Summary
本文描述了一种成年小鼠背根神经节的免疫平移方案。通过将抗体粘附到培养板上，我们可以负性地选择和去除非神经元细胞。我们表明，使用该协议为神经元富集培养物，从而可以深入研究神经元对操作的反应。
Abstract
背根神经节（DRGs）是与脊髓背角相邻的外围结构，容纳感觉神经元的细胞体以及各种其他细胞类型。已发表的培养方案通常将整个解离的DRG培养物称为神经元，尽管存在成纤维细胞，雪旺细胞，巨噬细胞和淋巴细胞。虽然这些完整的DRG培养物足以用于成像应用，其中可以根据形态或染色来识别神经元，但从这些培养物中收集的蛋白质或RNA匀浆主要不是神经元起源的。在这里，我们描述了培养小鼠DRG的免疫平移序列。该方法的目标是通过去除其他细胞类型来丰富神经元的DRG培养物。免疫淘选是指通过将抗体粘附到细胞培养皿中来去除细胞类型的方法。使用这些培养皿，我们可以消极地选择和减少培养物中成纤维细胞、免疫细胞和雪旺细胞的数量。这种方法使我们能够增加培养物中神经元的百分比。
Introduction
背根神经节（DRGs）容纳支配外周组织的感觉神经元的细胞体。研究这些神经元使我们能够理解疼痛和感觉状况的机制基础。然而，DRGs不仅由神经元组成，还包含成纤维细胞，雪旺细胞，巨噬细胞和其他免疫细胞1。尽管存在这些不同的细胞类型，但整个DRG培养物在文献中通常被称为神经元2，3。这些培养物仍然可用于通过成像或流式细胞术进行神经元研究，这将允许通过染色、细胞大小和/或形态进行神经元鉴定。然而，对于聚合酶链反应（PCR）或蛋白质印迹等检测，其中培养物均质化以进行RNA或蛋白质收集，非神经元细胞类型的存在可能会干扰结果。因此，需要增加DRG培养物中神经元细胞的比例。
免疫淘选是一种用于纯化各种细胞类型的技术，包括皮质神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和小胶质细胞。简而言之，它涉及将针对细胞表面标志物的抗体粘附到培养皿上，旨在结合某些细胞（图1），并且可用于选择支持或反对感兴趣的细胞类型4，5，6。免疫淘选大鼠胚胎DRG以选择针对非神经元细胞，之前已由Zuchero7描述过。然而，我们一直无法找到特定于小鼠DRG的免疫淘选方案。在该协议中，我们以Zuchero协议的基本租户为基础，但改为调整免疫淘选序列以丰富成年小鼠DRG培养物（图2）。这是研究培养中已建立的感觉神经元的有力工具。它是有利的，因为它允许使用来自遗传，疾病和损伤模型的成年小鼠，以便可以更特异性地研究它们的感觉神经元。
该协议对于希望增加成年小鼠DRG培养物中神经元比例的读者是有利的。然而，免疫淘选步骤也可以省略，该方案也可用于整个DRG培养。
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Protocol
所有动物实验均经阿尔伯塔大学健康科学动物护理和使用委员会（协议0000274）批准进行。
1. 试剂制备
- 对于第1天，准备以下试剂：细胞培养级水;聚-D-赖氨酸-通过将整个瓶子重新配制在50 mL培养级水中至100 μg/mL储备液浓度来制备储备液，储存在4 °C，并将储备液在培养级水中以1：10稀释至终浓度为10 μg/ mL;tris-HCl-通过将盐酸三盐酸粉末溶解在培养级水中至500mM（50mL中的3.94g），pH 9.5，过滤灭菌（0.22μm），储存在4°C，并将原液在培养级水中1：10稀释至终浓度为50mM来制备原液;二抗（山羊抗大鼠、-兔和-小鼠）。
- 第2天，准备以下试剂。
- 制备细胞培养级Ca 2+，不含Mg2+的汉克平衡盐溶液（HBSS;HBSS-/-）和含有Ca2+和Mg2+的细胞培养级D-磷酸缓冲盐水（PBS）。准备层粘连蛋白原液等分试样，并在收到后立即储存在-80°C;将无菌HBSS-/-中的储备液稀释至工作储备液的终浓度为10μg/ mL。
- 通过将 400 mg BSA 溶解在 7.5 mL D-PBS （pH 7.4） 中来制备 4% 牛血清白蛋白 （BSA） 储备液，使体积达到 10 mL，过滤灭菌 （0.22 μm），等分试样并储存在 -20 °C。 通过在 14.25 mL D-PBS 中稀释 750 μL 4% BSA 来制备 0.2% BSA。
