Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Valutazione dei cambiamenti nella plasticità sinaptica utilizzando un modello di trauma cranico chiuso sveglio di lieve lesione cerebrale traumatica

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

Qui, è dimostrato come un modello di lesione a testa chiusa sveglia può essere utilizzato per esaminare gli effetti della lesione cerebrale traumatica lieve ripetuta (r-mTBI) sulla plasticità sinaptica nell'ippocampo. Il modello replica importanti caratteristiche di r-mTBI nei pazienti e viene utilizzato in combinazione con l'elettrofisiologia in vitro .

Abstract

Le lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) sono un problema di salute prevalente in Nord America. Vi è una crescente pressione per utilizzare modelli ecologicamente validi di mTBI a testa chiusa in ambito preclinico per aumentare la traducibilità alla popolazione clinica. Il modello di lesione a testa chiusa (ACHI) utilizza un impattatore corticale controllato modificato per fornire lesioni a testa chiusa, inducendo deficit comportamentali clinicamente rilevanti senza la necessità di una craniotomia o l'uso di un anestetico.

Questa tecnica normalmente non induce decessi, fratture del cranio o emorragie cerebrali ed è più coerente con l'essere una lesione lieve. In effetti, la natura lieve della procedura ACHI la rende ideale per gli studi che indagano l'mTBI ripetitivo (r-mTBI). Prove crescenti indicano che r-mTBI può provocare una lesione cumulativa che produce sintomi comportamentali, cambiamenti neuropatologici e neurodegenerazione. r-mTBI è comune nei giovani che praticano sport e queste lesioni si verificano durante un periodo di robusta riorganizzazione sinaptica e mielinizzazione, rendendo la popolazione più giovane particolarmente vulnerabile alle influenze a lungo termine di r-mTBI.

Inoltre, r-mTBI si verifica nei casi di violenza intima del partner, una condizione per la quale ci sono poche misure di screening oggettive. In questi esperimenti, la funzione sinaptica è stata valutata nell'ippocampo in ratti giovani che avevano sperimentato r-mTBI utilizzando il modello ACHI. A seguito delle lesioni, è stata utilizzata un'affettatrice tissutale per realizzare fette di ippocampo per valutare la plasticità sinaptica bidirezionale nell'ippocampo a 1 o 7 giorni dopo l'r-mTBI. Nel complesso, il modello ACHI fornisce ai ricercatori un modello ecologicamente valido per studiare i cambiamenti nella plasticità sinaptica dopo mTBI e r-mTBI.

Introduction

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute significativo, con ~ 2 milioni di casi in Canada e negli Stati Uniti ogni anno 1,2. Il trauma cranico colpisce tutte le fasce d'età e i generi e ha un tasso di incidenza maggiore di qualsiasi altra malattia, in particolare il cancro al seno, l'AIDS, il morbo di Parkinson e la sclerosi multipla3. Nonostante la prevalenza del trauma cranico, la sua fisiopatologia rimane poco conosciuta e le opzioni di trattamento sono limitate. In parte, ciò è dovuto al fatto che l'85% di tutti i TBI sono classificati come lievi (mTBI) e in precedenza si pensava che l'mTBI producesse solo cambiamenti comportamentali limitati e transitori senza conseguenze neuropsichiatriche a lungo termine 4,5. È ormai riconosciuto che il recupero di mTBI può richiedere settimane o anni5,6, precipitare condizioni neurologiche più gravi4 e che anche ripetuti impatti "sub-concussivi" influenzano il cervello7. Questo è allarmante in quanto gli atleti in sport come l'hockey / calcio hanno >10 impatti sub-concussivi per partita / sessione di allenamento 7,8,9,10.

Gli adolescenti hanno la più alta incidenza di mTBI, e in Canada, circa uno su 10 adolescenti cercherà assistenza medica per una commozione cerebrale correlata allo sport ogni anno11,12. In realtà, qualsiasi impatto sub-concussivo alla testa o mTBI può causare danni diffusi al cervello, e questo potrebbe anche creare uno stato più vulnerabile per lesioni successive e / o condizioni neurologiche più gravi 13,14,15,16,17. In Canada, è riconosciuto legalmente tramite la legge di Rowan che una lesione precedente può aumentare la vulnerabilità del cervello a ulteriori lesioni18, ma la comprensione meccanicistica di r-mTBI rimane tristemente inadeguata. È chiaro, tuttavia, che singoli e r-mTBI possono influire sulla capacità di apprendimento durante gli anni scolastici 19,20, avere esiti specifici per sesso 21,22,23,2 4 e compromettere la capacità cognitiva più tardi nella vita16,25,26. In effetti, le analisi di coorte associano fortemente r-mTBI all'inizio della vita con demenza più tardi27,28. r-mTBI è anche potenzialmente associato a encefalopatia traumatica cronica (CTE), che è caratterizzata dall'accumulo di proteina tau iperfosforilata e atrofia corticale progressiva e precipitata da infiammazione significativa 27,29,30,31. Sebbene i legami tra r-mTBI e CTE siano attualmente controversi32, questo modello consentirà di esplorarli in modo più dettagliato in un contesto preclinico.

