Summary
В данной статье описывается протокол иммунопанирования для ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей. Прикрепляя антитела к культуральным пластинам, мы можем отрицательно отбирать и удалять ненейрональные клетки. Мы показываем, что культуры обогащены для нейронов с использованием этого протокола, что позволяет углубленно изучить нейронные реакции на манипуляции.
Abstract
Ганглии дорсальных корешков (DRG) представляют собой периферические структуры, прилегающие к дорсальному рогу спинного мозга, в которых находятся клеточные тела сенсорных нейронов, а также различных других типов клеток. Опубликованные протоколы культивирования часто ссылаются на целые диссоциированные культуры DRG как на нейроны, несмотря на наличие фибробластов, шванновских клеток, макрофагов и лимфоцитов. В то время как эти целые культуры DRG достаточны для приложений визуализации, где нейроны могут быть различимы на основе морфологии или окрашивания, гомогенаты белка или РНК, собранные из этих культур, не являются в первую очередь нейрональными по происхождению. Здесь мы описываем последовательность иммунопанирования для культивируемых DRG мышей. Целью этого метода является обогащение культур DRG для нейронов путем удаления других типов клеток. Иммунопаннирование относится к методу удаления типов клеток путем прилипания антител к чашкам для клеточных культур. Используя эти чашки, мы можем отрицательно отбирать и уменьшать количество фибробластов, иммунных клеток и шванновских клеток в культуре. Этот метод позволяет увеличить процент нейронов в культурах.
Introduction
Ганглии дорсальных корешков (DRG) содержат клеточные тела сенсорных нейронов, которые иннервируют периферические ткани. Изучение этих нейронов позволяет нам понять механистические основы боли и сенсорных состояний. Однако DRG состоят не только из нейронов, но также содержат фибробласты, шванновские клетки, макрофаги и другие иммунные клетки1. Несмотря на наличие этих различных типов клеток, целые культуры DRG часто упоминаются в литературе как нейрональные 2,3. Эти культуры по-прежнему полезны для исследования нейронов с помощью визуализации или проточной цитометрии, что позволило бы идентифицировать нейроны путем окрашивания, размера клеток и / или морфологии. Однако для таких анализов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или вестерн-блоттинг, где культуры гомогенизируются для сбора РНК или белка, присутствие ненейрональных типов клеток может повлиять на результаты. Следовательно, необходимо увеличить долю нейрональных клеток в культурах DRG.
Иммунопаннирование — это метод, используемый для очистки различных типов клеток, включая корковые нейроны, астроциты, клетки-предшественники олигодендроцитов и микроглию. Проще говоря, он включает в себя прилипание антитела против маркера клеточной поверхности к чашке Петри, предназначенного для связывания определенных клеток (рис. 1), и его можно использовать для выбора либо за, либо против интересующих типов клеток 4,5,6. Иммунопанирование эмбриональных DRG крыс для отбора против ненейрональных клеток было описано ранее Zuchero7. Тем не менее, нам не удалось найти протокол иммунопанирования, специфичный для DRG мышей. В этом протоколе мы опираемся на основные арендаторы протокола Zuchero, но вместо этого адаптировали последовательность иммунопаннирования для обогащения культур DRG взрослых мышей (рис. 2). Это мощный инструмент для изучения установленных сенсорных нейронов в культуре. Это выгодно, поскольку позволяет использовать взрослых мышей из генетических моделей, моделей болезней и травм, так что их сенсорные нейроны могут быть изучены с большей специфичностью.
Этот протокол полезен для читателей, желающих увеличить долю нейронов в культурах DRG взрослых мышей. Тем не менее, этапы иммунопанирования также могут быть опущены, и этот протокол также может быть использован для целых культур DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Альберты (протокол 0000274).
1. Приготовление реагентов
- На 1-й день приготовьте следующие реагенты: воду для клеточных культур; поли-D-лизин - приготовить бульон, восстановив всю бутылку в 50 мл культуральной воды до исходной концентрации 100 мкг/мл, хранить при 4 °C и разбавляя бульон 1:10 в культуральной воде до конечной концентрации 10 мкг/мл; трис-HCl - приготовить бульон, растворив порошкообразный трис гидрохлорид в воде культурального качества до исходной концентрации 500 мМ (3,94 г в 50 мл), рН 9,5, стерилизовать фильтром (0,22 мкм), хранить при 4 °C и разбавить бульон 1:10 в воде культурального качества до конечной концентрации 50 мМ; вторичные антитела (козья антикрыса, -кролик и -мышь).
- На 2 день приготовьте следующие реактивы.
- Приготовьте сбалансированный раствор соли Хэнка без клеточных культур Ca 2+, Mg2+ (HBSS; HBSS-/-) и буферный физиологический раствор D-фосфата (PBS) для клеточных культур с Ca 2+ и Mg2+. Приготовьте аликвоту из ламинина и храните при температуре -80 °C сразу после получения; разбавить сырье в стерильном HBSS-/- до конечной концентрации 10 мкг/мл для рабочего сырья.
- Приготовьте 4% бычий сывороточный альбумин (BSA), растворив 400 мг BSA в 7,5 мл D-PBS (pH 7,4), доведите объем до 10 мл, стерилизуйте фильтром (0,22 мкм), аликвоту и храните при -20 °C. Приготовьте 0,2% BSA, разбавив 750 мкл 4% BSA в 14,25 мл D-PBS.
- Приготовьте 0,4% запас ДНК, добавив 1 мл сбалансированного солевого раствора Эрла (EBSS) на 12 500 единиц ДНК, стерилизуйте фильтром (0,22 мкм), аликвоту и храните при -20 ° C. Приготовьте буфер для панирования (0,02% BSA), добавив 3 мл 0,2% BSA и 100 мкл 0,4% ДНК в 27 мл D-PBS. Подготовьте первичные антитела (CD45, PDGRFβ, O4).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется гибридома O48,9, однако 10 мкг коммерчески доступного антитела O4 также были бы уместны. - Приготовьте бульон комбинированной коллагеназы, растворив флакон с комбинированной коллагеназой (50 мг) в 5 мл HBSS-/-, аликвоты, и храните при -20 ° C. Приготовьте рабочий запас на двух мышей, добавив 500 мкл подогретой комбинированной коллагеназы и 50 мкл подогретой 0,4% ДНКазы к 4,5 мл HBSS-/-.
- Приготовьте низкий овомукоид, добавив 3 г BSA к 150 мл D-PBS, затем добавьте 3 г ингибитора трипсина и перемешайте до растворения. Отрегулируйте рН до 7,4 и доведите объем до 200 мл с помощью D-PBS. Фильтруют, стерилизуют, готовят аликвоты объемом 1 мл и хранят при температуре -20 °C. В день вскрытия смешайте 1 мл низкого овомукоида с 9 мл D-PBS для рабочего раствора.
- Приготовьте 15% BSA, растворив 7,5 г BSA в 50 мл HBSS-/- (поместите на шейкер для полного растворения), фильтруйте, стерилизуйте и храните при температуре 4 ° C.
- Приготовьте 50 мл нейронной среды, добавив 23,2 мл DMEM, 23,2 мл нейробазальной среды, 500 мкл глутамакса, 500 мкл пирувата натрия, 500 мкл пенициллина/стрептомицина (аликвота сразу по прибытии и храните при -20 °C), 500 мкл инсулина (5 мкг/мл в конечном итоге), 500 мкл SATO, 50 мкл N-ацетил-L-цистеина (NAC; 5 мкг/мл в конечном итоге), и 1,000 мкл B27+ (немедленно аликвотировать и хранить при -20 ° C после получения).
- Приготовьте запас инсулина, растворив в воде культурального качества до концентрации 0,5 мг / мл (50 мг в 100 мл), отрегулируйте pH до 7,4, стерилизуйте фильтром (0,22 мкм), приготовьте аликвоты 500 мкл и храните при -20 ° C.
- Приготовьте запас SATO, объединив 20 мкл прогестерона (2,5 мг в 100 мкл этанола), 800 мкл селенита натрия (4 мг в 10 мл нейробазальной среды + 10 мкл 1 N NaOH), 800 мг BSA, 800 мг трансферрина, 128 мг дигидрохлорида путресцина и 80 мл нейробазала. Фильтр стерилизуют (0,22 мкм), готовят аликвоты 500 мкл и хранят при температуре -20 °C. Очень важно делать свежие растворы прогестерона и селенита натрия.
- Приготовьте 50 мкл сырья N-ацетил-L-цистеина (NAC), растворив в нейробазальной среде до исходной концентрации 5 мг/мл (50 мг в 10 мл), стерилизуют фильтром (0,22 мкм), аликвотой и хранят при -20 °C.
- На 4 и 5 день приготовьте следующие реактивы.
- Приготовьте 0,2 М фосфатный буфер (PB), растворив 21,8 г двухосновного фосфата натрия (Na2HPO 4) и 8,34 г одноосновного дигидрата фосфата натрия (2PO4) в 1,000 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,4 и храните при комнатной температуре.
- Приготовьте 8% параформальдегид (ПФА) следующим образом: в вытяжном шкафу нагрейте 50 мл воды до 55 °C, выключите огонь и добавьте 8 г гранул PFA, постоянно помешивая. Добавляйте 1 N NaOH по каплям, пока раствор не начнет очищаться, затем добавьте 40 мл 0,2 М PB и продолжайте помешивать до тех пор, пока он не станет прозрачным. Охладите раствор до комнатной температуры, отрегулируйте рН до 7,4 и доведите объем до 100 мл с 0,2 М ПБ. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовьте D-PBS + Triton X-100 (PBSTX), добавив 0,2% Triton X-100 в культуральный сорт D-PBS (1 мл Triton + 500 мл D-PBS). Хранить при температуре 4 °C. Приготовьте блокирующий раствор, который представляет собой 1% нормальную ослиную сыворотку (NDS) в PBSTX. Заранее 1 мл NDS + 9 мл PBSTX можно приготовить и хранить при -20 ° C в 10 мл аликвот.
- Приготовьте раствор антител, который составляет 0,2% NDS / 0,2% BSA в PBS TX: 200 мкл NDS + 200 мг BSA + 9,6 мл PBSTX; может быть приготовлен заранее и храниться при -20 ° C в аликвотах по 10 мл.
2. Настройка оборудования
- Установить следующее оборудование: шкаф биобезопасности стерильных клеточных культур, набор микропипеток, серологические пипетки и пипетки, чашки Петри 10 см, чашки для клеточных культур для покрытия (здесь для визуализации использовались 24-луночные пластины с черным стеклянным дном), конические трубки объемом 15 мл и 50 мл, инструменты для вскрытия (а именно: тонкие пружинные ножницы для ламинэктомии и обрезки нервов, тонкие щипцы, и лезвие бритвы), водяная баня с температурой 37 °C, ситечко для ячеек 70 мкм, центрифуга (10 мин при 300 x g) с адаптерами для конических пробирок объемом 15 мл, трипановый синий и гемоцитометр, вытяжной шкаф и конфорка с магнитным перемешиванием.
3. Экспериментальный метод
- День 1: приготовление блюд
- В шкафу биобезопасности покройте желаемую поверхность культуры достаточным количеством поли-D-лизина, чтобы покрыть дно скважины. Хранить в течение ночи при температуре 4 °C. Здесь для визуализации использовались 24-луночные пластины со стеклянным дном, и, таким образом, использовалось 300 мкл поли-D-лизина.
- В шкафу биобезопасности подготовьте посуду для промывки: для чашки CD45 добавьте 10 мл рабочего раствора трис-HCl и 30 мкл козьего антикрысиного IgG в 10-сантиметровую чашку Петри; для чашки PDGFRβ добавьте 10 мл рабочего раствора трис-HCl и 30 мкл козьего антикроличьего IgG в 10-сантиметровую чашку Петри; для чашки гибридомы O4 добавьте 10 мл рабочего раствора трис-HCl и 30 мкл козьего антимышиного IgG в 10-сантиметровую чашку Петри. Убедитесь, что раствор покрывает всю площадь посуды, и оставьте на ночь при температуре 4 °C.
- День 2: вскрытие, растирание и иммунопанирование
- Аспирируйте поли-D-лизин, трижды промойте пластины водой для культивирования тканей, откройте крышку и дайте поверхности полностью высохнуть в шкафу биобезопасности. Нанесите достаточное количество ламинина на пластины, чтобы покрыть дно каждой лунки, и поместите в инкубатор при температуре 37 ° C. Для 24-луночных планшетов достаточно 200 мкл.
- Завершите приготовление посуды для сковороды. Вымойте каждую посуду D-PBS и инкубируйте с 10 мкг первичного антитела. Оставьте при комнатной температуре не менее 2 часов.
- Для чашки CD45 добавьте 5 мл 0,2% BSA и 20 мкл первичного CD45; для чашки PDGFRβ добавьте 5 мл 0,2% BSA и 15,4 мкл PDGFRβ; для чашки O4 добавьте 3 мл 0,2% BSA, 2 мл гибридомы O4 и дополнительные 100 мкл 4% BSA (чтобы конечная концентрация BSA оставалась на уровне 0,2%).
- Усыпьте от одной до четырех мышей, используя 0,1 мл / кг пентобарбитола натрия (на 10-сантиметровую иммунопанорамную чашку). Мы использовали мышей C57BL / 6 в возрасте 8-10 недель. Оба пола использовались и культивировались отдельно друг от друга. Перфузируют животное 30 мл холодного 0,9% физиологического раствора.
- Прижмите переднюю и заднюю лапы к стадии пенополистирола и используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обнажить позвоночник сзади. Выполните ламинэктомию, сделав разрезы примерно на полпути по обе стороны от дорсального позвоночника, удалив дорсальную половину столба, чтобы обнажить спинной мозг. Либо аккуратно перережьте нервы и удалите спинной мозг, либо аккуратно отодвиньте спинной мозг в сторону, сохраняя целостность нерва.
- Используйте корешки спинномозговых нервов (либо разорванные, либо прикрепленные к спинному мозгу), чтобы найти и удалить все DRG с обеих сторон позвоночника. Обрежьте нервный мусор с каждого DRG по мере его удаления (большее количество нервного мусора в культуре может привести к плохой выживаемости культуры). Соберите DRG в 15 мл HBSS-/- в коническую пробирку объемом 15 мл на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что ткань препарируется на открытом воздухе, но после добавления DRG в пробирку их следует рассматривать как стерильные и манипулировать ими только в шкафу биобезопасности. - Поместите замороженные запасы stemxyme 1 и 0,4% ДНКазы на водяную баню примерно за 30 минут до окончания вскрытия (примерно при запуске последней мыши). Дайте им осесть на дно конической трубки, затем продолжите протокол в шкафу биобезопасности.
- Аспирируйте большую часть HBSS-/- из DRG. Используйте пипетку, а не всасывание, чтобы получить <1 мл жидкости, и оставьте ~ 100 мкл жидкости, чтобы не рисковать потерей ткани.
- Промыть три раза 1 мл HBSS-/-. Добавьте в ткань 5 мл рабочего раствора stemxyme. Накройте крышку прозрачной пленкой и положите трубку на бок на водяной бане, установленной на 37 °C, в течение 1 часа.
- После инкубации в ферменте добавьте в пробирку 1 мл раствора ингибитора с низким содержанием ово. Аккуратно тритуируйте клетки пипеткой p1000 10-15 раз. Дайте кусочкам ткани осесть.
- Переведите верхние 2-3 мл раствора (содержащего диссоциированные клетки) в свежий низкоовомукоидный раствор. Повторяйте до тех пор, пока ткань полностью не диссоциирует и не останется видимых кусков.
- Центрифуга в течение 10 мин при 300 x g при комнатной температуре. Снова откачайте надосадочную жидкость, используя пипетку, а не всасывание в течение последнего 1 мл, оставляя ~ 100 мкл, и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера для промывки.
- Аккуратно перемешайте пипеткой. Предварительно смочите сетчатое фильтр для клеток размером 70 мкм с 1 мл буфера для панорамирования над конической трубкой объемом 50 мл. Отфильтруйте клеточный раствор через клеточный фильтр.
- Промойте пробирку 1 мл буфера для промывки, затем пропустите через сетчатый фильтр (3 мл фильтрата). Аккуратно нанесите клеточную суспензию (по 1 мл за раз) поверх 2 мл 15% подушки BSA, чтобы удалить остатки миелина. Подушка объемом 2 мл эффективна для двух мышей, а 3 мл эффективна для четырех мышей.
- Для наслоения поместите 2 мл BSA в пробирку, закройте и аккуратно покройте стенки пробирки BSA. Затем аккуратно наложите суспензию на ячейку сверху, пипеткой прижавшись к стенке трубки.
- Центрифуга при комнатной температуре при 300 x g в течение 10 мин (медленное ускорение и замедление). Используйте пипетку P1000, чтобы удалить прозрачную жидкость сверху, миелиновую фазу между ними и BSA, по 1 мл за раз (меняя кончики между каждым мл). Оставьте ~100 мкл BSA, чтобы не потревожить гранулы.
- Добавьте 5 мл буфера для промывки и инкубируйте пробирку в инкубаторе 37 °C, 10% CO2 в течение 30-45 минут. Это позволяет извлекать антигены. Обязательно ослабьте крышку, чтобы обеспечить газообмен.
- Трижды вымойте посуду CD45 с помощью D-PBS. Слейте последнее полоскание. Сцедите клеточную суспензию в чашку CD45.
- Инкубируйте клетки на чашке CD45 в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно поворачивая в течение 10 минут, чтобы обеспечить клеткам равный доступ к антителам.
- Трижды промойте посуду PDGFRβ с помощью D-PBS и слейте последнее полоскание. Перенесите несвязанные клетки из чашки CD45 в чашку PDGFRβ.
- Осторожно встряхните тарелку CD45 и подперите ее под углом. Аккуратно нанесите 1 мл клеточной суспензии на чашку, чтобы собрать несвязанные клетки. Сцедите его в чашку PDGFRβ и пипетку, чтобы перенести оставшуюся клеточную суспензию на пластину PDGFRβ.
- Инкубируйте планшет PDGFRβ в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно поворачивая в точке 10 минут, чтобы обеспечить клеткам равный доступ к антителу.
- Трижды промойте посуду O4 с помощью D-PBS и слейте последнее полоскание. Перенесите несвязанные ячейки из чашки PDGFRβ в чашку O4, используя тот же метод, что и на шаге 3.2.19. Инкубируйте пластину O4 в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно взбалтывая в течение 10 минут, чтобы обеспечить клеткам равный доступ к антителу.
- Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугу в течение 10 мин при 300 x g. Ресуспендируйте клетки в желаемом объеме и разбавьте 1:1 трипановым синим для жизнеспособности клеток. Подсчитайте средние и крупные клетки с помощью гемоцитометра (это позволит наилучшим образом представить количество нейронов в культуре).
- Удалите ламинин и наклейте клетки на нужную плотность. Не допускайте высыхания пластины между удалением ламинина и нанесением покрытия и немедленно добавляйте ячейки.
- Культивируют количественные клетки для обогащения нейронов (рис. 3) с 500 нейронами в 25 мкл питательной среды (описано в 1.2.7) на лунку в 24-луночных планшетах и инкубируют при 37 ° C в течение 30 мин. Затопите скважины до конечного объема 500 мкл.
- День 4: иммуноцитохимия (ИКК) фиксация, блокирование и первичная
- После 48 ч роста добавьте 500 мкл / лунку (или объем, эквивалентный среде в лунке) 8% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки. Если требуется анализ СМИ, можно напрямую использовать 4% PFA. Однако мы этого не проверяли.
- Промойте клетки D-PBS три раза. Обратите внимание, что мы хранили эти клетки в культуре без смены среды в течение максимум 72 часов, но предполагаем, что они могут выживать дольше, особенно если среда наполовину изменена.
- Удалите окончательную промывку и добавьте достаточное количество блокирующего раствора на лунку, чтобы полностью покрыть ячейки. Блокировать на 30 мин при комнатной температуре. Удалите блокирующий раствор и добавьте первичное антитело в раствор антитела: β3-тубулин в разведении 1:1,000. Запечатайте пластину прозрачной пленкой и выдержите в течение ночи при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно рассмотреть возможность окрашивания PDGFRβ при отсутствии фибробластов, CD45 при отсутствии иммунных клеток, P0 или PMP22 при отсутствии миелина или fabp7 при сателлитной глии.
- День 5: Вторичная школа ICC
- Промойте клетки D-PBS три раза. Удалите окончательную промывку и добавьте вторичные антитела в раствор антител: анти-кролик 488 в разведении 1:500 и DAPI в разведении 1:2,000. Выдерживать 30 мин при комнатной температуре, в защищенном от света месте.
- Стирайте с помощью D-PBS три раза. Добавьте достаточное количество D-PBS, чтобы покрыть дно колодца, и изображение. Пластину можно запечатать прозрачной пленкой, защитить от света и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фиксированные клетки, окрашенные DAPI и β3-тубулином, затем визуализировали с помощью конфокальной скрининговой системы с высоким содержанием. Изображения были проанализированы с использованием подходящего коммерческого программного обеспечения для определения процента DAPI-положительных клеток, которые мечены β3-тубулином (рис. 3). Было определено, что целые культуры DRG имеют окрашивание β3-тубулина на 42,36% ± 6,4%, а на иммунопанированные культуры DRG окрашивание β3-тубулина составляет 71,44% ±7,43%. Это свидетельствует о значительном увеличении обогащения нейронов с помощью иммунопаннирования (p < 0,0001, непарный t-критерий).
Рисунок 1: Основы иммунопаннирования. Вторичное антитело прилипает к чашке для культивирования в течение ночи, а затем вводятся первичные антитела. Это позволяет интересующим клеткам прикрепляться к пластине поверхностным антигеном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иммунопанирование нейронов DRG взрослой мыши методом отрицательного отбора. DRG собирают, диссоциируют и процеживают в одноклеточный раствор. Миелиновый мусор удаляется центрифугированием через подушку BSA. Затем клеточную суспензию пропускают через три иммунопанорамные чашки (CD45, PDGFRβ и O4) для получения культуры, обогащенной для нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Обогащение нейронов культуры DRG путем иммунопаннирования. Фиксированные культуры окрашивали β3-тубулином для нейронов и DAPI для всех ядер. (А) Репрезентативный образ целой (неиммунопанной) культуры. (B) Репрезентативное изображение иммунопанированной культуры. (C) Количественная оценка β3-тубулин-положительных клеток в процентах от общего количества DAPI-положительных клеток. Столбцы обозначают среднее значение ± стандартную ошибку (SEM). = p < 0,0001, непарный t-критерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол иммунопанирования увеличивает долю нейрональных клеток в первичных культурах DRG. Для достижения наилучшего результата следует своевременно проводить вскрытия, а ДРГ очищать от лишних нервов. Стадия диссоциации должна тщательно контролироваться и не должна превышать 1 ч, чтобы предотвратить ненужное напряжение клеток. Что касается иммунопанирования, то каждую пластину следует осторожно закручивать на полпути, чтобы клетки имели доступ к антителам, покрытым оболочкой. Пластины также следует рассматривать под культуральным микроскопом после сбора суспензии нейрональных клеток, чтобы убедиться, что ненейрональные клетки связаны.
Ограничением в использовании взрослых мышей является установленный характер ДРГ. Неспособность удалить все типы ненейрональных клеток оставляет примерно 30% культуры как ненейрональную (рис. 3). В то время как мы можем диссоциировать и уменьшать популяцию иммунных клеток, фибробластов и шванновских клеток из культур, сателлитную глию может быть чрезвычайно трудно диссоциировать от нейронов. Мы также предполагаем, что эти нейроны могут иметь плохую выживаемость без метаболической поддержки, обеспечиваемой сателлитной глией10. В то время как наша попытка окрашивания этих клеток с использованием GFAP потерпела неудачу из-за плохой специфичности антител, будущее направление может заключаться в окрашивании этих клеток с использованием fabp7. Мы попытались удалить CD9-положительные ненейрональные клетки, такие как сателлитная глия, при устранении неполадок с этим протоколом. Однако в пластине CD9 было обнаружено, что к пластине прикреплено много нейронов. Мы предполагаем, что нейроны мыши могут иметь некоторую экспрессию CD9. Фактически, внеклеточные везикулы из нейроноподобных клеток мыши используют CD9 в качестве маркера11. Если бы можно было найти более подходящее панирующее антитело для снижения доли сателлитной глии, можно было бы рассмотреть возможность дополнительного добавления факторов роста, таких как NGF, BDNF или NT3, чтобы противодействовать потере этих поддерживающих клеток.
Этот протокол иммунопанирования может повысить точность считывания нейронов из гомогенных образцов культуры DRG за счет увеличения доли нейрональных клеток в культуре. Он также предоставляет возможность культивировать нейроны DRG взрослых мышей, что позволяет проводить углубленное исследование фенотипов нейронов в генетических, болезненных и травмированных моделях мышей.
Иммунопаннирование также является инструментом с широкими возможностями настройки. Например, маркер клеточной поверхности изолектин-В4 может быть использован специально для отбора непептидергических ноцицепторов мыши. Иммунопанирование также может быть использовано для обогащения других первичных культур, включая корковые нейроны, микроглию, астроциты и клетки-предшественники олигодендроцитов. Это мощный инструмент, который может расширить применение первичных клеточных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана проектным грантом Канадского института исследований в области здравоохранения (FRN-162434) и грантом на открытие от Канадского общества рассеянного склероза (EGID-3761). Авторы выражают благодарность доктору Сану и Институту рака Кросса за обучение и использование системы ImageXpress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
