Summary
O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.
Abstract
Apesar dos notáveis avanços na compreensão da biologia tumoral, a grande maioria dos candidatos a medicamentos oncológicos que entram em ensaios clínicos falham, muitas vezes devido à falta de eficácia clínica. Essa alta taxa de falha ilumina a incapacidade dos modelos pré-clínicos atuais em predizer a eficácia clínica, principalmente devido à sua inadequação em refletir a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral. Essas limitações podem ser abordadas com modelos de cultura tridimensionais (3D) (esferoides) estabelecidos a partir de amostras tumorais humanas derivadas de pacientes individuais. Essas culturas 3D representam melhor a biologia do mundo real do que linhagens celulares estabelecidas que não refletem a heterogeneidade tumoral. Além disso, as culturas 3D são melhores do que os modelos de cultura 2D (estruturas monocamadas), pois replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular, e preservam a forma e o crescimento natural da célula. No presente estudo, um método foi desenvolvido para preparar culturas primárias de células cancerosas de pacientes individuais que são 3D e crescem em esferoides multicelulares. As células podem ser derivadas diretamente de tumores de pacientes ou xenoenxertos derivados de pacientes. O método é amplamente aplicável a tumores sólidos (por exemplo, cólon, mama e pulmão) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa de câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo para gerar modelos 3D de cultura tumoral (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avaliar sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Esses esferoides multicelulares podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Introduction
Estudos in vitro e in vivo representam abordagens complementares para o desenvolvimento de tratamentos oncológicos. Os modelos in vitro permitem o controle da maioria das variáveis experimentais e facilitam as análises quantitativas. Muitas vezes servem como plataformas de triagem de baixo custo e também podem ser usadas para estudos mecanísticos1. No entanto, sua relevância biológica é inerentemente limitada, uma vez que tais modelos refletem apenas parcialmente o microambientetumoral1. Em contraste, modelos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), capturam a complexidade do microambiente tumoral e são mais adequados para estudos translacionais e tratamento individualizado em pacientes (ou seja, investigando a resposta a drogas em um modelo derivado de um paciente individual)1. No entanto, os modelos in vivo não são propícios a abordagens de alto rendimento para triagem de drogas, uma vez que os parâmetros experimentais não podem ser controlados tão rigorosamente quanto nos modelos in vitro e porque seu desenvolvimento é demorado, trabalhoso e dispendioso 1,2.
Modelos in vitro estão disponíveis há mais de 100 anos e linhagens celulares estão disponíveis há mais de 70 anos3. Durante as últimas décadas, no entanto, a complexidade dos modelos disponíveis in vitro de tumores sólidos aumentou dramaticamente. Essa complexidade varia desde modelos de cultura 2-dimensional (2D) (estruturas monocamadas) que são linhagens celulares estabelecidas derivadas de tumores ou linhagens celulares primárias até abordagens mais recentes envolvendo modelos 3-dimensionais (3D)1. Dentro dos modelos 2D, uma distinção fundamental é entre as linhagens celulares estabelecidas e primárias4. Linhagens celulares estabelecidas são imortalizadas; Portanto, a mesma linhagem celular pode ser usada globalmente ao longo de muitos anos, o que, de uma perspectiva histórica, facilita a colaboração, o acúmulo de dados e o desenvolvimento de muitas estratégias de tratamento. No entanto, aberrações genéticas nessas linhagens celulares se acumulam a cada passagem, comprometendo sua relevância biológica. Além disso, o número limitado de linhagens celulares disponíveis não reflete a heterogeneidade dos tumores nospacientes4,5. As linhagens celulares primárias de câncer são derivadas diretamente de amostras tumorais ressecadas obtidas por biópsias, derrames pleurais ou ressecções. Portanto, as linhagens primárias de células cancerosas são biologicamente mais relevantes, pois preservam elementos do microambiente tumoral e características tumorais, como comportamentos intercelulares (por exemplo, cross-talk entre células saudáveis e cancerosas) e fenótipos semelhantes a troncos de células cancerosas. No entanto, a capacidade replicativa das linhagens celulares primárias é limitada, o que leva a um tempo de cultivo estreito e limita o número de células tumorais que podem ser utilizadas paraanálises4,5.
Modelos usando culturas 3D são biologicamente mais relevantes do que modelos de cultura 2D, uma vez que as condições in vivo são mantidas. Assim, modelos de cultura 3D preservam a forma e o crescimento natural das células e replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular. Os modelos 3D mais comumente usados na pesquisa do câncer incluem esferoides multicelulares, estruturas baseadas em arcabouços e culturas embutidas emmatriz4,6,7.
O presente protocolo gera modelos de cultura tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avalia sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Os resultados representativos aqui apresentados são de câncer de mama e cólon; No entanto, esse protocolo é amplamente aplicável a outros tipos de tumores sólidos (por exemplo, colangiocarcinoma, câncer gástrico, pulmonar e pancreático) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa em câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Os esferoides multicelulares gerados por essa abordagem podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Esse protocolo é dividido em três seções: (1) geração, coleta e contagem dos esferoides em preparação para seu uso como modelo para testar a eficácia de fármacos; (2) ensaio de MTT para avaliar a eficácia da droga sobre os esferoides; e (3) a avaliação microscópica das alterações morfológicas após o tratamento dos esferoides com drogas como outra abordagem para avaliar a eficácia das drogas (Figura 1).
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Protocol
A coleta de amostras de tumores humanos utilizadas para as culturas de células tumorais primárias foi realizada de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) no Rabin Medical Center, com consentimento informado por escrito dos pacientes. Os pacientes elegíveis para participação no estudo incluíram pacientes com câncer adulto e pediátrico, de ambos os sexos, com câncer de mama, cólon, fígado, pulmão, neuroendócrino, ovário ou pâncreas não metastático, qualquer câncer pediátrico ou qualquer câncer metastático. O único critério de exclusão foi a falta de capacidade para fornecer o consentimento informado.
1. Geração e coleta de esferoides
NOTA: O isolamento de células tumorais primárias pode ser realizado conforme descrito por Kodak et al.8. É importante ressaltar que as células tumorais primárias usadas para gerar os esferoides podem ser derivadas diretamente de amostras de pacientes obtidas por biópsia, ressecção, etc., ou indiretamente usando amostras tumorais de modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX), como descrito por Moskovits et al.9.
- Preparar uma suspensão de célula única de culturas de células tumorais primárias aderentes de 75%-100% de confluência tomando um pequeno frasco (T25) com uma cultura de células primárias aderente de célula única, removendo o meio de cultura celular, lavando com PBS e, em seguida, adicionando 1 mL de 1x Accutase (uma solução de descolamento celular) (ver Tabela de Materiais) por 3 min a 37 °C.
- Neutralizar a solução de Accutase adicionando 5 mL de meio de cultura celular (meio de cultura RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, penicilina-estreptomicina 1:100, aminoácidos não essenciais a 1% e L-glutamina a 1%; ver Tabela de Materiais).
- Aspirar as células com pipeta sorológica de 10 mL e depositá-las em tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Retire o meio de cultura celular, adicione 5 mL de meio de cultura de células fresco em cima do pellet de células e misture delicadamente.
- Conte as células viáveis com um hemocitômetro10. Para fazer isso, pegue uma alíquota de 50 μL da suspensão celular e misture-a com 50 μL de azul de tripano. Conte as células vivas (as células negativas para a cor azul) e calcule o número total de células vivas na suspensão.
- Preparar um "meio de cultura 3D" (um meio de cultura celular suplementado com 5% de matriz de membrana basal; ver Tabela de Materiais).
NOTA: O "meio de cultura 3D" é líquido à temperatura ambiente. A 37 °C, a consistência torna-se mais gel-like (para que as células permaneçam juntas), embora ainda possa ser pipetada (uma vez que contém apenas 5% de matriz de membrana basal). - Calcular o número de células necessárias para o ensaio e o volume total necessário; cada poço deve conter 2.000-8.000 células em 200 μL de meio.
- Prepare uma suspensão celular com o número desejado de células (por exemplo, 4.000 células) em 200 μL do "meio de cultura 3D" e misture suavemente com a pipeta para garantir uma distribuição homogênea.
- Transfira a suspensão para um reservatório de pipetagem. Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa (consulte a Tabela de Materiais). Antes de cada coleta das células, misture bem a suspensão.
- Centrifugar a placa a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente para reforçar o agrupamento das células, melhorando assim a agregação celular, e incubar a placa a 37 °C numa incubadora humidificada a 5% CO2.
- A cada 2-3 dias, atualize o "meio de cultura 3D". Centrifugar a placa a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente, remover e eliminar suavemente 50% do meio (100 μL) e adicionar 100 μL de "meio de cultura 3D" fresco para substituir a solução existente. Repetir o passo 1.11 e recolocar a placa na incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO2.
OBS: A retirada do meio deve ser realizada quando a placa é mantida a 45°, e o meio deve ser coletado apenas da parte superior para evitar a coleta das células. Não deve ser utilizado um sistema de aspiração a vácuo. O meio fresco precisa ser adicionado lenta e suavemente para não atrapalhar os esferoides, que já terão começado a se formar. - Inspecione as células sob um microscópio a cada 1-2 dias para monitorar a formação esferoide. Meça o diâmetro dos esferoides formados usando a ferramenta "escala" no software de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: A inspeção microscópica deve primeiramente revelar corpos irregulares redondos a ovais que assumem uma forma esferoide com o passar do tempo11,12.- Quando o diâmetro do esferoide atingir 100-200 μm, realizar os experimentos de eficácia da droga.
OBS: Os experimentos de eficácia medicamentosa são realizados quando os esferoides atingem esse diâmetro, pois, nesse momento, a maioria das células está se proliferando, o que é propício para avaliar a resposta ao tratamento. Esferoides de maior diâmetro contêm núcleo necrótico e camada quiescente11,12, resultando em menor proporção de células em proliferação que respondem ao tratamento.
- Quando o diâmetro do esferoide atingir 100-200 μm, realizar os experimentos de eficácia da droga.
- Para a coleta de esferoides, use uma pipeta de 1.000 μL para coletar os esferoides de cada poço e deposite-os em um tubo cônico de 15 mL.
NOTA: Os esferoides são inerentemente frágeis e requerem um manuseamento suave. Ao transferir o meio com os esferoides para o tubo cônico, segure o tubo a 45° e pipete lentamente na parede do tubo. Os esferoides são visíveis aos olhos. - Centrifugar o tubo cónico a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente e aspirar e eliminar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.
- Adicionar 0,5 mL do meio de cultura celular e ressuspender bem o pellet, mas suavemente. Evite fazer bolhas.
- Execute a contagem esferoide seguindo os passos abaixo.
- Use uma placa de 96 poços e desenhe um sinal de mais na parte inferior de um poço para dividir o poço em quadrantes (para ajudar a rastrear a contagem).
- Adicione 50 μL da suspensão ao poço e conte os esferoides manualmente ao microscópio (usando uma lente objetiva de 10x).
- Conte os esferoides em cada quadrante, tenha cuidado para não dobrar a contagem e calcule o número total de esferoides no poço.
NOTA: Para precisão da contagem, conte pelo menos 50 esferoides em um poço. Se houver menos de 50 esferoides, misture suavemente a suspensão para garantir uma distribuição homogênea e conte novamente usando um volume maior da suspensão adicionado a um novo poço. Alternativamente, se houver menos de 50 esferoides em um poço, os esferoides podem ser centrifugados e ressuspensos suavemente em um volume de <0,5 mL. Se houver mais de 100 esferoides, adicione o meio de cultura celular à suspensão esferoide, misture suavemente e reconte. - Calcular a concentração esferoide (contagem esferoide/volume de contagem [μL]) e, em seguida, calcular o número total de esferoides na suspensão (concentração esferoide × volume total).
2. Ensaio de eficácia do medicamento (ensaio MTT)
NOTA: Para mais detalhes, ver van Meerloo et al.13. Além disso, para o ensaio de MTT, apenas o meio de cultura celular e não o "meio de cultura 3D" devem ser usados (a adição da matriz da membrana basal não é necessária e poderia potencialmente interferir com o ensaio de MTT).
- Em um tubo novo, preparar uma suspensão esferoide na concentração de 200 esferoides por 200 μL de meio de cultura celular (meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% FBS, 1:100 penicilina-estreptomicina, 1% aminoácidos não essenciais e 1% L-glutamina).
- Para cada tratamento medicamentoso, prepare um estoque de esferoides em um tubo de 15 mL. Calcule a quantidade necessária para cada droga pelo número de poços necessários para repetições: (5-8) × 200 μL. Adicione o fármaco ao tubo até a concentração final necessária.
NOTA: Consulte a seção de resultados representativos sobre os medicamentos utilizados para o presente estudo e sua dosagem. Além disso, os detalhes comerciais dos medicamentos estão listados na Tabela de Materiais.
- Para cada tratamento medicamentoso, prepare um estoque de esferoides em um tubo de 15 mL. Calcule a quantidade necessária para cada droga pelo número de poços necessários para repetições: (5-8) × 200 μL. Adicione o fármaco ao tubo até a concentração final necessária.
- Transfira 200 μL da suspensão esferoide para os poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e incube a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 a 5%. Não utilizar as linhas e colunas externas da placa de 96 poços para o ensaio, pois esses poços são caracterizados por aumento da evaporação, o que poderia levar a uma maior variabilidade entre os experimentos repetidos; em vez disso, adicione PBS a esses poços.
NOTA: É fundamental que a cultura dos esferoides seja homogênea antes que a cultura seja aliquotada na placa de 96 poços. Além disso, uma condição de controle (ou seja, esferoides não tratados) deve ser incluída em cada experimento. - Depois de incubar os esferoides com a droga de estudo por 24-72 h, centrifugar a placa a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e remover suavemente 170 μL do meio de cultura celular, deixando 30 μL (que inclui os esferoides) no fundo do poço.
NOTA: A remoção dos 170 μL do meio de cultura celular deve ser feita com cuidado, para não remover os esferoides. Segure a placa a 45° e coloque uma das mãos (usando uma luva escura para contraste) sob os poços para que os esferoides fiquem visíveis (pontos brancos). - Preparar a solução de MTT (0,714 mg/mL em RPMI livre de fenol, consulte a Tabela de Materiais).
- Adicionar 70 μL de solução de MTT a cada poço para um volume final de 100 μL por poço (a concentração final de MTT no poço será de 0,05 mg por 100 μL). Além disso, prepare poços "em branco" com solução de MTT sem células.
NOTA: O MTT é sensível à luz. Portanto, a luz no capô deve ser apagada, e o tubo que contém a solução MTT deve ser coberto com papel alumínio. - Incubar a placa a 37 °C em estufa umidificada a 5% CO2 por 3-4 h até que se observe uma mudança na cor da solução nos poços (a cor roxa representa células vivas).
- Quando uma mudança for observada, adicione 100 μL de solução de parada (HCl 0,1N em isopropanol) a cada poço e misture suavemente o conteúdo dos poços sem criar bolhas.
- Leia a absorbância da placa em um leitor Fluorometer-ELISA (veja a Tabela de Materiais) em um comprimento de onda de 570 nm e um comprimento de onda de fundo de 630-690 nM.
NOTA: Se o leitor Fluorometer-ELISA disponível não conseguir ler a placa de 96 poços de fixação ultrabaixa, transfira o conteúdo de cada poço para uma placa de fundo plano correspondente de 96 poços. - Calcule a viabilidade celular seguindo as etapas abaixo.
- Para cada poço, calcule o "sinal específico" ("sinal específico" = o sinal a 570 nm - o sinal a 630-690 nm). Em seguida, calcule o valor médio dos poços "Em branco" e subtraia esse valor de cada poço.
- Calcular a média dos "sinais específicos" nos poços de controle que contêm células que não foram tratadas com a droga do estudo ("AV-SS-unt").
- Calcular a viabilidade (porcentagem) de células em cada poço em relação aos poços com células não tratadas.
NOTA: Viabilidade = (sinal específico em cada poço/"AV-SS-unt") × 100
3. Monitoramento e análise das alterações morfológicas nos esferoides
NOTA: Quanto ao ensaio MTT, apenas o meio de cultura celular e não o "meio de cultura 3D" devem ser usados nesta avaliação (a adição da matriz da membrana basal não é necessária e poderia potencialmente interferir na análise).
- Após a contagem dos esferoides, diluir a suspensão em meio de cultura celular (meio de cultura RPMI-1640 suplementado com FBS 10%, penicilina-estreptomicina 1:100, aminoácidos não essenciais a 1% e L-glutamina 1%) para aproximadamente 1-2 esferoides por 20 μL.
- Colocar 80 μL de meio de cultura celular nos poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e, em seguida, adicionar 20 μL da suspensão esferoide aos poços.
NOTA: Os poços conterão, portanto, 1-2 esferoides em um volume de 100 μL. - Verifique cuidadosamente os poços sob o microscópio, e marque os poços que contêm um esferoide, pois eles serão usados para esta análise.
- Preparar o medicamento do estudo em uma concentração que é o dobro da concentração de interesse. Adicione 100 μL da solução do fármaco aos poços relevantes (a concentração total no poço será então de 1x).
- Capture uma imagem de cada poço no Dia 0 (antes de adicionar o medicamento do estudo) e use a ferramenta "escala" no software de imagem (consulte a Tabela de Materiais) para determinar os diâmetros dos esferoides.
- Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 a 5%, examinar a morfologia e medir o diâmetro dos esferoides (usando a ferramenta "escala") diariamente por 3-7 dias, dependendo de quando o efeito da droga é observado (por exemplo, disseminação celular, vagens invasivas, destruição da estrutura, etc.).
- Ao final do experimento, plotar as mudanças nos diâmetros esferoides (em relação ao Dia 0) ao longo do tempo.
NOTA: Variação (porcentagem) = (diâmetro esferoide em um dia específico/diâmetro desse esferoide no Dia 0) × 100
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Representative Results
Este protocolo apresenta procedimentos para gerar uma cultura homogênea de esferoides a partir de células tumorais primárias, avaliar quantitativamente a eficácia de drogas em cultura de esferoides (ensaio de MTT) e determinar o efeito de drogas em estudo sobre a morfologia esferoide. Dados representativos de experimentos em esferoides gerados a partir de culturas de células de câncer de cólon e mama são apresentados. Experimentos semelhantes foram realizados usando outros tipos de tumores, incluindo colangiocarcinoma, câncer gástrico, pulmonar e pancreático (dados não mostrados). Todos os experimentos aqui apresentados foram realizados em triplicata.
A Figura 2 mostra os esferoides gerados a partir da cultura de células primárias de câncer de cólon. Como pode ser visto na Figura 2, o número de esferoides gerados depende do número de células inicialmente semeadas em cada poço. O crescimento dos esferoides para mais de 100 μm de diâmetro levou 10-14 dias. A origem das células tumorais (por exemplo, pacientes diferentes e origens diferentes) determinou a taxa de crescimento. A semeadura dos poços com mais células não encurtou o tempo necessário para a geração de esferoides, mas aumentou o número de esferoides formados. Notadamente, após a cultura prolongada dos esferoides do câncer de cólon, eles começaram a se fixar uns aos outros e formaram aglomerados de esferoides em estruturas semelhantes a uvas (Figura 3), o que impediu uma cultura homogênea e, portanto, proibiu o uso dos esferoides nos ensaios de MTT.
A Figura 4 apresenta o efeito de três tratamentos (palbociclib 10 μM, sunitinibe 10 μM e sua combinação a 10 μM cada) sobre a viabilidade de esferoides derivados de dois cânceres primários. Neste caso, um modelo PDX foi estabelecido primeiro, e as células tumorais utilizadas para a análise esferoide foram derivadas do modelo PDX9. O primeiro modelo PDX foi estabelecido usando uma amostra de câncer de cólon de um paciente masculino de 50 anos e o segundo usando uma amostra de câncer de mama de uma mulher de 62 anos. Como demonstrado na Figura 4A,B, após 3 dias de tratamento, a combinação de palbociclib mais sunitinib levou a uma redução significativa na viabilidade medida pelo ensaio de MTT. Como demonstrado na Figura 4C,D, as alterações morfológicas ocorridas com o tratamento foram muito claras. No Dia 0, todos os esferoides estavam intactos. Em contraste, no Dia 3, os esferoides tratados com o controle (DMSO) ainda estavam intactos, enquanto os esferoides tratados com a combinação foram desmontados, e sua morfologia estava "aberta", com as células se desprendendo da estrutura sólida, sugerindo a destruição da estrutura esferoide.
A Figura 5 apresenta o acompanhamento dos esferoides ao longo do tempo. Esses esferoides, gerados a partir de células de câncer de mama derivadas de uma paciente de 44 anos, foram tratados com uma de duas combinações (trastuzumabe [10 μg/mL] mais vinorelbina [1 μg/mL], ou 5-fluorouracila [200 μM] mais cisplatina [300 μM]). Como mostrado na Figura 5A, o tamanho dos esferoides tratados com 5-fluorouracil mais cisplatina foi reduzido no Dia 3, e os esferoides foram completamente destruídos no Dia 7. Em contraste, o tratamento com trastuzumabe mais vinorelbina teve apenas um pequeno efeito sobre a morfologia dos esferoides (por exemplo, algum nível de uma estrutura "aberta"), mas o efeito não foi significativo. A Figura 5B apresenta a variação média do diâmetro dos esferoides em relação ao Dia 0 (cinco esferoides foram acompanhados em cada grupo de tratamento).
Figura 1: Visão geral do protocolo para estabelecer esferoides 3D a partir de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliar sua sensibilidade a drogas. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2: Formação de esferoides a partir de uma cultura de células primárias de câncer de cólon ao longo do tempo pelo número de células inicialmente semeadas. Diferentes números de células foram semeadas em "meio de cultura 3D" em placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e observadas ao microscópio (aumento de 4x). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esferoides de células primárias de câncer de cólon (com semeadura celular inicial de 2.000 por poço) após 12 dias em cultura. Os dois exemplos (A,B) mostram aglomerados criados pela fixação de esferoides entre si (ampliação de 10x). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos do palbociclib (10 μM), do sunitinibe (10 μM) e sua combinação (10 μM cada) em esferoides de células tumorais primárias, incluindo câncer de cólon e mama (derivado do PDX). Um ensaio de MTT foi conduzido em esferoides derivados de (A) células de câncer de cólon e (B) de câncer de mama. Os sinais MTT foram normalizados para valores de células tratadas com DMSO. Os valores representam as médias de quatro a oito repetições. *p < 0,05 versus um único agente (teste t). Os efeitos dos diversos tratamentos sobre o crescimento celular também foram avaliados microscopicamente no Dia 0 e após 3 dias de tratamento dos esferoides derivados de (C) células de câncer de cólon e (D) de mama (aumento de 10x). Barra de escala = 100 μm. A figura é adaptada de Moskovits et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos do trastuzumabe (10 μg/mL) mais vinorelbina (1 μg/mL) e 5-fluorouracila (200 μM) mais cisplatina (300 μM) em esferoides derivados do câncer de mama ao longo do tempo. (A) Cada poço continha um esferoide e foi monitorado ao longo do tempo ao microscópio (aumento de 10x). Barra de escala = 100 μm. (B) A mudança no diâmetro dos esferoides (em relação ao Dia 0) pela duração do tratamento. *p = 0,05 para 5-fluorouracila mais cisplatina versus controles (teste t). Cada grupo de tratamento incluiu de quatro a seis poços, com um esferoide em cada poço. A variação média é apresentada. As barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo descreve um método simples para gerar culturas de células primárias 3D (esferoides) derivadas de amostras tumorais humanas. Esses esferoides podem ser usados para várias análises, incluindo a avaliação de potenciais candidatos a fármacos e combinações de fármacos, a identificação de potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e a investigação dos mecanismos de resposta e resistência. O protocolo utiliza células tumorais primárias derivadas diretamente de amostras de pacientes ou células tumorais de modelos PDX, que podem ser estabelecidas usando amostras de pacientes. Esta última abordagem permite a realização de experimentos in vitro e in vivo com o mesmo tumor primário. A consistência já foi demonstrada nos resultados de experimentos de sensibilidade a fármacos entre modelos PDX e culturas 3D derivadas dessesmodelos9, apoiando a relevância dessa abordagem in vitro/in vivo .
As principais vantagens do protocolo atual incluem sua ampla aplicabilidade à maioria dos tumores sólidos e seu custo-efetividade, que decorre de sua compatibilidade com as capacidades/equipamentos típicos dos laboratórios de pesquisa/biologia celular do câncer (ou seja, sem necessidade de equipamentos especializados ou terceirização). Além disso, o protocolo atual gera uma população de esferoides homogênea, o que permite o uso de ensaios quantitativos de viabilidade de alto rendimento (por exemplo, MTT). A geração de uma população esferoide homogênea é importante para a obtenção de resultados significativos, pois estudos têm demonstrado que o tamanho do esferoide afeta a resposta ao tratamento. Esferoides maiores, ao contrário de esferoides menores, são caracterizados por um núcleo necrótico. No entanto, a maioria das células está no estágio de crescimento linear em esferoides menores. Além disso, o tamanho do esferoide também afeta a rigidez de sua estrutura tecidual, o que poderia afetar a difusão de compostos (como os usados para os ensaios de viabilidade) para o esferoide14. A principal limitação do protocolo atual é que, mesmo com sua ampla aplicabilidade, há casos em que a abordagem falha em gerar esferoides. É importante ressaltar que tal falha não é específica do tipo tumoral, mas sim específica do paciente. Estudos adicionais são necessários para explorar por que amostras tumorais de certos pacientes não formam esferoides usando este protocolo.
O protocolo atual baseia-se em dois princípios fundamentais: (1) ter uma suspensão celular sem aglomerados celulares (isto é, uma suspensão de célula única) e (2) usar uma placa de fixação ultrabaixa com um meio contendo 5% de matriz de membrana basal (uma matriz extracelular solubilizada). O número inicial de células semeadas afeta o número de esferoides que são formados, mas não o tempo necessário para a formação esferoide, sugerindo que cada esferoide é gerado a partir de uma única célula tumoral. Notavelmente, o agrupamento de esferoides ocorre, particularmente após incubação prolongada. Este agrupamento interrompe a cultura homogênea e proíbe o uso de MTT (devido à dificuldade em dispensar um número igual de esferoides em cada poço). Este agrupamento pode ser evitado diluindo-se a cultura e transferindo-se os esferoides para poços maiores. Se uma cultura homogênea não puder ser obtida, ensaios de MTT não podem ser usados, embora a avaliação morfológica e a medida dos diâmetros esferoides ainda possam ser realizadas. Deve-se notar que a avaliação morfológica é mais trabalhosa, pois requer a alocação de um esferoide por poço e o monitoramento de cada esferoide ao microscópio.
A determinação do número apropriado de esferoides para um ensaio de MTT é importante para a sua interpretação. Assim, recomenda-se primeiro gerar uma curva padrão com números conhecidos de esferoides (por exemplo, 50, 100, 200 e 400 por poço, em repetições) para determinar o número ideal de esferoides para o ensaio MTT. O meio da faixa linear do gráfico deve ser usado para a análise de modo que haja esferoides suficientes para detectar um sinal, mas não muitos (ou seja, para que a fase de platô do sinal não seja atingida). Além disso, o uso da faixa intermediária permite manter o sinal dentro da faixa linear em casos de resposta à droga (i.e., sinal reduzido), bem como de não resposta (i.e., crescimento contínuo do esferoide e aumento do sinal). Por fim, como o ensaio de MTT avalia a atividade metabólica celular, que pode ser diferente entre tumores de diferentes pacientes, uma curva padrão deve ser gerada para cada amostra de tumor primário.
Em resumo, este protocolo para gerar modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e avaliar sua sensibilidade a drogas usando um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exame morfológico ao microscópio representa uma ferramenta valiosa e biologicamente relevante que complementa as abordagens 2D in vitro atuais, bem como as abordagens in vivo .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
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