الكلوروفورم تحت تيار من غاز النيتروجين. أعد التعليق في 100 ميكرولتر من 2: 1 MeOH:H 2O. قياس تركيز دوكسوروبيسين باستخدام HPLC-MS /MS 28.

8. التجربة: تصوير نموذج الماوس وإجراء صوتنة لدراسات البقاء على قيد الحياة

ملاحظة: لدراسات البقاء على قيد الحياة ، اتبع إجراء إعداد الحيوانات ليوم علاج HIFU (الخطوة 6.1 إلى 6.25).

  1. بعد الانتهاء من العلاج ، ضع الفأر تحت مصباح حراري للسماح له بالتعافي ، ومراقبة تنفسه وحركته حتى يستعيد استلقاء القص. ثم أعد الحيوان إلى قفصه.
    ملاحظة: تأكد من أن نصف القفص يتماشى مع مصباح حراري ، حيث يتأثر التنظيم الحراري للحيوانات بالتخدير والعلاج HT.
  2. راقب الفئران يوميا بحثا عن السلوك وأنماط التغذية ومعدل التنفس بحثا عن أي علامات ضيق.
  3. قم بإجراء العلاجات مرة واحدة أسبوعيا باتباع الخطوات من 6.1 إلى 6.25 لمدة 3 أسابيع متتالية.
  4. مرتين أسبوعيا ، قم بإجراء تصوير التصوير بالرنين المغناطيسي للفئران لقياس الورم. خلال الأسابيع أثناء العلاج ، قم بإجراء فحص واحد بالرنين المغناطيسي وفحص واحد بالموجات فوق الصوتية كل أسبوع. بعد اكتمال العلاج ، قم بإجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية كل أسبوعين.
  5. القتل الرحيم للفأر بعد 60 يوما من الانتهاء من سلسلة العلاجات ، أو عند الوصول إلى نقطة نهاية إنسانية (حجم الورم >1.5 سم3 أو المراضة من الورم) ، يليه التشريح مع إزالة الورم والأعضاء للتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول ارتفاع الحرارة الناتج عن MRgHIFU ، كانت الأورام في الطرف الخلفي قادرة على تسخينها باستمرار إلى درجة الحرارة المحددة المطلوبة طوال مدة العلاج (يوضح الشكل 4 علاجا تمثيليا ، 10 أو 20 دقيقة ، ن = 65). لاعتبار العلاج ناجحا ، كان لا بد من الحفاظ على عائد الاستثمار فوق 39 درجة مئوية لكامل العلاج ، مع اختلاف <6 درجة مئوية طوال فترة العلاج وبدون تسخين الأنسجة غير المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تظل درجة الحرارة الأساسية أقل من 39 درجة مئوية ، بناء على مسبار المستقيم أو درجة حرارة المستقيم الأولية بالإضافة إلى التغير في درجة حرارة مسبار المريء (الشكل التكميلي 2). بمجرد إيقاف صوتنة MRgHIFU ، عاد الورم بسرعة إلى درجة حرارة خط الأساس.

تم استهداف الأورام إلى 40.5 درجة مئوية للوصول إلى درجة حرارة لإطلاق الدواء بسرعة مع تجنب تأثيرات درجة الحرارة التراكمية فوق 43 درجة مئوية. كان متوسط درجة حرارة عائد الاستثمار في جميع الأورام المعالجة 40.6 درجة مئوية (ن = 65) ، مع متوسط الفرق بين الفوكسلالمئوي العاشر و 90 المئوي 4.3 درجة مئوية. كان الانحراف المعياري لمتوسط درجة الحرارة 1.3 درجة مئوية طوال مدة العلاج لكل من العلاجات لمدة 10 و 20 دقيقة (الشكل 5). تحسن معدل نجاح العلاجات لتلبية معايير التضمين بشكل ملحوظ خلال مدة الدراسة من 11٪ إلى 100٪ (الشكل 6).