- 每 12，500 单位 DNA 酶加入 1 mL 厄尔平衡盐溶液 （EBSS），过滤灭菌 （0.22 μm），等分试样并储存在 -20 °C，制备 0.4% DNA 酶储备液。 通过在 27 mL D-PBS 中加入 3 mL 0.2% BSA 和 100 μL 0.4% DNA 酶来制备淘洗缓冲液 （0.02% BSA）。制备一抗（CD45，PDGRFβ，O4）。
注意：该协议使用O4杂交瘤8，9，但是，10μg市售O4抗体也是合适的。 - 通过将一瓶组合胶原酶（50mg）溶解在5mL的HBSS-/-中，等分试样制备组合胶原酶原液，并储存在-20°C。 通过将 500 μL 温热的复合胶原酶和 50 μL 温热的 0.4% DNase 添加到 4.5 mL HBSS-/-中，制备每两只小鼠的工作储备液。
- 通过将 3 g BSA 添加到 150 mL D-PBS 中来制备低卵粘蛋白，然后加入 3 g 胰蛋白酶抑制剂并混合溶解。将 pH 值调节至 7.4，并使用 D-PBS 将体积增加到 200 mL。过滤灭菌，制备1mL等分试样，并储存在-20°C。 在解剖当天，将 1 mL 低卵粘蛋白与 9 mL D-PBS 合并用于工作溶液。
- 通过将7.5gBSA溶解在50mL的HBSS-/-中（放在摇床上以完全溶解）来制备15%BSA，过滤灭菌并储存在4°C。
- 通过加入 23.2 mL DMEM、23.2 mL 神经基础培养基、500 μL 谷氨酰胺、500 μL 丙酮酸钠、500 μL 青霉素/链霉素（到达后立即等分并储存在 -20 °C）、500 μL 胰岛素（5 μg/mL 最终）、500 μL SATO、50 μL N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC;5 μg/mL 最终）， 和 1，000 μL B27+（立即等分并在接收后储存在 -20 °C）。
- 通过将溶解在培养级水中至0.5mg / mL（50mg在100mL中）来制备胰岛素储备液，将pH调节至7.4，过滤灭菌（0.22μm），制备500μL等分试样，并储存在-20°C。
- 通过混合 20 μL 黄体酮（2.5 mg 在 100 μL 乙醇中）、800 μL 亚硒酸钠（4 mg 在 10 mL 神经基础培养基中 + 10 μL 1 N NaOH）、800 mg BSA、800 mg 转铁蛋白、128 mg 二盐酸腐胺和 80 mL 神经基础来制备 SATO 原液。过滤灭菌（0.22μm），制备500μL等分试样，并储存在-20°C。 制作新鲜的黄体酮和亚硒酸钠溶液至关重要。
- 通过在神经基础培养基中溶解至 5 mg/mL（50 mg 在 10 mL 中的储备浓度）来制备 50 μL N-乙酰-L-半胱氨酸 （NAC） 储备液，过滤灭菌 （0.22 μm），等分试样并储存在 -20 °C。
- 在第 4 天和第 5 天，准备以下试剂。
- 通过将 21.8 g 磷酸二钠 （Na 2 HPO 4） 和 8.34 g 磷酸二水合钠 （NaH 2 PO4） 溶解在 1，000 mL 水中来制备0.2M 磷酸盐缓冲液 （PB）。将pH调节至7.4并在室温下储存。
- 制备8%多聚甲醛（PFA）如下：在通风橱中，将50mL水加热至55°C，关火，加入8gPFA颗粒，不断搅拌。滴加 1 N NaOH 直到溶液开始澄清，然后加入 40 mL 的 0.2 M PB，继续搅拌直至澄清。将溶液冷却至室温，将pH调节至7.4，并用0.2 M PB使体积达到100 mL。过滤并在4°C下储存长达2周。
- 通过在培养级 D-PBS（1 mL Triton + 500 mL D-PBS）中添加 0.2% Triton X-100 来制备 D-PBS + Triton X-100 （PBSTX）。储存在4°C。 准备封闭溶液，这是PBSTX中的1%正常驴血清（NDS）。提前，可以制备 1 mL NDS + 9 mL PBSTX ，并以 10 mL 等分试样在 -20 °C 下储存。
- 在PBS TX中制备0.2%NDS / 0.2%BSA的抗体溶液：200μL NDS + 200 mg BSA + 9.6 mL PBSTX;可以提前制备，并在-20°C下以10mL等分试样储存。
2. 设备设置
- 设置以下设备：无菌细胞培养生物安全柜，微量移液器套件，血清移液器和移液器枪，10厘米培养皿，用于电镀的所需细胞培养皿（此处使用24孔黑色玻璃底板进行成像），15 mL和50 mL锥形管，解剖工具（即：用于椎板切除术和神经修剪的细弹簧剪刀，细镊子， 和剃须刀片），水浴设置为37°C，70μm细胞过滤器，离心机（300× g下10分钟），适配器用于15mL锥形管，台盼蓝和血细胞计数器，通风橱和磁力搅拌热板。
3.实验方法
- 第1天：准备菜肴
- 在生物安全柜中，用足够的聚-D-赖氨酸覆盖所需的培养表面以覆盖孔的底部。在4°C下储存过夜。 在这里，使用24孔玻璃底板进行成像，因此使用了300 μL聚-D-赖氨酸。
- 在生物安全柜中，准备淘洗培养皿：对于 CD45 培养皿，将 10 mL 工作 tris-HCl 溶液和 30 μL 山羊抗大鼠 IgG 加入 10 cm 培养皿中;对于 PDGFRβ 培养皿，将 10 mL 工作 tris-HCl 溶液和 30 μL 山羊抗兔 IgG 加入 10 cm 培养皿中;对于 O4 杂交瘤培养皿，将 10 mL 工作 tris-HCl 溶液和 30 μL 山羊抗小鼠 IgG 加入 10 cm 培养皿中。确保溶液覆盖整个培养皿区域，并在4°C下放置过夜。
- 第 2 天：解剖、研磨和免疫淘选
- 吸出聚-D-赖氨酸，用组织培养水清洗板三次，倾斜盖子，让表面在生物安全柜中完全干燥。将足够的层粘连蛋白涂在板上以涂覆每个孔的底部，并置于37°C的培养箱中。 对于 24 孔板，200 μL 就足够了。
- 完成平移菜肴的准备。用D-PBS清洗每个培养皿，并与10μg一抗孵育。在室温下静置至少2小时。
- 对于 CD45 培养皿，加入 5 mL 的 0.2% BSA 和 20 μL 的 CD45 初级;对于 PDGFRβ 培养皿，加入 5 mL 的 0.2% BSA 和 15.4 μL 的 PDGFRβ;对于 O4 培养皿，加入 3 mL 的 0.2% BSA、2 mL 的 O4 杂交瘤和另外 100 μL 的 4% BSA（以确保最终的 BSA 浓度保持在 0.2%）。
- 使用0.1mL / kg戊巴比妥钠（每10cm免疫淘选培养皿）对一至四只小鼠实施安乐死。我们在8-10周龄时使用C57BL / 6小鼠。两性分别使用和培养。用 30 mL 冷的 0.9% 盐水灌注动物。
- 将前爪和后爪固定在泡沫塑料平台，并使用干净的剃须刀片从背部露出脊柱。进行椎板切除术，在脊柱背侧切开约一半的深度，切除脊柱的背半部分，以露出脊髓。要么轻轻切断神经并移除脊髓，要么轻轻地将脊髓推到一边，保持神经完整性。
- 使用脊神经根（切断或附着在脊髓上）从脊柱的两侧找到并去除所有DRG。去除每个DRG的神经碎片时对其进行修剪（培养物中更多的神经碎片可能导致培养存活率低）。将 DRG 收集在冰上的 15 mL 锥形管中的 15 mL HBSS-/- 中。
注意：请注意，组织在露天解剖，但是一旦将DRG添加到试管中，它们应被视为无菌的，并且只能在生物安全柜中操作。 - 将茎xyme 1和0.4%DNAse的冷冻储备置于水浴中，在解剖结束前约30分钟（大约在启动最后一只小鼠时）。让它们沉降到锥形管的底部，然后在生物安全柜中继续方案。
- 从DRG中吸出大部分HBSS-/-。 使用移液器而不是抽吸得到<1 mL的液体，并留下~100 μL液体，以免有失去组织的风险。
- 用 1 mL HBSS-/-洗涤 3 次。向组织中加入 5 mL 的工作干酶溶液。用透明薄膜盖住盖子，并将管子侧浮在设置为37°C的水浴中1小时。
- 在酶中孵育后，向管中加入 1 mL 低卵抑制剂溶液。用p1000移液器轻轻研磨细胞10-15次。让组织块沉降。
- 将顶部 2-3 mL 溶液（含有解离的细胞）转移到新鲜的低卵粘液溶液中。重复直到组织完全解离并且没有可见的块状物残留。
- 在室温下以300× g 离心10分钟。再次虹吸上清液，使用移液管而不是抽吸最后 1 mL，留下 ~100 μL，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 淘洗缓冲液中。
- 轻轻移液混合。在 50 mL 锥形管上用 1 mL 淘洗缓冲液预润湿 70 μm 细胞过滤器。通过细胞过滤器过滤细胞溶液。
- 用 1 mL 淘洗缓冲液清洗试管，然后通过过滤器（3 mL 滤液）。将细胞悬液轻轻（一次 1 mL）铺在 2 mL 的 15% BSA 垫上，以去除髓磷脂碎片。 2 mL垫对两只小鼠有效，3 mL对四只小鼠有效。
- 为了分层， 将 2 mL BSA 放入试管中，关闭并用 BSA 轻轻涂覆试管的侧面。然后，通过将移液器移液到试管的侧面，轻轻地将顶部的细胞悬液分层。
- 在室温下以300× g 离心10分钟（缓慢加速和减速）。使用 P1000 移液器去除顶部的透明液体、中间的髓鞘期和 BSA，一次 1 mL（在每个 mL 之间更换吸头）。留下~100μL的BSA，以免干扰沉淀。
- 加入5mL淘洗缓冲液，并将管在37°C，10%CO2 培养箱中孵育30-45分钟。这允许抗原修复。确保松开盖子以允许气体交换。
- 用D-PBS清洗CD45培养皿三次。倒掉最后的冲洗液。将细胞悬液倒入CD45培养皿中。
- 在室温下将CD45培养皿上的细胞孵育总共20分钟，在10分钟点轻轻旋转以使细胞平等地接触抗体。
- 用D-PBS冲洗PDGFRβ培养皿三次，然后倒出最后的冲洗液。将未结合的细胞从CD45培养皿转移到PDGFRβ培养皿中。
- 轻轻摇晃 CD45 培养皿并以一定角度支撑它。在培养皿上轻轻移取 1 mL 细胞悬液以收集未结合的细胞。将其倒入PDGFRβ培养皿中并移液器以将剩余的细胞悬液转移到PDGFRβ板中。
- 在室温下孵育PDGFRβ板共20分钟，在10分钟点轻轻旋转以使细胞平等地接触抗体。
- 用 D-PBS 冲洗 O4 培养皿三次，然后倒掉最后的冲洗液。使用与步骤3.2.19相同的方法将未结合的细胞从PDGFRβ培养皿转移到O4培养皿中。在室温下孵育O4板总共20分钟，在10分钟点轻轻旋转以使细胞平等地接触抗体。
- 将细胞悬液转移到15mL锥形管中，并以300 x g 离心10分钟。将细胞重悬至所需体积，并用台盼蓝1：1稀释以获得细胞活力。用血细胞计数器计数中等到大的细胞（这将允许最好地表示培养物中的神经元数量）。
- 去除层粘连蛋白并以所需的密度铺板细胞。在层粘连蛋白去除和电镀之间不要让板干燥，并立即添加细胞。
- 在24孔板中每孔25μL培养基（如1.2.7中所述）中用500个神经元培养定量细胞以进行神经元富集（图3），并在37°C下孵育30分钟。将孔淹没至最终体积为 500 μL。
- 第 4 天：免疫细胞化学 （ICC） 固定、阻断和原发
- 生长48小时后，在室温下加入500μL/孔（或相当于孔中培养基的体积）的8%PFA15分钟以固定细胞。如果需要培养基分析，可以直接用4%PFA固定。但是，我们尚未对此进行测试。
- 用D-PBS洗涤细胞三次。请注意，我们将这些细胞保持在培养物中，没有更换培养基最多72小时，但假设它们可以存活更长时间，特别是如果培养基被换掉一半。
- 取出最后一次洗涤，并在每孔中加入足够的封闭溶液以完全覆盖细胞。在室温下块30分钟。除去封闭溶液，并在抗体溶液中加入一抗：β3-微管蛋白，稀释度为1：1，000。用透明薄膜密封板，并在4°C孵育过夜。
注意：可以考虑用PDGFRβ染色以表示没有成纤维细胞，CD45用于没有免疫细胞，P0或PMP22用于没有髓磷脂，或fabp7用于卫星胶质细胞。
- 第 5 天：ICC 中学
- 用D-PBS洗涤细胞三次。取出最终洗涤液，并在抗体溶液中加入二抗：抗兔488稀释度为1：500，DAPI稀释度为1：2，000。在室温下孵育30分钟，避光。
- 用 D-PBS 清洗三次。添加足够的D-PBS以覆盖孔的底部，并成像。该板可以用透明薄膜密封，避光，并在4°C下储存长达2周。
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Representative Results
然后用共聚焦高内涵筛选系统对用DAPI和β3-微管蛋白染色的固定细胞进行成像。使用合适的商业软件分析图像，以确定与β3-微管蛋白共标记的DAPI阳性细胞的百分比（图3）。确定整个DRG培养物具有42.36%±6.4%β3-微管蛋白染色，免疫泛洗DRG培养物具有71.44%±7.43%β3-微管蛋白染色。这表明免疫淘移的神经元富集显着增加（p < 0.0001，未配对t检验）。
图 1：免疫淘选基础知识。 将二抗粘附在培养皿上过夜，然后引入一抗。这允许感兴趣的细胞通过表面抗原附着在板上。 请点击此处查看此图的大图。
图2：通过阴性选择进行成年小鼠DRG神经元免疫淘选。 DRG被收获，解离并过滤成单细胞溶液。通过BSA垫离心去除髓磷脂碎片。然后将细胞悬液穿过三个免疫培养皿（CD45，PDGFRβ和O4），以实现富集神经元的培养物。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：通过免疫淘选进行 DRG 培养神经元富集。 固定培养物用β3-微管蛋白染色神经元，DAPI染色所有细胞核。（A）整个（非免疫泛化）培养物的代表性图像。（B）免疫泛化培养物的代表性图像。（C）β3-微管蛋白阳性细胞占总DAPI阳性细胞的百分比。条形表示平均值±标准误差平均值 （SEM）。= p < 0.0001，未配对 t 检验。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这种免疫平移方案增加了DRG原代培养物中神经元细胞的比例。为了获得最佳效果，应及时进行解剖，并应修剪多余的神经。解离步骤应仔细监测，不应超过1小时，以防止细胞受到不必要的压力。特别是关于免疫淘选，每个板应在中点轻轻旋转，以使细胞能够接触到包被的抗体。收集神经元细胞悬液后，还应在培养显微镜下观察平板，以确保非神经元细胞已结合。
使用成年小鼠的限制是DRG的既定性质。由于无法去除所有非神经元细胞类型，大约30%的培养物为非神经元细胞（图3）。虽然我们可以从培养物中解离并减少免疫细胞、成纤维细胞和雪旺细胞的数量，但卫星神经胶质细胞可能非常难以从神经元中解离。我们还假设，如果没有卫星胶质细胞10提供的代谢支持，这些神经元的存活率可能很差。虽然由于抗体特异性差，我们使用GFAP对这些细胞进行染色的尝试失败了，但未来的方向可能是使用fabp7对这些细胞进行染色。在对该协议进行故障排除时，我们试图去除CD9阳性非神经元细胞，例如卫星胶质细胞。然而，在CD9平板中，发现许多神经元附着在板上。我们假设小鼠神经元可能有一些CD9表达。事实上，来自小鼠神经元样细胞的细胞外囊泡文献使用CD9作为标记11。如果可以找到更合适的淘选抗体来降低卫星胶质细胞的比例，则可以考虑额外补充生长因子，如NGF，BDNF或NT3，以抵消这些支持细胞的损失。
这种免疫淘选方案可以通过增加培养中神经元细胞的比例来提高同质DRG培养样品中神经元读数的准确性。它还提供了培养成年小鼠DRG神经元的途径，允许深入研究遗传，疾病和损伤小鼠模型中的神经元表型。
免疫淘选也是一种高度可定制的工具。例如，细胞表面标志物异凝集素-B4可用于特异性选择非肽能小鼠伤害感受器。免疫淘选也可用于富集其他原代培养物，包括皮质神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞。它是一种强大的工具，可以拓宽原代细胞培养的应用。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大卫生研究院的项目资助（FRN-162434）和加拿大MS协会的发现资助（EGID-3761）。作者要感谢孙博士和交叉癌症研究所对ImageXpress系统的培训和使用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
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