Un mTBI è spesso descritto come una "lesione invisibile", poiché si verifica all'interno di un cranio chiuso ed è difficile da rilevare anche con le moderne tecniche di imaging33,34. Un modello sperimentale accurato di mTBI dovrebbe aderire a due principi. In primo luogo, dovrebbe ricapitolare le forze biomeccaniche normalmente osservate nella popolazione clinica35. In secondo luogo, il modello dovrebbe indurre esiti comportamentali eterogenei, qualcosa che è anche altamente prevalente nelle popolazioni cliniche36,37,38. Attualmente, la maggior parte dei modelli preclinici tende ad essere più grave, coinvolgendo craniotomia, contenzione stereotassica della testa, anestesia e impatti corticali controllati (CCI) che producono danni strutturali significativi e deficit comportamentali più estesi di quelli normalmente osservati clinicamente33. Un'altra preoccupazione con molti modelli preclinici di commozione cerebrale che coinvolgono craniotomie è che questa procedura stessa crea infiammazione nel cervello, e questo può esacerbare i sintomi di mTBI e neuropatologia da qualsiasi lesione successiva39,40. L'anestesia introduce anche diversi confondimenti complessi, tra cui la riduzione dell'infiammazione 41,42,43, la modulazione della funzione microgliale44, il rilascio di glutammato 45, l'ingresso di Ca2+ attraverso i recettori NMDA 46, la pressione intracranica e il metabolismo cerebrale 47. L'anestesia introduce ulteriormente confusioni aumentando la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB), l'iperfosforilazione tau e i livelli di corticosteroidi, riducendo la funzione cognitiva 48,49,50,51. Inoltre, le lesioni diffuse e a testa chiusa rappresentano la stragrande maggioranza degli mTBI clinici52. Consentono inoltre di studiare meglio la moltitudine di fattori che possono influenzare i risultati comportamentali, tra cui il sesso21, l'età 53, l'intervallo interlesionale15, la gravità54 e il numero di lesioni23.

La direzione delle forze accelerative / decelerative (verticali o orizzontali) è anche una considerazione importante per i risultati comportamentali e molecolari. La ricerca di Mychasiuk e colleghi ha confrontato due modelli di mTBI diffusi a testa chiusa: calo di peso (forze verticali) e impatto laterale (forze orizzontali)55. Sia le analisi comportamentali che quelle molecolari hanno rivelato esiti eterogenei dipendenti dal modello e dal sesso dopo mTBI. Pertanto, i modelli animali che aiutano a evitare le procedure chirurgiche, pur incorporando forze lineari e rotazionali, sono più rappresentativi delle condizioni fisiologiche in cui queste lesioni si verificano normalmente33,56. Il modello ACHI è stato creato in risposta a questa esigenza, consentendo l'induzione rapida e riproducibile di mTBI nei ratti evitando procedure (cioè l'anestesia) che sono note per influenzare le differenze di sesso57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L'approvazione per tutte le procedure animali è stata fornita dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Victoria in conformità con gli standard del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Tutti i ratti Long-Evans maschi sono stati allevati internamente o acquistati (vedi la tabella dei materiali).

1. Condizioni di stabulazione e di allevamento

  1. Consentire agli animali di acclimatarsi al loro ambiente di stabulazione per 1 settimana prima dello svezzamento al giorno postnatale (PND) 21.
  2. Mantenere i ratti in gabbia standard a 22,5 °C ± 2,5 °C, con accesso ad libitum a cibo e acqua, con un ciclo luce/buio di 12 ore.
  3. Raggruppa e ospita gli animali con due o tre compagni di cucciolata abbinati al sesso e assegnali in modo casuale a condizioni fittizie o r-mTBI.
  4. Eseguire tutte le procedure tra le 7:30 e le 23:30.

2. Impostazione della procedura di trauma cranico chiuso sveglio

  1. Posizione a 2,75 pollici. tampone in schiuma a bassa densità (100 cm x 15 cm x 7 cm) sotto il dispositivo d'urto per consentire il movimento rotazionale della testa.
    NOTA: Il tampone di schiuma aveva una costante di molla di ~ 2.500 N / m ma può variare tra 3.100 e 5.600 N / m58. Il livello di fermezza (basso, medio e alto) non ha dimostrato di essere predittivo dell'esito dell'infortunio59. Il tampone di schiuma è un materiale non consumabile. Normalmente viene sostituito annualmente o se sporco o danneggiato.
  2. Accendere il dispositivo di impatto corticale modificato (Figura 1A) e impostare la velocità su 6 m/s.
    NOTA: Queste specifiche sono progettate per provocare una compromissione neurologica acuta nei ratti giovani e adolescenti in età analoga alle caratteristiche di un mTBI, ma tali parametri potrebbero non essere adatti per animali anziani o altre specie (ad esempio, topi o furetti). Per una revisione dei parametri ACHI comuni, vedere60.

3. Induzione di mTBI

  1. Quando i ratti raggiungono PND 24, spostarli nella stanza delle procedure dove verranno eseguite le procedure. Assicurati che questa stanza sia separata dal normale ambiente abitativo.
  2. Posizionare delicatamente il ratto in un cono di contenuta, assicurandosi che il muso e le narici siano vicini alla piccola apertura del cono per consentire un'adeguata ventilazione. Utilizzare un fermaglio per capelli di plastica per tenere il cono chiuso all'estremità caudale per impedire il movimento una volta che il topo è posizionato nel cono di cono.
    1. Utilizzare i punteggi di ritenuta per registrare la conformità o la tolleranza degli animali con il cono di ritenuta e la procedura ACHI.
      NOTA: Il punteggio di ritenuta può essere utilizzato come valutazione dello stress negli animali. Pertanto, i criteri di esclusione possono essere sviluppati utilizzando il punteggio di contenzione per ridurre la variabilità tra i soggetti che sorge a causa di un'eccessiva risposta allo stress.
      1. Dai un punteggio da 0 a 4 in base alla volontà dell'animale di entrare nel cono, ai suoi movimenti e vocalizzazioni. Dai un punteggio di 0 se non c'è resistenza al contenimento, mentre un punteggio di 1 corrisponde all'animale che gira 1-2x e poca o nessuna vocalizzazione o contorcersi. Dai un punteggio di 2 se l'animale ha compiuto 2-3 volte e mostra qualche vocalizzazione o contorcersi. Dare un punteggio di contenimento di 3 se l'animale ha girato 5-10x e mostra più vocalizzazioni e dimenarsi. Infine, dai un punteggio di 4 se l'animale ha girato più di 10x con frequenti vocalizzazioni e contorcersi.
        NOTA: Queste informazioni si trovano anche nella scheda di valutazione stessa (Tabella supplementare S1 e Tabella supplementare S2).
  3. Mentre il ratto è trattenuto, posizionare manualmente il casco (Figura 1B) sopra la linea mediana, con il disco di puntamento sopra il lobo parietale sinistro (Figura 1C,D).
  4. Posizionare il ratto sul tampone di schiuma e impostare manualmente il dispositivo d'urto sulla posizione Estendi . Abbassare manualmente la punta del dispositivo d'urto in modo che entri in contatto con il disco di puntamento sul casco. Impostare manualmente il dispositivo di simulazione sulla posizione Retrazione per fare in modo che il dispositivo d'urto si ritiri 10 mm sopra il casco.
  5. Utilizzare la manopola sul braccio stereotassico per abbassare la punta dell'impatto di 10 mm in modo che tocchi nuovamente il disco di puntamento sul casco. Ruotare l'interruttore Impact in modo che la testa dell'animale venga accelerata rapidamente per 10 mm a 6 m/s.
  6. Una volta attivato il dispositivo, rimuovere immediatamente l'animale dal cono di ritenuta e procedere all'esecuzione di un protocollo di valutazione neurologica immediato (NAP).
    NOTA: Per gli esperimenti attuali, questo protocollo è stato ripetuto otto volte in totale a intervalli di 2 ore.