بعد تحسين بروتوكول العلاج ، تم تقييم مدة ارتفاع الحرارة لفعالية إطلاق الدواء مقارنة بالفئران ذات الحرارة العادية (NT). لتحديد الوقت الأمثل لعلاج ارتفاع الحرارة لمزيد من الدراسات ، تم اختبار فترتين من العلاج: 10 دقائق و 20 دقيقة. تم اختيار هذه الفترات لجدوى الحفاظ باستمرار على الحرارة المعيارية الأساسية وارتفاع حرارة الورم. تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء وقياس الطيف الكتلي (HPLC-MS) لتقييم كمية دوكسوروبيسين في الأورام وتحديد الفرق في تراكم دوكسوروبيسين بين فترات الاختبار. كانت هناك نسبة أعلى بكثير من الجرعة الأولية (٪ ID) من دوكسوروبيسين في الأورام في الفئران المعالجة ب HT + TLD لمدة 20 دقيقة مقارنة بالفئران TLD 20 min NT (الشكل 7 ، q = 0.000108). لم يكن هناك فرق كبير بين مجموعات HT + TLD لمدة 10 دقائق و 20 دقيقة. ومع ذلك ، كان هناك انحراف معياري أكبر في مجموعة العلاج لمدة 10 دقائق مقارنة بمجموعة 20 دقيقة (3.698 مقابل 2.065٪ معرف / غرام من الورم). والجدير بالذكر أن هناك أربع قيم قريبة من الصفر ضمن مجموعة معالجة HT + TLD لمدة 10 دقائق، والتي تمت معالجتها جميعا بدفعة واحدة من TLD. تم تمييز TLD قبل استخدامه في التجارب في الجسم الحي ، كما هو موضح سابقا من قبل Dunne et al.28. باختصار ، تم تمييز TLD من حيث حجمه ، وإمكانات زيتا ، ودرجة حرارة انتقال مرحلة الذوبان ، وتركيز الدواء ، وتم استخدام الجسيمات الشحمية في غضون 72 ساعة من التخزين عند 4 درجات مئوية. على الرغم من أن جميع دفعات TLD قد تم اختبارها قبل الاستخدام ، فمن المحتمل أن تكون الجسيمات الشحمية قد أطلقت دوكسوروبيسين أثناء الإعداد التجريبي ، قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي الحركة أثناء الفحص إلى حسابات درجة حرارة مرتفعة بشكل خاطئ في البرنامج ، وبالتالي انخفاض درجة حرارة الورم مما يؤدي إلى انخفاض إطلاق الدواء. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تحدث القيم المنخفضة بشكل خاطئ إذا لم يتم حقن الدواء مطلقا ، على سبيل المثال ، إذا تمت إزالة قسطرة الوريد الخلفي أو وضعها بشكل غير صحيح. كما رأينا أعلاه ، تضمن إعداد مزلقة التصوير بالرنين المغناطيسي إدخال مسبار درجة الحرارة (المستقيم والمريء) ، وإدخال قسطرة الوريد الخلفي ، ووضع جهاز مراقبة الجهاز التنفسي ، يليه تحريك الزلاجة ، والماوس ، وقسطرة الوريد الذيل ، وثلاثة مجسات لدرجة حرارة الألياف البصرية ، ومراقبة الجهاز التنفسي ، وخطوط التخدير في تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي. هناك نقاط زمنية متعددة خلال هذه العملية يمكن أن يتم فيها إزاحة قسطرة الوريد الذيلي. تم التحكم في ذلك عن طريق فحص تدفق الدم مرة أخرى إلى الخط ، والنزيف من موقع إدخال القسطرة ، وتجمع الأدوية تحت الشريط بعد العلاج ، لكن الخطأ لا يزال احتمالا.

Figure 1
الشكل 1: البروتوكول التجريبي للمعاملات الحيوانية ومجموعات العلاج المرتبطة بها لدراسات مدة HT. تم حقن الفئران بخلايا M25FV24C في أطرافها الخلفية اليمنى ، وتم فحصها لتشكيل الورم باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي بعد 2-3 أسابيع. ثم تم تقسيمها إلى مجموعات الحرارة المعيارية (غير HT) أو مجموعات الحرارة (HT) ، إما مع TLD أو FD على فترات إما 10 أو 20 دقيقة. الاختصار: Dox = دوكسوروبيسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد الماوس أثناء علاج HIFU . (أ) حامل مطبوع 3D (أبيض) مع بطانة مطاطية داخلية (أحمر) وفتحة للسماح بمرور شعاع الموجات فوق الصوتية لتحديد موضع الماوس. (B) إعداد الماوس داخل حامل الماوس المطبوع 3D مع عقد درجة حرارة المستقيم (كابل أخضر) ، قسطرة الوريد الذيل (أبيض) ، ومراقبة الجهاز التنفسي (الأزرق). (ج) وضع الماوس على سرير التصوير بالرنين المغناطيسي HIFU أثناء العملية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الفأر في التصوير بالرنين المغناطيسي أثناء العلاج بالرنين المغناطيسي (MRIgHIFU). (أ) الورم (محاط بدائرة باللون البرتقالي) وأنبوب الانجراف المستخدم لقياس درجة الحرارة المحيطة (محاط بدائرة باللون الأزرق الفاتح) مرئيان. (ب) أثناء المعالجة، يتم تراكب قياس درجة حرارة القياس الحراري على صورة التصوير بالرنين المغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مراقبة درجة الحرارة (درجة مئوية) أثناء العلاج. متوسط درجات الحرارة (الأخضر) ، أعلى 10 في المائة (أحمر) ، وأعلى 90في المائة (سماوي) لجميع voxelsفي عائد الاستثمار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: متوسط درجات الحرارة أثناء العلاج ضمن عائد الاستثمار لكل فأر تم اختباره خلال مرحلة التحسين مع الانحراف المعياري أثناء العلاج. يظهر أيضا متوسط درجة الحرارة الإجمالية والانحراف المعياري أثناء العلاج (برتقالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تحسنت معدلات نجاح علاج ارتفاع الحرارة بمرور الوقت. كان نجاح العلاج يعتمد على معايير التضمين (درجة الحرارة النظامية ، ودرجة حرارة الورم والاختلاف مع عائد الاستثمار ، وعدم التسخين البعيد). الخط الأزرق =٪ من الفئران التي كان علاجها ناجحا. القضبان البرتقالية = عدد الفئران المعالجة ب HT. يشير كل علاج (العلاج 1-6) إلى تاريخ منفصل أجريت فيه التجارب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: كمية دوكسوروبيسين في الورم بعد العلاج بالعقاقير. (أ) تظهر اختبارات Mann-Whitney المتعددة مع تصحيح FDR لإجراء مقارنات متعددة لنتائج HPLC-MS أهمية (q < 0.05) بين كمية دوكسوروبيسين في الورم في مجموعة TLD + HT لمدة 20 دقيقة مقارنة بعنصر التحكم NT. (ب) لم تلاحظ فروق في الورم في مجموعات FD. ٪ ID = النسبة المئوية للجرعة الأولية. = ف < 0.0001. الاختصارات: HT = ارتفاع الحرارة ، NT = normothermia. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم التسلسل Ax_Screen Ax_Loc Sag_Loc Cor_TestShot الحراريات
نوع التسلسل T2w نادرة T2w نادرة T2w نادرة برق برق
اتجاه المحوري المحوري السهمي إكليلي محوري / سهمي
وقت الصدى (مللي ثانية) 40 72 72 6 6
وقت التكرار (مللي ثانية) 3200 4500 4500 39.06 39.06
زاوية الوجه (بالدرجات) 90/180 90/180 90/180 10 10
مجال الرؤية (مم) 28.8 س 28.8 36 س 36 35 س 35 35 س 35
حجم المصفوفة 128 س 128 128 س 128 128 س 128 128 س 128 128 س 128
القرار (مم) 0.225 س 0.225 0.281 س 0.281 0.281 س 0.281 0.273 س 0.273 0.273 س 0.273
رقم الشريحة 20 20 20 3 2
سمك الشريحة (مم) 1 1 1 1.5 1.25
# المتوسطات 3 1 1 1 1
# التكرار 1 1 1 9 9 أو 300
وقت المسح الضوئي 4 دقائق 0 ثانية 1 دقيقة و 12 ثانية 1 دقيقة و 12 ثانية 45 ثانية 25 دقيقة

الجدول 1: معلمات التقاط التصوير بالرنين المغناطيسي مع أسماء التسلسل المرتبطة بها.

الشكل التكميلي 1: حامل ماوس نموذج 3D (أبيض) مع بطانة مطاطية داخلية (أحمر). الأبعاد: الطول = 43 مم ، نصف القطر الخارجي = 15 مم ، العرض الداخلي = 20.7 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: درجة الحرارة (درجة مئوية) التي يتم رصدها أثناء العلاج. درجة الحرارة الأساسية تقاس بواسطة مجسات المستقيم (الأزرق) والمريء (البرتقالي). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: ملف طباعة 3D لحامل الماوس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام البروتوكول الذي تم تطويره هنا لاستهداف أورام الأطراف الخلفية باستخدام MRgHIFU لعلاج HT الخفيف وإطلاق الأدوية المغلفة من الجسيمات الشحمية في الجسم الحي. تمت مصادفة العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول أثناء الدراسة التجريبية ، وكان تحسين هذه الخطوات الحاسمة مسؤولا عن تحسين نجاح العلاج مقارنة بالدراسة التجريبية. الأول هو الإزالة الكاملة للشعر في المنطقة المراد صوتنها. أي محاصرة للغاز داخل الفراء تمنع شعاع الموجات فوق الصوتية من المرور وتمنع مرور الموجات فوق الصوتية إلى الأنسجة المستهدفة1. ثانيا ، يعد تحديد موضع الماوس أمرا حيويا لنجاح العلاج. يجب وضع الورم بشكل متفوق في حامل الماوس ليكون على اتصال أوثق بمحول الطاقة بالموجات فوق الصوتية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب وضع الهياكل العظمية خارج مسار شعاع الموجات فوق الصوتية دون إصابة الماوس. لقد ثبت أن العظام تمتص الموجات فوق الصوتية بكفاءة ، وبالتالي تعمل كمصدر تسخين في الموقع . يمكن أن يؤثر على ملف التسخين أثناء منع النقل بالموجات فوق الصوتية إلى المنطقة محل الاهتمام4. يجب أيضا وضع الطرف المقابل بعيدا عن مسار الموجات فوق الصوتية ، إما عن طريق دس الساق تحت بقية الجسم أو عن طريق تمديدها وملء الهواء بين الساقين بهلام الموجات فوق الصوتية أو وسادة هلام. يجب أن يكون المستقيم أيضا خارج مسار الموجات فوق الصوتية لتجنب التسخين والانعكاس خارج الهدف من مسبار درجة الحرارة. يعد تحديد موضع الورم بعناية أهم خطوة لإكمال العلاج الناجح.

بعد تحديد الموضع الصحيح ، يجب إجراء وضع مسبار درجة حرارة المريء بعناية لتجنب انسداد القصبة الهوائية. عند إدخال الماوس في تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي ، يجب تأمين محور التوصيل المعدني بين القسطرة في الذيل وقسطرة مضخة الحقن بشريط بعيد عن منطقة التصوير لتجنب إنشاء القطع الأثرية. يجب وضع محول الموجات فوق الصوتية بحيث يكون على اتصال مع منطقة الفراء أقل من الساق وليس إزاحة جهاز مراقبة الجهاز التنفسي. مطلوب مراقبة دقيقة لدرجة حرارة جسم الماوس الأساسية أثناء العلاج والتعديل اللاحق لنظام التسخين الحراري لبقاء الماوس. نظرا لقرب المستقيم والورم في بعض الفئران ، كانت إضافة مسبار المريء مهمة لتحديد تغير درجة الحرارة الأساسية ، حيث أن درجة حرارة المستقيم يمكن أن تعكس فقط التسخين المحلي بدلا من تسخين الجسم الأساسي.

في تصميم وتنفيذ هذا البروتوكول ، تم تنفيذ استكشاف الأخطاء وإصلاحها بنجاح من قبل فريق متعدد التخصصات. لتحديد موضع الماوس ، تم تصميم حامل الماوس وطباعته 3D لاستخدامه على مزلقة التصوير بالرنين المغناطيسي للفئران للسماح بتدفق الهواء الدافئ حول الماوس لتعديل درجة حرارة الجسم أثناء الإجراء. تم اختيار المواد الخاصة بهذا الحامل بناء على قدرتها على حمل الماوس بشكل آمن مع السماح بنقل الموجات فوق الصوتية. يسمح ملحق مطاطي داخل الحامل المطبوع بإجراء تعديلات فردية للماوس ، بينما يمنع القطع الموجود في الجزء السفلي انعكاس الموجات فوق الصوتية والتسخين غير المقصود.

هناك قيود مرتبطة بالنموذج ، مثل قرب الأورام من الهياكل القريبة - العظام (عظم الفخذ) والمستقيم - والتي يمكن أن تمتص أو تعكس الموجات فوق الصوتية ، على التوالي. يمكن أن يؤدي التسخين غير المقصود لعظم الفخذ إلى تدمير نخاع العظم والألم ، في حين أن انعكاس الموجات فوق الصوتية من الهواء في المستقيم يمكن أن يسبب تسخينا موضعيا وتلفا للأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك حالات من محاصرة الموجات فوق الصوتية بسبب إعادة نمو الجلد بعد العلاج في الفئران البقاء على قيد الحياة ، مما تسبب في تسخين موضعي للجلد. يشتبه في أن هذا يرجع إلى محاصرة الهواء حول بصيلات الشعر التي لا يتم إزاحتها باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية بين محول الطاقة والجلد. في كل حالة ، بدا الجلد أغمق من الجلد المحيط أصلع. في أقسام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لأطراف الفأر هذه ، شوهد الشعر داخل البشرة ، ولكن لم يتم العثور على تليف الورم أو أي تفسير آخر لسبب عدم قدرة الموجات فوق الصوتية على المرور عبر الجلد والأنسجة تحت الجلد.

مع تطوير هذا البروتوكول ، من المخطط إجراء مزيد من الدراسات لتوسيع الأنظمة النموذجية لاختبار الأورام الصلبة الأخرى لدى الأطفال ، مثل الساركوما العظمية والساركوما الليفية المخاطية ، للعلاج باستخدام HT و TLD. هذا أمر واعد لأن هؤلاء المرضى يمكن أن يواجهوا ألما منهكا مع خيارات علاج محدودة في هذا السياق السريري. يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل أنواع الأورام الصلبة الأخرى الموجودة في الأطراف والتي يمكن استهدافها باستخدام MRgHIFU29,30. في الختام ، تدعم البيانات أنه يمكن استقراء مزيج الجسيمات الشحمية الحساسة للحرارة لتغليف أشكال أخرى من العلاج الكيميائي أو الأدوية حيث يكون توصيل الدواء المستهدف مفيدا ويكون وجود شكل غير جراحي من التسخين ، مثل MRgHIFU ، مثاليا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نود أن نعترف بمصادر تمويلنا لهذا المشروع والموظفين المعنيين بما في ذلك: منحة أبحاث C17 ، ومنحة كندا للدراسات العليا ، والصندوق الاستئماني لفرص الطلاب في أونتاريو ، وصندوق جيمس جيه هاموند.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5mL Eppendorf tubes Eppendorf 22363204
1kb plus DNA Ladder Froggabio DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix) Wisent 801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec Bruker T184931 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler Biorad 1851148
Clippers Whal Peanut 8655
Compressed ultrasound gel Aquaflex HF54-004
Convection heating device 3M Bair Hugger 70200791401
Depiliatory cream Nair 61700222611 Shopper's Drug Mart
DMEM Wisent 219-065-LK
DNeasy extraction kit Qiagen  69504
DPBS Wisent 311-420-CL
Drug injection system Harvard Apparatus PY2 70-2131 PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant Optixcare 50-218-8442
F10 Media Wisent 318-050-CL
FBS Wisent 081-105
Froggarose FroggaBio A87
Gel Molecular Imager BioRad GelDocXR
Glutamax Wisent 609-065-EL
Heat Lamp Morganville Scientific HL0100  Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) SAI infusion PE-20-100
Isoflurane Sigma 792632
M25FV24C Cell line Gladdy Lab N/A
Microliter Syringe Hamilton 01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR Biorad 170-8170
Mouse holder The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine  N/A Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. 
MyRun Machine Cosmo Bio Co Ltd CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-8000-GL
p53 primers Eurofins N/A Custom Primers
PCR tubes Diamed SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin Wisent 450-200-EL
Proteus software  Pichardo lab N/A
Respiratory monitoring system SAII Model 1030 MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS Image Guided Therapy N/A LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8
frequency 2.5 MHz
diameter  25 mm
radius of curvature 20 mm
Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm

Motor: axes 2

Generator:
Number of channels 8
Maximum electrical power/channel Wel 4
Maximum electrical power Wel 32
Bandwidth 0.5 - 5 MHz
Control per channel: Freq., Phase and. amplitude
Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta)
Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min.

Transducer:
Number of elements 8
frequency  2.5 MHz
diameter 25 mm
radius of curvature 20 mm
Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe ThermoFisher Scientific S33102
TAE Wisent 811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" ) Terumo Medical Corp 15253
Thermal probes Rugged Monitoring L201-08
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin Wisent 325-052-EL
Ultrasound Gel Aquasonic PLI 01-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
  2. Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
  3. Dasgupta, R. Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology. , Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019).
  4. Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
  5. Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
  6. Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
  7. Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
  8. Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
  9. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12 (2017).
  10. Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
  11. Kim, A. A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019).
  12. PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021).
  13. Suelmann, B. B. M. Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018).
  14. De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107 (2021).
  15. Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
  16. Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
  17. Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
  18. Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
  19. Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65 (2016).
  20. Dewhirst, M. W., Lee, C. -T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
  21. Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
  22. Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
  23. Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
  24. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
  25. De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564 (2021).
  26. McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
  27. Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
  28. Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
  29. Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816 (2021).
  30. Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973 (2022).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 191 ،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
Posted by JoVE Editors on 02/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model . The Authors section was updated from:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

to:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
James M. Drake1,3,4,10
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

ارتفاع الحرارة الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي: طريقة علاج مجدية في نموذج الساركوما العضلية المخططة للفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wunker, C., Piorkowska, K., Keunen,… More

Wunker, C., Piorkowska, K., Keunen, B., Babichev, Y., Wong, S. M., Regenold, M., Dunne, M., Nomikos, J., Siddiqui, M., Pichardo, S., Foltz, W., Waspe, A. C., Gerstle, J. T., Drake, J. M., Gladdy, R. A. Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model. J. Vis. Exp. (191), e64544, doi:10.3791/64544 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter