Summary
La ligadura parcial del nervio ciático induce dolor neuropático crónico de larga duración, caracterizado por respuestas exageradas a estímulos térmicos y mecánicos. Este modelo de ratón de dolor neuropático se usa comúnmente para estudiar terapias innovadoras para el manejo del dolor. Este artículo describe en detalle el procedimiento quirúrgico para mejorar la estandarización y la reproducibilidad.
Abstract
El manejo del dolor crónico sigue siendo un desafío hasta el día de hoy, y los tratamientos actuales se asocian con efectos adversos, incluida la tolerancia y la adicción. El dolor neuropático crónico resulta de lesiones o enfermedades en el sistema somatosensorial. Para investigar posibles terapias con efectos secundarios reducidos, los modelos de dolor animal son el estándar de oro en los estudios preclínicos. Por lo tanto, los modelos bien caracterizados y bien descritos son cruciales para el desarrollo y la validación de terapias innovadoras.
La ligadura parcial del nervio ciático (pSNL) es un procedimiento que induce dolor neuropático crónico en ratones, caracterizado por hipersensibilidad mecánica y térmica, dolor continuo y cambios en la temperatura de las extremidades, lo que hace que este modelo sea ideal para estudiar el dolor neuropático preclínicamente. pSNL es un modelo ventajoso para estudiar el dolor neuropático, ya que reproduce muchos síntomas observados en humanos con dolor neuropático. Además, el procedimiento quirúrgico es relativamente rápido y sencillo de realizar. El pSNL unilateral de una extremidad permite la comparación entre las patas ipsilateral y contralateral, así como la evaluación de la sensibilización central.
Para inducir hipersensibilidad neuropática crónica, se utiliza un hilo de nylon 9-0 no absorbible para ligar el tercio dorsal del nervio ciático. Este artículo describe el procedimiento quirúrgico y caracteriza el desarrollo del dolor neuropático crónico a través de múltiples pruebas de comportamiento de uso común. Como una gran cantidad de terapias innovadoras se están investigando para tratar el dolor crónico, este artículo proporciona conceptos cruciales para la estandarización y una descripción precisa de las cirugías necesarias para inducir dolor neuropático.
Introduction
El dolor crónico es un problema de salud importante en todo el mundo y es uno de los problemas de salud más costosos en los Estados Unidos. El dolor crónico se maneja mejor cuando las modalidades farmacológicas y no farmacológicas se utilizan de manera multidisciplinaria1. El manejo del dolor crónico es difícil y, en algunos casos, no trata adecuadamente el dolor2. Por lo tanto, se necesitan métodos nuevos y complementarios para mejorar el manejo del dolor crónico, y los modelos animales son cruciales para investigar terapias innovadoras.
El dolor neuropático crónico resulta de lesiones o enfermedades en el sistema somatosensorial, incluyendo diabetes, infecciones, compresiones nerviosas o enfermedades autoinmunes3. El dolor neuropático se basa tanto en mecanismos de sensibilización periféricos como centrales y se origina a partir de una lesión de los nervios. Este dolor puede caracterizarse por hiperalgesia y alodinia evocadas tanto al tacto como térmicamente, dolor continuo y cambios en la temperatura de la extremidad afectada4. Para comprender mejor los mecanismos y avanzar en nuevos tratamientos, se han desarrollado varios modelos en roedores para imitar los síntomas y las causas del dolor neuropático5. Por ejemplo, el dolor neuropático se puede inducir con inyecciones de agentes quimioterapéuticos, ligadura del nervio espinal (SNL), lesión por constricción crónica (CCI) del nervio ciático, pSNL, lesión nerviosa preservada, transección del nervio ciático y trisección del nervio ciático6. Cabe destacar que la ligadura del nervio ciático reproduce múltiples características del dolor neuropático observado en humanos, como hipersensibilidad mecánica y térmica, o cambios en la temperatura del miembro afectado, característicos del síndrome de dolor regional complejo (SDRC)7. Por lo tanto, este modelo es adecuado para el estudio del CRPS o cualquier otra lesión nerviosa que induzca dolor neuropático crónico. El modelo fue desarrollado por primera vez por Seltzer en 19908, y es ampliamente utilizado en estudios de dolor para investigar nuevos compuestos analgésicos o evaluar los efectos cognitivos del dolor crónico 9,10,11,12,13. El modelo presenta alta reproducibilidad, y la ligadura parcial preserva las respuestas conductuales a estímulos periféricos6.
Muchos de los modelos utilizados actualmente tienen deficiencias no observadas en pSNL. El modelo CCI tiene una variabilidad mucho mayor de lesión entre cada animal dependiendo de la comodidad del constrictor, y la autotomía altera los dígitos de la pata trasera haciendo que el modelo no sea adecuado para el análisis del comportamiento6. El modelo SNL es una cirugía mucho más complicada y prolongada que no solo requiere habilidades técnicas avanzadas, sino que también conlleva un alto riesgo de déficits motores severos3. Estas deficiencias no se ven en el modelo pSNL. La facilidad de reproducibilidad, la corta duración de la cirugía y la reducción del riesgo de déficits motores observados en el postoperatorio hacen que este modelo sea valioso para el estudio del dolor neuropático periférico 8,14. Sin embargo, el procedimiento de ligadura parcial en sí puede tener variabilidad entre los experimentadores, lo que resulta en una menor consistencia en el número de fibras nerviosas ligadas. Por lo tanto, presentar los detalles de la cirugía es crucial para aumentar la reproducibilidad entre los estudios.
Para inducir la neuropatía crónica, se utiliza una sutura de nylon 9-0 no absorbible para ligar un tercio del ancho del nervio ciático. Después de la cirugía, las respuestas a los estímulos térmicos y mecánicos son exageradas, comenzando en el día 1 postoperatorio y durando más de 50 días8. Aquí, las sensibilidades térmicas y mecánicas se evaluaron durante 28 días utilizando pruebas de Hargreaves, placa caliente y filamento von Frey. Todos los ensayos de comportamiento demostraron la consistencia de la hipersensibilidad de larga duración. Se ha demostrado que este modelo tiene efectos dependientes de la dosis tanto de la morfina como del ibuprofeno, lo que confirma que es adecuado para estudios preclínicos sobre el dolor. En particular, este artículo describe las instrucciones para una herramienta de vidrio hecha a mano única, conocida como "gancho de vidrio nervioso". Esta herramienta se utiliza en lugar de fórceps para manipular el nervio y prevenir lesiones nerviosas adicionales no deseadas durante la cirugía.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arizona y se ajustan a las pautas para el uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (publicación de los NIH no. 80-23, 1966). Los ratones adultos C57Bl6/J libres de patógenos (peso en el momento de la prueba: 22-28 g) se alojaron en jaulas de ratón de vivero estándar (cinco ratones por jaula) en habitaciones climatizadas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se les permitió el acceso a alimentos y agua ad libitum. Todos los experimentos conductuales fueron realizados por experimentadores cegados a las condiciones de tratamiento.
1. Línea de base: la medida de la sensibilidad mecánica
- A la llegada de los ratones, permítales habituarse a la instalación de animales durante 1 semana. Luego, habitúe a los animales al manejo del experimentador durante ≥7 días a partir de entonces.
- Habituar a los ratones al aparato de prueba de von Frey durante 1 h antes de la prueba colocándolos en cajas transparentes de plexiglás, en una malla de alambre, en la misma habitación que la sala de prueba, preferiblemente con el experimentador presente en la habitación durante la habituación.
- Establecer el umbral de extracción de la pata basal mediante el método "arriba y abajo" utilizando filamentos de von Frey descritos en la Tabla Suplementaria S1, comenzando con el filamento 3.61 (3.9 mN).
- Mida la respuesta de retirada al sondeo de la pata trasera plantar media con una serie de monofilamentos finos calibrados (von Frey). Aplicar cada filamento perpendicularmente una vez a la superficie plantar de la pata trasera ipsilateral pSNL de los animales mantenidos en jaulas de malla de alambre suspendidas. Evaluar la sensibilidad mecánica utilizando el método "arriba y abajo"15: determinar el umbral de extracción aumentando o disminuyendo secuencialmente la fuerza del estímulo, correspondiente al tamaño del filamento. Aplicar secuencialmente cada filamento una vez.
NOTA: El experimentador debe evitar estimular cualquiera de las almohadillas de las patas para obtener resultados consistentes entre los animales. - Por ejemplo, si el animal no responde al filamento 3.61, use el filamento 4.08 más grueso (9.8 mN) (una respuesta se observa visualmente como retirada, sacudida o lamido de la pata afectada); si el animal respondió la primera vez, use el filamento más delgado de 3.22 (1.6 mN). Continúe utilizando filamentos decrecientes o cada vez más gruesos dependiendo de si el animal tuvo respuestas posteriores positivas o negativas, respectivamente. Reporte las respuestas negativas y positivas en la hoja de datos presentada en la Tabla Suplementaria S1. Prueba la misma pata 4x con diferentes filamentos después de la primera respuesta positiva.
- Mida la respuesta de retirada al sondeo de la pata trasera plantar media con una serie de monofilamentos finos calibrados (von Frey). Aplicar cada filamento perpendicularmente una vez a la superficie plantar de la pata trasera ipsilateral pSNL de los animales mantenidos en jaulas de malla de alambre suspendidas. Evaluar la sensibilidad mecánica utilizando el método "arriba y abajo"15: determinar el umbral de extracción aumentando o disminuyendo secuencialmente la fuerza del estímulo, correspondiente al tamaño del filamento. Aplicar secuencialmente cada filamento una vez.
2. Línea de base: la medida de sensibilidad térmica utilizando la prueba de Hargreaves
- A la llegada de los ratones, permítales habituarse a la instalación de animales durante 1 semana. Luego, habitúe a los animales al manejo del experimentador durante ≥7 días a partir de entonces.
- Habitúe a los ratones al aparato de prueba Hargreaves durante 1 h antes de la prueba colocándolos en cajas transparentes de plexiglás, en la misma habitación que la sala de prueba, preferiblemente con el experimentador presente en la habitación durante la habituación.
NOTA: La prueba de Hargreaves requiere que el animal permanezca quieto durante unos segundos. Con ratones, la habituación es clave para un experimento exitoso. Por lo tanto, si los ratones permanecen muy activos después de 1 h de habituación, permítales aclimatarse durante más tiempo según sea necesario.- Determinar las latencias de extracción de la pata descritas por Hargreaves et al.16. Aclimatar a los ratones dentro de recintos de plexiglás en una placa de plexiglás transparente.
- Enfoque una fuente de calor radiante (lámpara de proyector de alta intensidad) sobre la superficie plantar de la pata trasera ipsilateral al pSNL. Ajuste la intensidad de la fuente de calor para obtener una línea de base de latencia de extracción de la pata de aproximadamente 10 s. Luego, mantenga la intensidad constante durante el resto del experimento.
- Espere a que un detector de movimiento detenga automáticamente el estímulo y el temporizador cuando se retira la pata. Use un límite máximo de 33.5 s para evitar daños en los tejidos.
NOTA: El límite se determina en base a experimentos y artículos previos para evitar cualquier daño adicional en la piel11,17,18. Con la intensidad utilizada en este estudio, 33,5 es el punto de corte, correspondiente a una intensidad de estímulo de 30 (50 W) utilizando el aparato de Hargreaves. El comportamiento observado es un comportamiento reflejo, no voluntario. - Establecer las latencias de extracción de la pata basal utilizando el aparato Hargreaves y apuntando a la superficie plantar de la pata trasera ipsilateral pSNL. Inicie la estimulación térmica y registre la latencia de abstinencia. Para evitar afectar la temperatura del estímulo térmico, limpie cualquier orina durante los ensayos.
3. Línea de base: la medida de sensibilidad térmica utilizando la prueba de placa caliente
- Habitúe a los animales a la sala de pruebas durante 1 h antes de la prueba.
NOTA: Como la temperatura ambiente es importante y puede afectar las respuestas a la prueba de placa caliente, asegúrese de que la temperatura de la habitación sea constantemente de alrededor de 22 ° C durante el período de habituación y durante el período de prueba. - Ajuste la placa caliente a 52 °C, ya que se ha demostrado que esta temperatura provoca idealmente una respuesta térmica aversiva19.
- Coloque al animal en la cámara de prueba y encienda un cronómetro.
- Observe los comportamientos nocifensivos (es decir, abstinencia de la pata, lamer, temblar). Como la cirugía de pSNL afecta a la extremidad posterior, ignore cualquier comportamiento observado en las extremidades anteriores (especialmente lamer las extremidades anteriores).
- Detenga el cronómetro tan pronto como se observe el comportamiento nocifensivo.
- Retire al animal de la cámara y registre la latencia de este comportamiento.
NOTA: Retire los animales de la cámara después de un máximo de 30 s para evitar daños en los tejidos. Además, es importante tener en cuenta que el comportamiento observado es un comportamiento reflejo, no voluntario. - Limpie la cámara de prueba con etanol al 70% entre animales para reducir el impacto conductual de los olores. Para evitar afectar la temperatura del estímulo térmico, limpie el aparato de cualquier orina entre cada animal probado.
- Para confirmar los resultados, grabe videos de los animales en la cámara de placas calientes durante las pruebas para su revisión después de que los animales hayan sido probados.
NOTA: Mediante el uso de la revisión de video para cuantificar las latencias, el experimentador puede observar repetidamente la prueba y analizar de cerca los comportamientos nocifensivos que pueden haberse pasado por alto durante la observación en tiempo real.
4. Preparación preoperatoria
NOTA: Asegúrese de que haya jaulas limpias disponibles para recuperar a los ratones después de la cirugía. Limpie el área quirúrgica con etanol al 70%, desinfecte las manos con etanol al 70%, use guantes estériles, use el equipo de protección personal (EPP) adecuado (bata de laboratorio, red para el cabello, cubiertas para zapatos) y practique técnicas estériles durante toda la cirugía.
- Prepare las herramientas (Figura Suplementaria S1) y los recursos adicionales (gasa) que se utilizarán en cirugía esterilizándolos en autoclave de antemano.
- Inducir la anestesia con isoflurano volátil y ajustarlo según sea necesario para mantener un avión quirúrgico. Asegúrese de que el oxígeno esté a un caudal adecuado.
- Para asegurarse de que el animal esté anestesiado, pellizque los dedos de los pies en una pata trasera con pinzas para asegurar la ausencia de reflejo de la pata y verifique el reflejo de parpadeo corneal antes de aplicar ungüento oftálmico lubricante.
NOTA: Los analgésicos no pueden ser ofrecidos en este estudio, ya que pueden alterar la vía del dolor que se pretende analizar o incluso neutralizar e invalidar el comportamiento que se mide de acuerdo con los objetivos de investigación del dolor20,21,22. - Al elegir en qué lado realizar la cirugía (aquí se demuestra a la izquierda), afeite la pata trasera del animal alrededor de la región del muslo, hacia abajo hacia la rótula, superiormente hacia la cadera y por encima del fémur. Limpie 3 veces con clorhexidina en una dirección con tres gasas separadas, alternadas con solución salina estéril tibia.
NOTA: En el futuro, asegúrese de que cada animal tenga la cirugía realizada en el mismo lado para mantener la consistencia. - Deslice la pierna a través de una hendidura hecha en una cortina estéril de 10 cm x 10 cm para crear un campo estéril alrededor de la pierna de elección.
5. Procedimiento quirúrgico
- Usando tijeras quirúrgicas finas (Figura Suplementaria S1F), haga un pequeño corte de 2 mm de la piel en la línea media de la cara lateral del muslo. Deslice las tijeras debajo de la piel en un movimiento circular para romper a través de la fascia y crear un espacio libre, ampliando el espacio de la incisión.
- Usando pinzas de atar (Figura Suplementaria S1H), cree una incisión aguda verticalmente en un ángulo de 90 ° en los músculos del muslo, a 1 cm de profundidad.
- Inserte las tijeras pequeñas y finas (Figura Suplementaria S1G) en la misma incisión, también en un ángulo de 90°, y ábralas suavemente para separar los músculos. Continúe haciendo esto hasta que se visualice el nervio ciático.
- Localice el nervio ciático, que puede aparecer brillante y delgado, corriendo paralelo al muslo vertical, en la dirección de la cadera a la rodilla. Retire las tijeras y las pinzas de atar del cuerpo antes de continuar.
- Use las pinzas extra finas (Figura Suplementaria S1D) y el gancho de vidrio nervioso (Figura Suplementaria S1E) para aislar el nervio desde abajo. Libere cuidadosamente el nervio de los tejidos conectivos circundantes en un sitio cerca del trocánter del fémur, que está más cerca de la cadera y más alejado de la rodilla.
- Permita que el nervio descanse sobre la varilla de vidrio y asegúrese de que el extremo de la varilla evite que el nervio se desprenda.
- Coloque un nudo quirúrgico para atar 1/3 del ancho del nervio ciático usando una sutura de nylon 9-0, antes de dividirlo en las ramas comunes del nervio peroneo, tibial y sural3.
NOTA: La ramificación ocurre a medida que el nervio ciático baja por la rodilla, lejos de la cadera. Dado que estas tres ramas del nervio tienen tres inervaciones diferentes, es imperativo colocar el nudo quirúrgico antes de la ramificación para garantizar los mismos déficits nerviosos en todas las cirugías con animales. - Tenga cuidado de mantener los hilos cerca del nudo cuando tire de los hilos apretados, para no tirar del nervio con fuerza excesiva para evitar deslizar el nervio fuera de la varilla de vidrio y evitar más lesiones por estiramiento.
- Deslice con cuidado el nervio de la varilla de vidrio una vez que el nudo esté completo y vuelva a colocarlo en la ubicación original al nivel debajo de los músculos separados.
- Sutura la incisión muscular con una sutura 5-0 poliglicólica absorbible. Por separado, suturar la piel con una sutura de polipropileno 6-0 no absorbible.
- Registre el tiempo de parada de la cirugía y la anestesia. Deje que el ratón se despierte, solo en una jaula de recuperación, antes de devolverlo a una nueva jaula limpia.
NOTA: Durante la cirugía, pellizque los dedos de los pies del animal para confirmar el mantenimiento adecuado de la anestesia y controlar su respiración y perfusión corporal (rojo, rosa, pálido). Si la respiración se reduce significativamente o el animal parece pálido, considere reducir el flujo de anestesia o aumentar el flujo de oxígeno y tenga una jeringa llena de solución salina lista para inyectar por vía subcutánea para rehidratar al animal. En todo momento, el animal debe tener una fuente de calor colocada debajo de él para mantener el calor corporal.
6. Procedimiento quirúrgico simulado para animales control
- Siga los pasos 5.1-5.11 del procedimiento quirúrgico; Excluya los pasos 5.4-5.9.
7. Pruebas conductuales postquirúrgicas
NOTA: Asegúrese de que el experimentador esté cegado a cualquier tratamiento. El dolor neuropático crónico se desarrollará durante 2 semanas después de la cirugía, después de lo cual se pueden realizar pruebas de comportamiento después de la administración de compuestos de interés.
- Utilice la prueba de von Frey, Hargreaves o de placa caliente para evaluar la hipersensibilidad térmica y mecánica y su posible reversión.
- Retire cualquier animal del estudio si cumple con los criterios de criterio de valoración descritos por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
- Eutanasia a los animales siguiendo los procedimientos descritos por el comité institucional de cuidado y uso de animales al final de las pruebas de comportamiento.
8. Análisis de datos
- von Frey:
- Analizar los datos utilizando el método no paramétrico de Dixon, como lo describen Chaplan y colegas23, y expresar los datos como el umbral medio de retiro.
- En la página principal del software referenciado (consulte la Tabla de materiales), seleccione todos los filamentos que se utilizaron para el estudio (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 y 4.56). En el panel de grupo , seleccione el filamento correspondiente a la última simulación. En el cuadro en blanco , informe las respuestas positivas (X) y negativas (o). Anote los umbrales reportados en el cuadro a la izquierda del patrón de respuestas observado.
NOTA: En la figura suplementaria S2 se presenta un ejemplo de patrón y cuantificación.
- En la página principal del software referenciado (consulte la Tabla de materiales), seleccione todos los filamentos que se utilizaron para el estudio (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 y 4.56). En el panel de grupo , seleccione el filamento correspondiente a la última simulación. En el cuadro en blanco , informe las respuestas positivas (X) y negativas (o). Anote los umbrales reportados en el cuadro a la izquierda del patrón de respuestas observado.
- Analizar los datos utilizando el método no paramétrico de Dixon, como lo describen Chaplan y colegas23, y expresar los datos como el umbral medio de retiro.
- Hargreaves y placa eléctrica:
- Informe de las latencias en una hoja de cálculo para un análisis estadístico posterior.
- Trazar los resultados como la media de las sensibilidades (umbrales o latencias) en función del tiempo.
9. Instrucciones sobre cómo hacer el gancho de vidrio nervioso
NOTA: Practique la seguridad contra incendios durante todo este proceso. Use la protección adecuada, como guantes resistentes al calor o gafas, según sea necesario.
- Encienda el quemador Bunsen.
- Sostenga un extremo de la varilla de vidrio (A) al fuego en una mano. A medida que esta varilla de vidrio se derrite, use otra varilla de vidrio (B) en la otra mano para guiar y tirar del vidrio de fusión en la varilla A. Retire la varilla de vidrio A del fuego y permita que el extremo de la porción derretida ruede naturalmente hacia adentro para formar una pequeña forma de bola. Use la varilla de vidrio B para guiar esta forma.
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Representative Results
El dolor neuropático crónico se indujo mediante la ligadura parcial del nervio ciático de ratones machos C57Bl6/J (Figura 1A). La sensibilidad mecánica se evaluó utilizando filamentos de von Frey y el método "arriba y abajo". La sensibilidad térmica al calor se evaluó mediante las pruebas de Hargreaves y placas calientes. Todos los datos se analizaron con un ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección Geisser-Invernadero, para comparar el efecto de la cirugía de pSNL con animales simulados a lo largo del tiempo o los efectos de diferentes dosis de morfina e ibuprofeno.
Los ratones que se sometieron a cirugía de pSNL demostraron umbrales más bajos para los estímulos mecánicos en comparación con los animales simulados durante 28 días (Figura 1B). Se obtuvieron resultados similares con la evaluación de hipersensibilidad térmica; Las latencias de extracción de la pata después de la exposición al estímulo de calor radiante aumentaron en los animales pSNL (Figura 1C), así como las latencias de extracción cuando los animales se colocaron en una placa de 52 °C (Figura 1D).
Tras el establecimiento de dolor neuropático crónico, 14 días después de la cirugía, evaluamos los efectos antinociceptivos de diferentes dosis de morfina o ibuprofeno. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal solución salina o dos dosis diferentes de morfina (1 y 5 mg / kg). Ambos grupos inyectados con morfina mostraron una reversión de la hipersensibilidad inducida por pSNL, que duró de 1 (1 mg/kg) a 2 h (5 mg/kg) (Figura 2A). La hipersensibilidad mecánica volvió al valor basal 4 h después de la inyección de morfina. Cuando se administraron dos dosis diferentes de ibuprofeno (10 y 30 mg / kg) por vía intraperitoneal a los ratones, los resultados demostraron una disminución de la hipersensibilidad mecánica en comparación con los ratones inyectados con solución salina (Figura 2B). Los efectos antinociceptivos del ibuprofeno duraron hasta 2 h. En general, los resultados demostraron que la cirugía de pSNL induce dolor neuropático crónico de larga duración. Además, pudimos demostrar que este modelo es sensible a diferentes dosis de analgésicos.
Figura 1: Hipersensibilidad térmica y mecánica de larga duración en ratones debido a la ligadura parcial del nervio ciático. Se evaluaron la sensibilidad térmica al calor (prueba de Hargreaves y placa caliente) y la sensibilidad mecánica a los filamentos de von Frey para examinar la inducción y persistencia de la hipersensibilidad en un modelo de dolor neuropático crónico (pSNL). Los valores basales se midieron antes de la ligadura del nervio ciático, y la hipersensibilidad se evaluó durante 28 días después de la cirugía. (A) La ilustración representa la ligadura parcial del nervio ciático. (B) Se compararon umbrales de retirada mecánica entre ratones simulados y pSNL en cada punto de tiempo. Las medidas repetidas de ANOVA bidireccional con corrección Geisser-Greenhouse revelaron un efecto significativo de pSNL (F(1, 10) = 222.3, p < 0.0001, n = 5-7 por condición). La prueba de comparaciones múltiples de Sidak demostró un aumento significativo de la hipersensibilidad entre los días 1 y 28 (p < 0,05). (C) Las latencias de retirada térmica, medidas por la prueba de Hargreaves, se compararon entre ratones simulados y pSNL. El ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección Geisser-Greenhouse reveló un efecto significativo de pSNL (F(1, 8) = 113.8; p < 0,0001, n = 4-6 por condición). La prueba de comparaciones múltiples de Sidak demostró un aumento significativo de la hipersensibilidad en los días 2 y 14 (p < 0,05). (D) Las latencias de retiro térmico, medidas por la prueba de placa caliente, se compararon entre ratones simulados y pSNL. El ANOVA bidireccional ordinario reveló un efecto significativo de pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 por condición). La prueba de comparaciones múltiples de Sidak demostró un aumento significativo de la sensibilidad al calor a las 4 semanas después de la cirugía de pSNL (p = 0,0026). Los datos se presentan como media ± S.E.M. Abreviaturas: pSNL = ligadura parcial del nervio ciático; BL = línea base. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Reversión dependiente de la dosis de hipersensibilidad mecánica inducida por pSNL mediante inyección intraperitoneal de morfina o ibuprofeno. Se evaluó la hipersensibilidad mecánica (utilizando filamentos de von Frey) para examinar los posibles efectos antinociceptivos de la morfina o el ibuprofeno en un modelo de ratón de pSNL. Los valores basales (pre-pSNL) se adquirieron antes de la ligadura del nervio ciático. Tras el establecimiento del dolor neuropático crónico, el día 14 los animales fueron referenciados por segunda vez para asegurar la hipersensibilidad inducida por pSNL (post-pSNL). Luego, se inyectaron dos dosis de morfina (1/5 mg/kg) o ibuprofeno (10/30 mg/kg) por vía intraperitoneal. La posible reversión de la hipersensibilidad mecánica se evaluó durante 4 h después de las inyecciones. (A) Se compararon umbrales de abstinencia mecánica entre la condición salina y las dos dosis de morfina. El ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección Geisser-Greenhouse reveló un efecto significativo de 1 mg/kg de morfina (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 por condición) y un efecto significativo de 5 mg/kg de morfina (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 por condición). La prueba de comparaciones múltiples de Sidak demostró una disminución significativa de la hipersensibilidad mecánica 1 h después de la inyección para ambas dosis, pero solo un efecto significativo para la condición de 5 mg / kg a las 2 h (* p < 0.05). (B) Se compararon los umbrales de abstinencia mecánica entre la condición salina y las dos dosis de ibuprofeno. El ANOVA bidireccional de medidas repetidas con corrección Geisser-Greenhouse reveló un efecto significativo de 10 mg/kg de iburofeno (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 por condición) y un efecto significativo de 30 mg/kg de ibuprofeno (F(1, 10) = 18,79, p = 0,0015, n = 6 por condición). La prueba de comparaciones múltiples de Sidak demostró una disminución significativa de la hipersensibilidad mecánica 1 y 2 h después de la inyección para ambas dosis (*p < 0,05). Los datos se presentan como media ± S.E.M. Abreviaturas: pSNL = ligadura parcial del nervio ciático; IP = intraperitoneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria S1: Herramientas quirúrgicas. Las dos imágenes ilustran las diferentes herramientas utilizadas para la cirugía. (A) Portaagujas finas Castroviejo; (B) portaagujas Castroviejo; c) Pinzas Micro Adson; (D) pinzas Graefe extra finas; (E) gancho de vidrio nervioso; (F) tijeras finas (11,5 cm); (G) tijeras finas (9 cm); H) atar fórceps; (I) fórceps del iris. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Patrón representativo de las respuestas de retirada de la pata medido por la prueba del filamento de von Frey. Para este ensayo, el ratón no respondió a las tres primeras estimulaciones, sino que retiró su pata en la cuarta estimulación con el filamento 4.56. Después de la respuesta positiva (x), se utilizó un filamento más delgado (4.31), seguido de filamentos de tamaños más pequeños hasta que el ratón no respondió a otro filamento (en este caso, 4.08). El experimentador debe disminuir el tamaño de los filamentos, uno por uno, hasta una ausencia de respuesta (o). Después de una ausencia de respuesta, el experimentador utilizó un filamento más grueso hasta obtener una respuesta positiva y disminuyó su tamaño después de la respuesta positiva (obtenida aquí con el filamento 4.31). Se realizaron cuatro estímulos después de la primera respuesta positiva; el patrón cronológico de cada estimulación se anota con números en rojo en el panel A. En este caso, nunca se utilizaron filamentos de 2,44 a 3,22 ya que el animal no mostró una respuesta positiva con el filamento 3,61. (B) El patrón de respuestas se completó en el software Allodynia, informado en el mismo orden en que se aplicaron los filamentos (000xx0x0), en el cuadro resaltado en blanco. El umbral resultante fue calculado por el software (2.60839). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria S1: Hoja de recolección de datos para las pruebas de von Frey. Esta tabla permite a los experimentadores completar patrones de respuestas cuando usan filamentos de von Frey. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El tratamiento del dolor crónico a menudo requiere medicamentos a largo plazo, lo que dificulta el manejo del dolor. Por lo tanto, los modelos preclínicos son una herramienta esencial para evaluar los beneficios potenciales de las terapias innovadoras basadas en enfoques farmacológicos o no farmacológicos. Los numerosos modelos de dolor neuropático crónico plantean desafíos debido a la mayor variabilidad en las técnicas quirúrgicas entre diferentes investigadores, lo que lleva a una menor reproducibilidad. Por lo tanto, es esencial caracterizar los posibles efectos antinociceptivos de las nuevas terapias en múltiples modelos que están bien caracterizados y estandarizados.
Este informe demuestra que la ligadura parcial del nervio ciático da como resultado el desarrollo de dolor neuropático crónico de larga duración en ratones utilizando métodos relativamente baratos. pSNL exagera las respuestas a estímulos térmicos y mecánicos, y el modelo responde a la administración de analgésicos de uso común de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, el modelo pSNL parece ser un modelo conveniente y sensible para evaluar los beneficios potenciales de los nuevos medicamentos. Las características primarias del dolor neuropático son la hiperalgesia y la alodinia. Este informe demuestra cómo se ven afectadas la alodinia mecánica y la hiperalgesia térmica. Sin embargo, no se midió la hiperalgesia mecánica. Hay una gran área gris de superposición entre la alodinia y la hiperalgesia. Ambas sensaciones caen bajo el paraguas de hipersensibilidad general a un estímulo sensorial24. Por lo tanto, la sensación estimulada puede percibirse como otra sensación, como el calor como dolor frío o el tacto como la sensación de ardor. Por lo tanto, la hiperalgesia y la alodinia son a menudo difíciles de distinguir, especialmente en modelos animales de dolor.
El modelo pSNL se ha utilizado en múltiples estudios de dolor crónico para evaluar el efecto de los compuestos analgésicos, los mecanismos subyacentes del dolor crónico o incluso el impacto cognitivo del dolor neuropático de larga duración. La persistencia de hipersensibilidad mecánica hasta 70 días permite el estudio de los efectos a largo plazo de nuevos fármacos25. Es importante destacar que el período óptimo para las pruebas de comportamiento abarca la primera, segunda y tercera semana después de la cirugía, una vez que se establece el dolor crónico 8,11,26,27. Para evaluar la potencia y eficacia de un fármaco o una terapia no farmacológica, se deben considerar tratamientos de control positivo como la morfina o el ibuprofeno, dependiendo del diseño experimental. A diferencia de la prueba de movimiento de cola, la prueba de placa caliente aplica un estímulo a la pata que integra las vías supraespinales19. La prueba de placa caliente ha sido ampliamente utilizada para caracterizar las propiedades antinociceptivas de los medicamentos en modelos de dolor neuropático crónico en estudios recientes 19,28,29,30,31,32,33.
Este modelo se utilizó para caracterizar nuevos tratamientos no opioides e identificar una nueva vía de dolor que involucra al receptor de neurotensina tipo 211,13. También se utilizó para demostrar la participación de las modulaciones glicinérgicas en el dolor crónico12 y el desarrollo de nuevas terapias y vías en la intersección del sueño y el dolor10. Sin embargo, hasta el día de hoy, ningún artículo ha presentado una explicación detallada de la cirugía complementada con un video descriptivo.
Una crítica común al pSNL y modelos similares es la confiabilidad de la consistencia del grado de daño causado por la lesión del nervio neuropático entre animales6. En este artículo se describe un procedimiento para fundir y moldear manualmente una varilla de vidrio para crear un gancho de vidrio nervioso especial para solucionar este problema. La mayoría de las cirugías con animales usan fórceps para recoger nervios o vasos finos. La herramienta de gancho de vidrio nervioso permite un método más seguro y menos propenso a lesiones para manejar el nervio. Aunque el propósito de este modelo es crear lesiones nerviosas, es prudente evitar daños adicionales al nervio que no sean los causados por la sutura colocada a través de un tercio del ancho del nervio ciático. El gancho de vidrio nervioso es una superficie lisa y no dañina para que el nervio descanse; Además, la bola / gancho al final permite una fácil recogida y estabilización. Además, al suturar el nervio, la técnica descrita anteriormente (nota de la sección de protocolo 5.7) recomienda mantener los hilos profundamente dentro de la cavidad corporal, más cerca de donde aparecerá el nudo. Esto evita tirar al final de las suturas y promueve la aplicación de tensión en la sutura más cercana al nervio al apretar el nudo. Esta técnica evita lesiones adicionales por estiramiento si el nervio se sacara inadvertidamente del gancho del vidrio nervioso, hacia el exterior de la cavidad en el proceso de atar el nudo más fuerte. Una ventaja adicional es el uso de tijeras finas para hacer el corte inicial. Esto permite un sitio de incisión mucho más pequeño y, por lo tanto, una curación más rápida, a diferencia de los cortes más grandes hechos con hojas de bisturí.
Los métodos informados en este artículo también tienen algunas limitaciones. El desarrollo del dolor crónico en el modelo pSNL es afectado por el sexo de los animales34. Por lo tanto, es esencial que los estudios de investigación incluyan ambos sexos en su análisis. El propósito de este relato fue enfocarse en un procedimiento quirúrgico y no caracterizar el dimorfismo sexual del modelo de dolor. Vale la pena mencionar que las mediciones de sensibilidad térmica en ratones utilizando la prueba de Hargreaves son un desafío; Se requiere que los animales permanezcan quietos en un recinto pequeño durante unos segundos mientras se aplica el estímulo. Por lo tanto, habituar a los ratones al recinto de plexiglás es un factor clave para obtener resultados exitosos. La medición del dolor evocado también requiere un cuidadoso entrenamiento del experimentador. Se recomiendan pruebas de comportamiento evocadas y espontáneas para evaluar la sensibilidad térmica y mecánica, así como la funcionalidad de la extremidad. Además, en este estudio, la morfina y el ibuprofeno se utilizaron como controles positivos para el efecto antinociceptivo. Estos dos fármacos fueron elegidos ya que se utilizan comúnmente como controles positivos en múltiples modelos de dolor y permiten una mejor comparación entre los diferentes modelos. Sin embargo, es importante mencionar que la pregabalina y la gabapentina a menudo se prescriben para tratar el dolor neuropático, y los estudios que se centran en el tratamiento del dolor neuropático deben incluir estos fármacos como controles positivos.
Este informe describe con precisión una cirugía comúnmente utilizada para el estudio del dolor neuropático crónico. Permitir que los investigadores y aprendices se beneficien de una descripción visual de este modelo de ratón facilitará el desarrollo de proyectos de investigación centrados en la comprensión de los mecanismos del dolor crónico o que apuntan a la caracterización de terapias innovadoras. Además, el uso de múltiples modelos de dolor es esencial para mejorar la reproducibilidad, y este informe facilitará la implementación del modelo pSNL en nuevos laboratorios.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que informar. Ninguno de los autores del manuscrito recibió ninguna remuneración o reembolso u honorarios de ninguna otra manera. Los autores no están afiliados a ningún proveedor o compañía farmacéutica asociada con este estudio.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Centro Nacional de Salud Complementaria e Integrativa [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), el Centro Integral de Dolor Crónico y Adicción-Universidad de Arizona (M.M.I.) y el Programa de Capacitación de Científicos Médicos (MSTP) en la Universidad de Arizona, Facultad de Medicina, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
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