4. Induzione di lesioni fittizie

  1. Seguire tutte le procedure sperimentali come descritto sopra nella sezione 3, ma posizionare il ratto adiacente al percorso del pistone d'impatto, in modo da non riportare lesioni.

5. Protocollo di valutazione neurologica

NOTA: Il NAP può essere utilizzato per misurare il livello di coscienza, così come il funzionamento cognitivo e sensomotorio.

  1. Al basale e immediatamente dopo l'induzione dell'mTBI o della lesione fittizia, valutare i ratti utilizzando il NAP come descritto in56,61. Su un tavolo, posizionare la gabbia domestica dei ratti e una gabbia di recupero distanziata di 100 cm. Centrare uniformemente la trave di bilanciamento sopra entrambe le gabbie. Inoltre, posizionare un asciugamano piegato o un'imbottitura aggiuntiva sotto la trave di equilibrio.
  2. Se necessario, valutare il livello di coscienza. Se gli animali non rispondono dopo l'mTBI, valutare l'apnea (cessazione della respirazione) e qualsiasi ritardo nel riflesso di raddrizzamento utilizzando un cronometro per registrare il tempo impiegato dall'animale per riprendere la respirazione e/o raddrizzarsi da posizione supina in posizione prona.
    NOTA: La perdita del riflesso raddrizzante e l'apnea sono rare con il modello ECCHI, ma possono occasionalmente essere osservate negli animali giovani.
  3. Valutare la funzione cognitiva e sensomotoria del ratto utilizzando la seguente sequenza di test. Somministrare rapidamente questi test in successione dopo la valutazione della coscienza.
    NOTA: La somma di questi quattro test produce un punteggio totale su 12, se non ci sono deficit comportamentali osservati. I deficit sminuiscono questo punteggio.
    1. Risposta di sorpresa
      1. Metti il topo nella gabbia di recupero vuota e batti forte (50 cm) sopra la gabbia. Registrare la risposta dell'animale al rumore utilizzando il seguente sistema di punteggio:
        3 = Reazione rapida al suono (ad esempio, movimento dell'orecchio / contrazioni, salto, blocco di tutto il corpo).
        2 = Reazione lenta o leggera reazione di congelamento al suono.
        1 = Si osservano solo movimenti dell'orecchio.
        0 = Nessuna reazione al suono.
    2. Estensione dell'arto
      1. Con il raggio (100 cm di lunghezza x 2 cm di larghezza x 0,75 cm di spessore) posizionato orizzontalmente attraverso la casa del ratto e le gabbie di recupero, raccogliere il ratto per la base della coda e tenerlo vicino al raggio. Assicurati che il topo sia abbastanza vicino da poterlo afferrare facilmente. Valuta la capacità del ratto di estendere entrambi gli arti verso il raggio con il seguente sistema di punteggio:
        3 = Estensione completa di entrambi gli arti anteriori e afferra la trave.
        2 = Solo un arto è esteso.
        1 = Estensione intermittente o retrazione degli arti anteriori.
        0 = Gli arti anteriori sono molli/nessuna estensione.
    3. Camminata a trave
      1. Posizionare l'animale al centro della trave orizzontale al segno di 50 cm di fronte alla sua gabbia domestica. Assicurarsi che il raggio sia equamente distanziato tra la gabbia domestica del ratto e la gabbia di recupero (posizionata a ~ 80 cm di distanza). Permetti al topo di camminare attraverso la trave. Valutare la capacità del ratto di bilanciare e camminare con il seguente sistema di punteggio:
        3 = Cammina con successo attraverso la trave con meno di due piedi scivola entro 10 s.
        2 = Cammina con successo il raggio, ma si osservano più di due scivolamenti del piede.
        1 = Movimento non locomotore, movimento "nuotatore".
        0 = Incapace di camminare lungo la trave o di muoversi entro 10 secondi.
    4. Trave rotante
      1. Riposizionare il ratto al centro del raggio, assicurandosi che il ratto sia bilanciato. Sollevare la trave di 80 cm sopra un asciugamano o una superficie imbottita e iniziare a ruotare manualmente la trave ad una velocità di rotazione al secondo per 4 s (per un totale di quattro rotazioni). Valuta la capacità del ratto di rimanere sul raggio mentre ruota con il seguente sistema di punteggio:
        3 = Il ratto rimane sulla trave per tutte e quattro le rotazioni.
        2 = Il ratto cade alla quarta rotazione.
        1 = Il ratto cade sulla seconda o terza rotazione.
        0 = Il ratto cade durante la prima rotazione.
  4. Al completamento del NAP, riportare mTBI e ratti fittizi nelle loro gabbie domestiche. Ripetere l'operazione se necessario per le procedure r-mTBI. Monitorare il benessere degli animali a seguito di lesioni con la lista di controllo per il monitoraggio lato gabbia (file supplementare 1). Se vi è qualche indicazione di anomalia (qualsiasi punteggio che non è N) durante il monitoraggio lato gabbia, un punteggio completo del dolore deve essere preso con la scala del dolore e la lista di controllo del monitoraggio avanzato dopo l'impatto della testa (file supplementare 2).

6. Preparazione delle fette

NOTA: Nel presente studio, la plasticità sinaptica è stata valutata negli animali dopo r-mTBI a 1 o 7 giorni dopo mTBI. In questi giorni, gli animali sono stati portati individualmente nel laboratorio in gabbie coperte prima del sacrificio.

  1. Conservare in frigorifero (-20 °C) durante la notte tutti gli strumenti chirurgici (Figura 2A) necessari per la realizzazione di fette di ippocampo: forbici standard, forbici da dissezione, pinze, rongeur, spatole e blocchi refrigeranti.
    NOTA: La colla per tessuti e la camera di incubazione non devono essere refrigerate.
  2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO 4, 25 mM NaHCO 3, 2 mM CaCl 2,1,3 mM MgCl 2 e 10 mM destrosio (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    NOTA: La soluzione principale di aCSF deve essere continuamente bollente con carbogeno (95% O 2/5% CO2) per tutta la durata del protocollo.
  3. Prima di eutanasia l'animale (punto 6.8), preparare 12,5 ml di agarosio. Sciogliere 0,25 g di agarosio in 12,5 mL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) mediante microonde in un tubo conico da 50 mL con incrementi di 10 s.
  4. Tenere l'agarosio caldo (42 °C) e agitare in una piastra riscaldante per evitare che si solidifichi.
  5. Installare una stazione di taglio su ghiaccio, comprendente una capsula di Petri e un piccolo becher (50 ml) riempito con aCSF ghiacciato (4 °C) e una capsula di Petri rovesciata con un pezzo di carta da filtro bagnata sulla parte superiore (Figura 2A). Bollire continuamente l'aCSF nel piccolo becher con carbogen.
  6. Riscaldare il bagnomaria a 32 °C. Riempire la camera di recupero con aCSF e bollire continuamente con carbogeno (Figura 2B).
  7. Trasportare l'animale nella stanza sperimentale.
  8. Anestetizzare l'animale usando isoflurano al 5% come inalante (fino alla mancanza di un riflesso di ritiro) e poi decapitarlo rapidamente usando una piccola ghigliottina.
  9. Sezionare il cervello dal cranio nella capsula di Petri piena di aCSF ghiacciato (4 ° C), tenendo il cranio immerso nell'aCSF per aiutare a raffreddare rapidamente il tessuto.
    NOTA: Questa procedura richiede normalmente meno di 5 minuti, ma la velocità di rimozione del cervello non è un fattore critico se il cervello è immerso in aCSF refrigerato.
  10. Posizionare il cervello nel piccolo becher di aCSF raffreddato e carbogenato per pulire e raffreddare ulteriormente il campione.
  11. Sposta il cervello verso la piastra di Petri capovolta e posizionala sulla carta da filtro. Usa un bisturi affilato per rimuovere il cervelletto e la corteccia prefrontale per "bloccare" il cervello. Separare i due emisferi facendo un taglio lungo la linea mediana del cervello.
    Nota : il seguente protocollo viene eseguito un emisfero alla volta. È imperativo che l'emisfero attualmente in preparazione rimanga immerso nel becher di aCSF carbogenato ghiacciato (4 °C).
  12. Per creare fette di ippocampo trasversali, posizionare l'emisfero sulla superficie mediale. Inclinare la lama di un bisturi a ~ 30 ° verso l'interno e rimuovere una fetta sottile dalla superficie dorsale del cervello per fornire una superficie piatta per il cervello da montare sul pistone utilizzato dall'affettatrice. Capovolgere il cervello sulla superficie dorsale e tamponare delicatamente il tessuto su carta da filtro asciutta per rimuovere l'eccesso di aCSF. Usando la colla cianoacrilica, attaccare la superficie dorsale del cervello al pistone, lasciando la superficie ventrale in posizione verticale.
    NOTA: Assicurarsi che la colla non scorra oltre il bordo del pistone, in quanto ciò causerà l'adesione al tubo metallico utilizzato per contenere l'agarosio e impedirà il movimento del pistone.
  13. Estendere il tubo esterno del pistone sopra il cervello e versare l'agarosio liquido nel tubo fino a quando il cervello è completamente coperto. Solidificare rapidamente l'agarosio bloccando un blocco di raffreddamento sul tubo del pistone (Figura 2A).
  14. Posizionare il pistone nella camera dell'affettatrice e fissare la camera con una vite. Fissare la lama e aggiungere aCSF ossigenato e ghiacciato alla camera dell'affettatrice.
  15. Sul filtro dei dati (Figura 2B), impostare la velocità di taglio su 4, l'oscillazione su 6 e impostare l'interruttore di taglio continuo/singolo su continuo. Spingere start per iniziare a sezionare il cervello a 400 μm.
  16. Mentre l'affettatrice seziona il cervello, utilizzare una pipetta Pasteur di grande diametro per trasferire ogni fetta al bagno di recupero dell'aCSF ossigenato mentre viene sezionato (Figura 2C).
    NOTA: Quando ogni fetta viene tagliata, può essere posizionata in sequenza nei diversi pozzetti del bagno di recupero. Questo protocollo di solito produce tra sei e otto fette, contenenti l'ippocampo per ogni emisfero. Un atlante di ratto62 può essere utilizzato per identificare la posizione dorsale-ventrale delle singole fette nel cervello del ratto.
  17. Lasciare riposare le fette a 32 °C per 30 minuti e poi lasciare recuperare per altri 30 minuti a temperatura ambiente (23 °C).
  18. Ripetete questi passaggi per creare sezioni dal secondo emisfero.

7. Elettrofisiologia di campo

NOTA: per acquisire registrazioni del campo extracellulare dal giro dentato (DG), attenersi alla seguente procedura. Dopo il recupero di 60 minuti, le singole fette di ippocampo sono pronte per le registrazioni sul campo extracellulare.

  1. Utilizzando un estrattore di micropipette disponibile in commercio, tirare elettrodi di registrazione (1-2 MΩ) da capillari di vetro borosilicato da 10 cm con un diametro esterno di 1,5 mm e un diametro interno di 1,1 mm.
    NOTA: l'elettrodo di registrazione deve avere una resistenza di ~1 MΩ e le punte devono avere una dimensione di ~1 mm. La coerenza nei parametri dell'elettrodo è importante per una buona registrazione.
  2. Accendere il computer e le apparecchiature da utilizzare per le registrazioni: amplificatore, digitalizzatore, stimolatore, micromanipolatore, regolatore di temperatura, luce del microscopio e pompa per vuoto.
  3. Riempire un becher con aCSF e collegarlo a un sistema di perfusione a gravità controllata. Aprire la valvola aCSF sul sistema di perfusione per iniziare un flusso di aCSF attraverso la camera di perfusione. Mantenere una portata di circa uno o due gocciolamenti/s o 2 ml/min. ACSF carbogenato continuo per la durata delle registrazioni elettrofisiologiche.
    NOTA: È imperativo mantenere un tasso di gocciolamento costante di aCSF carbogenato durante le registrazioni sul campo. È inoltre imperativo che l'elettrodo di riferimento sia completamente immerso in aCSF.
  4. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire una fetta di ippocampo dal bagno di recupero alla camera di perfusione che viene continuamente perfusa con aCSF carbogenato e mantenuta a 30 ± 0,5 °C. Orientare la fetta di cervello in modo che il giro dentato e lo strato di cellule granulari siano visibili nel campo visivo. Stabilizzare la fetta con pesi di filo piegati. Avviare il software del computer per l'acquisizione dei dati.
    NOTA: può essere utile spegnere la pompa per vuoto durante questa fase per consentire la libera manipolazione del tessuto. Questo dovrebbe essere fatto rapidamente in quanto troppa manipolazione può danneggiare il tessuto. Inoltre, la camera di perfusione può traboccare con aCSF se questo richiede troppo tempo. Una volta che il tessuto è orientato correttamente e stabilizzato, accendere la pompa per vuoto.
  5. Utilizzare un microscopio verticale per visualizzare il DG con ottica obliqua. Posizionare un elettrodo concentrico bipolare stimolante per attivare le fibre del percorso perforante mediale (MPP) nel terzo centrale dello strato molecolare. Quindi, posizionare una micropipetta di vetro, riempita con aCSF nell'MPP (Figura 3A,B). Inizia con gli elettrodi più distanti (cioè l'elettrodo stimolante vicino a CA3 e l'elettrodo di registrazione appena sopra il genu del DG), poiché toccando il tessuto causerà danni alle fibre.
    NOTA: In modo ottimale, tutte le registrazioni dovrebbero avere gli elettrodi posizionati equidistanti dallo strato cellulare, a circa 200 μm di distanza.
  6. Una volta posizionati gli elettrodi stimolanti e di registrazione, visualizzare le risposte di campo evocate utilizzando un amplificatore, un digitalizzatore e un software di registrazione.
  7. Per trovare un potenziale postsinaptico eccitatorio di campo adatto (fEPSP), stimolare il tessuto con impulsi di corrente di 0,12 ms a 0,2 Hz (ogni 5 s) quando l'utente è abile nel trovare risposte, o a 0,067 Hz (ogni 15 s) per gli utenti meno esperti per evitare la sovrastimolazione. Assicurarsi che la fEPSP abbia un'ampiezza minima di 0,7 mV con una volée di fibre chiare inferiore alla fEPSP.
    NOTA: È fondamentale posizionare entrambi gli elettrodi equidistanti dallo strato cellulare per ottenere le massime risposte di campo e abbastanza distanti (cioè ~ 200 μm) per generare una piccola raffica di fibre. Piccoli aggiustamenti nella posizione dell'elettrodo possono aiutare a migliorare l'ampiezza della risposta, anche se questi dovrebbero essere ridotti al minimo per evitare danni ai tessuti.
  8. Determinare l'ampiezza massima della fEPSP aumentando l'intensità di stimolazione e quindi impostare l'intensità di simulazione in modo che la fEPSP sia al 70% dell'ampiezza massima.
    NOTA: l'ampiezza massima è impostata al 70% per gli studi sulla depressione a lungo termine (LTD) e al 50% per gli studi di potenziamento a lungo termine (LTP). L'ampiezza massima viene determinata regolando la forza di stimolazione fino a quando la fEPSP non aumenta più di ampiezza. Per un fEPSP con un'ampiezza massima di 2 mV, la dimensione della risposta verrebbe quindi regolata a 1,4 mV per gli studi LTD e 1,0 mV per gli studi LTP, per consentire al fEPSP di deprimersi o potenziarsi (rispettivamente).
  9. Stabilire una linea di base di precondizionamento stabile per 20 minuti con impulsi di 0,12 ms erogati a 0,067 Hz. Affinché le sezioni siano considerate stabili, cercare una variabilità del <10% nella pendenza iniziale della fEPSP e che la pendenza della linea di migliore adattamento attraverso le pendenze fEPSP tracciate sia <0,5. Procedere con i passaggi successivi della registrazione quando gli EPSP sono verificati per essere stabili per 20 minuti.
    NOTA: Vari antagonisti del recettore possono essere aggiunti all'aCSF per bloccare o migliorare LTD e LTP. Se sono necessari, assicurarsi che le fette siano esposte a questi agenti farmacologici durante questo periodo di riferimento e che siano soddisfatti i requisiti per registrazioni stabili. Per alcuni esempi, vedere63,64,65.
  10. In primo luogo, determinare i cambiamenti nelle proprietà sinaptiche di base utilizzando stimoli a impulsi accoppiati e costruendo curve input-output stimolo-risposta. Per il test a impulsi accoppiati, applicare una serie di impulsi accoppiati con un intervallo di interimpulso di 50 ms a 0,033 Hz. Per le curve input-output, applicare una serie (10) di intensità di stimolo crescenti (0,0-0,24 ms) a 0,033 Hz per tracciare la variazione delle dimensioni della risposta fEPSP.
  11. Per studiare LTD che dipende principalmente dall'attivazione dei recettori CB164,66, utilizzare un protocollo a 10 Hz (6.000 impulsi a 10 Hz). Questo protocollo richiede 10 minuti per essere somministrato.
  12. Per le registrazioni post-condizionamento, riprendere utilizzando la stimolazione a impulso singolo (0,12 ms a una frequenza di 0,067 Hz) per altri 60 minuti.
  13. Dopo la registrazione post-condizionamento, somministrare nuovamente gli stimoli a impulsi accoppiati, seguiti da una curva input-output. Confronta questi con le registrazioni basali per osservare le alterazioni nelle proprietà di rilascio presinaptico e aiutare a valutare la salute della fetta per le registrazioni a lungo termine.
  14. Durante l'analisi, essere prudenti e rispettare i criteri di esclusione nel determinare se i dati delle singole sezioni debbano essere conservati nel set di dati sulla plasticità sinaptica. Escludere le sezioni che mostrano una grande pendenza in una linea di adattamento migliore delle pendenze fEPSP durante la linea di base di precondizionamento (pendenza >0,5), instabilità nella linea di base di precondizionamento (variazione >10%) e o instabilità nel periodo di postcondizionamento (pendenza >1,5 in 50-60 minuti di postcondizionamento).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il modello di trauma cranico chiuso sveglio è un metodo praticabile per indurre r-mTBI nei ratti giovani. I ratti esposti a r-mTBI con il modello ACHI non hanno mostrato deficit comportamentali evidenti. I soggetti in questi esperimenti non hanno mostrato latenza a destra o apnea in nessun momento durante la procedura r-mTBI, indicando che si trattava effettivamente di una procedura TBI lieve. Sottili differenze comportamentali sono emerse nel NAP; Come descritto sopra, i ratti sono stati valutati su quattro compiti sensomotori (risposta di startle, estensione degli arti, camminata del fascio e raggio rotante) su una scala da 0 a 3, con 3 che non rappresentano alcuna compromissione con il compito. Pertanto, più basso è il punteggio NAP, più l'animale era compromesso. Al basale, non c'erano differenze nei punteggi NAP tra ratti sham e r-mTBI. Dopo tutte le sessioni di ACHI, i ratti r-mTBI hanno mostrato compromissioni significative all'interno dei compiti NAP rispetto agli sham (Figura 4). Tuttavia, come riportato in precedenza per gli impatti consegnati in più giorni (cioè 2 o 4 giorni), la successiva aggiunta di lesioni nel corso della giornata non ha aggravato o prodotto ulteriori deficit comportamentali. Pertanto, il modello ACHI di r-mTBI produce deficit comportamentali sottili, ma significativi, durante questi punti temporali acuti post-infortunio.

Seguendo il protocollo di lesione, le risposte di campo evocate e la plasticità sinaptica sono state esaminate nell'input MPP al DG dell'ippocampo il giorno 1 post-infortunio (PID1) e PID7. La salute delle fette è stata esaminata utilizzando fEPSP in risposta a una serie crescente di larghezze di impulso in ciascuna fetta. Come mostrato nella Figura 3C, non vi era alcuna differenza nelle curve input-output generate in fette ottenute da ratti sham e r-mTBI. Per esaminare il rilascio del trasmettitore presinaptico, sono stati somministrati una serie di impulsi accoppiati (intervallo di interimpulso di 50 ms) ed è stato calcolato il rapporto tra la dimensione del secondo fEPSP rispetto al primo fEPSP. I rapporti di impulso accoppiati non differivano tra ratti sham e r-mTBI (Figura 3D). Pertanto, questi dati indicano che r-mTBI non ha alterato la fisiologia sinaptica di base nell'input MPP al DG. Per esaminare LTD, è stato somministrato un protocollo LTD a 10 Hz per indurre un LTD dipendente dagli endocannabinoidi64. Per quanto riguarda il PID1, si è registrata una significativa diminuzione della capacità dell'MPP di input alla DG di sostenere LTD (Figura 3E). Questa riduzione della LTD è stata transitoria, tuttavia, e da PID7, fette di animali sham e r-mTBI hanno mostrato LTD equivalente (Figura 3F), sebbene vi fosse un'indicazione di una leggera tendenza per le fette di animali r-mTBI a mostrare un aumento di LTD.

Figure 1
Figura 1: La configurazione della procedura ACHI utilizzata per modellare r-mTBI . (A) Un impattatore corticale controllato modificato è stato utilizzato per spostare rapidamente la testa dell'animale di 10 mm ad una velocità di 6,0 m / s. (B, C) Casco personalizzato stampato in 3D con un sito target della corteccia parietale sinistra. (D) I soggetti sono stati collocati in un sacchetto di plastica su una piattaforma di schiuma, con il casco posizionato attorno al cono di ritenuta e posizionato in modo che il sito bersaglio sia direttamente sotto la punta del dispositivo d'impatto. Abbreviazioni: ACHI = awake closed-head injury; r-mTBI = ripetuta lesione cerebrale traumatica lieve. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Materiali e configurazione necessari per la preparazione delle fette. (A) Strumenti utilizzati per l'estrazione, il montaggio, l'affettatura e l'incubazione del cervello: (a) piatto di coltura con carta da filtro; b) vari strumenti di dissezione, tra cui forbici standard, forbici da dissezione, pinze, rongeur e spatole; c) adesivo per tessuti; d) pistone di compressione e tubo del campione; e) lama e portalame di piume; f) blocco di raffreddamento; g) camera di incubazione delle fette. (B) Affettatrice per tessuti a compressione. (C) Fette di incubazione in un bagno contenente liquido cerebrospinale artificiale continuamente ossigenato con il 95% di O 2/5% di CO2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Compromissione acuta della plasticità sinaptica in ratti maschi giovani dovuta a r-mTBI utilizzando il modello ACHI . (A) Le principali vie ippocampali. La via perforante mediale è composta dall'input dalla corteccia entorinale nel giro dentato (blu). Il percorso perforante mediale immette sinapsi sulle cellule granulari nel giro dentato (viola). (B) Fotomicrografia a campo chiaro di una fetta di cervello ippocampale (ingrandimento 4x), che mostra il posizionamento effettivo di un elettrodo stimolante bipolare (a sinistra) e di una pipetta di elettrodo di registrazione in vetro (a destra) nel percorso mediale del giro dentato. (C) Input-output plot (pendenza fEPSP) per diverse intensità di simulazione (10-300 μs) su PID1 e PID7 per ratti sham e r-mTBI. (D) Rapporti di impulso accoppiati per ratti sham e r-mTBI (intervallo di interimpulso di 50 ms). (E) Cambiamenti temporali del decorso della fEPSP prima e dopo la somministrazione di un paradigma di induzione LTD in fette ippocampali ottenute da ratti sham e r-mTBI a PID1. (F) Cambiamenti nel corso della fEPSP prima e dopo la somministrazione di un paradigma di induzione LTD in fette di ippocampo ottenute da ratti sham e r-mTBI a PID7. Abbreviazioni: ACHI = awake closed-head injury; r-mTBI = ripetuta lesione cerebrale traumatica lieve; PID = giorno post infortunio; fEPSP = potenziale postsinaptico eccitatorio di campo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Compromissione neurologica acuta in ratti maschi giovani dovuta a r-mTBI utilizzando il modello ACHI. I ratti sono stati sottoposti a otto procedure ACHI a intervalli di 2 ore nell'arco di 1 giorno, con un protocollo di valutazione neurologica condotto al basale e dopo ogni lesione. Il NAP consisteva in quattro compiti: risposta allo startle, estensione degli arti, camminata del fascio e trave rotante. Ogni compito è stato valutato su 3, dando un punteggio totale possibile di 12 per ogni sessione. I dati presentati come media ± SEM. (*) indicano p < 0,05. Abbreviazioni: ACHI = awake closed-head injury; r-mTBI = ripetuta lesione cerebrale traumatica lieve; NAP = protocollo di valutazione neurologica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare S1: Procedura ACHI informazioni sugli animali e sull'impatto. Abbreviazione: ACHI = trauma cranico chiuso sveglio. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: Punteggio di ritenuta per mTBI sveglio. Abbreviazione: mTBI = lieve lesione cerebrale traumatica. "Girarsi in moderazione" si riferisce al ricercatore che posiziona l'animale nel contenimento, prima di chiudere la borsa intorno alla coda. Dopo che la borsa è stata chiusa, l'animale non dovrebbe essere in grado di girarsi. La vocalizzazione e lo squirming dovrebbero essere valutati dopo che la borsa è stata chiusa. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Elenco di controllo per il monitoraggio lungo la gabbia. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Scala del dolore e lista di controllo per il monitoraggio avanzato. Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La maggior parte della ricerca preclinica ha utilizzato modelli di mTBI che non ricapitolano le forze biomeccaniche osservate nella popolazione clinica. Qui, viene mostrato come il modello ACHI può essere utilizzato per indurre r-mTBI nei ratti giovani. Questo modello a testa chiusa di r-mTBI presenta vantaggi significativi rispetto alle procedure più invasive. In primo luogo, l'ACHI normalmente non causa fratture craniche, emorragie cerebrali o decessi, che sarebbero tutte controindicazioni di un TBI "lieve" nelle popolazioni cliniche61. In secondo luogo, l'ACHI non richiede l'uso di craniotomie, il che è significativo perché sono note per causare risposte infiammatorie che possono esacerbare le sintomatologie e la neuropatologia67. In terzo luogo, l'ACHI non richiede l'uso dell'anestesia. Questo è anche significativo, poiché l'anestesia può avere proprietà neuroprotettive e può compromettere la plasticità sinaptica, oltre alle prestazioni di apprendimento e memoria 48,49,50,51,68. Infine, l'ACHI può produrre sottili cambiamenti transitori nella funzione neurologica che possono essere valutati immediatamente dopo l'infortunio.

Poiché l'ACHI normalmente non induce perdita di coscienza o apnea, questo modello imita mTBI in una percentuale significativa della popolazione clinica 69,70,71. Nonostante ciò, il modello ACHI ha prodotto una significativa riduzione dei punteggi NAP. Questa riduzione è persistita con ripetute somministrazioni della procedura ACHI, ma non ha esacerbato le menomazioni sensomotorie all'interno del gruppo r-mTBI. Ciò indica che il modello ACHI induce una lesione lieve analoga a quella osservata in seguito a impatti concussivi o sub-concussivi della testa nelle popolazioni cliniche72,73. Un vantaggio primario del NAP è il rilevamento di sottili deficit comportamentali osservati nel lasso di tempo acuto dopo r-mTBI. Questo rapido esame può consentire ai ricercatori di classificare i ratti in base alle loro risposte comportamentali. Tuttavia, l'uso di test comportamentali più robusti nei punti temporali subacuti e cronici può essere necessario per rilevare le sintomatologie motorie, cognitive e affettive74,75,76. È importante notare che mentre non ci sono state differenze nei punteggi NAP rispetto alle otto lesioni, il comportamento dei roditori può essere influenzato dai cambiamenti nell'ambiente e dalla familiarità con lo sperimentatore77,78. I ratti dovrebbero essere autorizzati ad acclimatarsi nella sala operatoria prima di somministrare r-mTBI o lesioni fittizie. Inoltre, è importante che un individuo sia responsabile della gestione degli impatti per garantire la coerenza.

Nonostante i vantaggi precedentemente menzionati del modello ECCHI, non è privo di limitazioni. In primo luogo, il paradigma è stato progettato per imitare il cumulo di impatti in una singola sessione e non lesioni ripetitive dopo un periodo di recupero. A seguito di una lesione, il cervello risiede in una finestra di vulnerabilità cerebrale che si estende da 1 a 5 giorni dopo l'infortunio nei roditori 15,79,80. Ricevere otto lesioni in un singolo giorno non consente lo sviluppo di cascate di lesioni acute e subacute. Pertanto, a seconda della domanda di ricerca di interesse, potrebbe essere necessario adattare il paradigma della lesione all'interno della finestra di vulnerabilità. In secondo luogo, mentre è utile limitare l'uso di anestetico, una conseguenza non intenzionale del modello ACHI è sottoporre i ratti a stress di contenzione. È stato dimostrato che l'esposizione a fattori di stress acuti e cronici può avviare una risposta infiammatoria, influenzare una varietà di comportamenti e alterare la plasticità sinaptica nell'ippocampo81,82,83.

Il protocollo sopra descritto fornisce un metodo chiaro per produrre fette di ippocampo trasversale di alta qualità da animali somministrati con r-mTBI con il modello ACHI. Inoltre, il protocollo consente registrazioni elettrofisiologiche stabili e mostra che l'ippocampo è ancora in grado di esibire plasticità sinaptica dopo r-mTBI, sebbene possano esserci interruzioni transitorie. Con qualsiasi registrazione elettrofisiologica, la salute delle fette è fondamentale per la capacità di registrare fEPSP adatti. Per preservare il tessuto cerebrale, prima di affettare, è imperativo che il cervello rimanga ghiacciato in aCSF carbogenato. La rimozione e l'affettamento del cervello dovrebbero essere fatti rapidamente, ma non se ciò avviene a scapito della cura. Questo protocollo sugli animali giovani utilizza aCSF come soluzione di taglio, ma a seconda dell'età dell'animale, possono essere necessarie soluzioni di taglio protettive (come soluzioni a base di colina, saccarosio, NMDG o glicerolo) 84,85,86.

Le registrazioni elettrofisiologiche sul campo consentono ai ricercatori di valutare la plasticità sinaptica dell'ippocampo. Tuttavia, ci sono una serie di limitazioni alla tecnica. Il processo di taglio del cervello ha dimostrato di causare cambiamenti nei numeri87 della colonna vertebrale, che potrebbero influenzare la plasticità sinaptica. L'uso di registrazioni in vivo preserverebbe i percorsi e consentirebbe di misurare la plasticità sinaptica in animali anestetizzati o vivi88. Inoltre, l'uso di registrazioni sul campo sonda le proprietà di gruppi di neuroni, ma non informa sui cambiamenti nei singoli neuroni. L'uso di registrazioni patch-clamp a cellule intere può fornire informazioni temporalmente dettagliate sulle proprietà neuronali in risposta a manipolazioni farmacologiche o optogenetiche89. Inoltre, la combinazione di registrazioni elettrofisiologiche con tecniche complementari, come l'imaging del calcio, il Western blotting, l'immunoistochimica o la microscopia elettronica, consentirebbe ai ricercatori di ottenere informazioni sui meccanismi d'azione.

I deficit cognitivi sono comunemente riportati dopo r-mTBI e l'attuale protocollo può aiutare a studiare alcuni dei processi fisiologici sottostanti associati a questi deficit. In particolare, la natura lieve della procedura ACHI apre la possibilità di esaminare i cambiamenti nella fisiologia sinaptica nel corso della vita degli animali che hanno subito r-mTBI. Il modello ACHI sembra essere un modello ecologicamente valido di mTBI che può essere utilizzato per studiare r-mTBI. Studi preliminari che utilizzano il modello ACHI hanno mostrato una compromissione neurologica acuta senza danni strutturali evidenti, somministrando uno, quattro e otto paradigmi di lesioni ripetute61,90. Studi futuri esamineranno come are-mTBI può influenzare la plasticità sinaptica durante i periodi di sviluppo e nel cervello che invecchia. Comprendendo meglio la fisiopatologia di mTBI e r-mTBI per la funzione sinaptica, la speranza è di indirizzare meglio potenziali interventi terapeutici per aiutare a ridurre la funzione cognitiva.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo tutti i membri del Christie Laboratory presso l'Università di Victoria, passati e presenti, per il loro contributo allo sviluppo di questo protocollo. Questo progetto è stato sostenuto con fondi del Canadian Institutes for Health Research (CIHR: FRN 175042) e NSERC (RGPIN-06104-2019). La grafica del cranio Figura 1 è stata creata con BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

Tags

Neuroscienze Numero 191
Valutazione dei cambiamenti nella plasticità sinaptica utilizzando un modello di trauma cranico chiuso sveglio di lieve lesione cerebrale traumatica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter