Summary
Bu yazıda yetişkin fare dorsal kök gangliyonları için bir immünopanning protokolü açıklanmaktadır. Antikorları kültür plakalarına yapıştırarak, nöronal olmayan hücreleri negatif olarak seçebilir ve çıkarabiliriz. Kültürlerin bu protokolü kullanarak nöronlar için zenginleştirildiğini ve manipülasyona karşı nöronal tepkilerin derinlemesine incelenmesine izin verdiğini gösteriyoruz.
Abstract
Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), omuriliğin dorsal boynuzuna bitişik periferik yapılardır ve duyusal nöronların hücre gövdelerini ve diğer çeşitli hücre tiplerini barındırır. Yayınlanmış kültür protokolleri genellikle fibroblastların, Schwann hücrelerinin, makrofajların ve lenfositlerin varlığına rağmen, tüm ayrışmış DRG kültürlerini nöronal olarak adlandırır. Tüm bu DRG kültürleri, nöronların morfolojiye veya boyamaya dayalı olarak ayırt edilebildiği görüntüleme uygulamaları için yeterli olsa da, bu kültürlerden toplanan protein veya RNA homojenatları öncelikle nöronal kökenli değildir. Burada, kültürlü fare DRG'leri için bir immünopanning dizisi tarif ediyoruz. Bu yöntemin amacı, diğer hücre tiplerini çıkararak nöronlar için DRG kültürlerini zenginleştirmektir. İmmünupanjin, hücre kültürü kaplarına antikorlar yapıştırarak hücre tiplerini uzaklaştırma yöntemini ifade eder. Bu yemekleri kullanarak, kültürdeki fibroblastların, bağışıklık hücrelerinin ve Schwann hücrelerinin sayısını olumsuz olarak seçebilir ve azaltabiliriz. Bu yöntem, kültürlerdeki nöronların yüzdesini arttırmamızı sağlar.
Introduction
Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), periferik dokuları innerve eden duyusal nöronların hücre gövdelerini barındırır. Bu nöronları incelemek, ağrı ve duyusal koşulların mekanik temellerini anlamamızı sağlar. Bununla birlikte, DRG'ler tek başına nöronlardan oluşmaz, aynı zamanda fibroblastlar, Schwann hücreleri, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücrelerini de içerir1. Bu çeşitli hücre tiplerinin varlığına rağmen, tüm DRG kültürleri literatürde sıklıkla nöronal 2,3 olarak adlandırılır. Bu kültürler, boyama, hücre boyutu ve / veya morfoloji ile nöronal tanımlamaya izin verecek görüntüleme veya akış sitometrisi ile nöronal araştırma için hala yararlıdır. Bununla birlikte, kültürlerin RNA veya protein toplanması için homojenize edildiği polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya batı lekelenmesi gibi tahliller için, nöronal olmayan hücre tiplerinin varlığı sonuçlara müdahale edebilir. Bu nedenle, DRG kültürlerinde nöronal hücrelerin oranını arttırmaya ihtiyaç vardır.
İmmünupanjin, kortikal nöronlar, astrositler, oligodendrosit öncü hücreleri ve mikroglia dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerini saflaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Basit bir deyişle, belirli hücreleri bağlamayı amaçlayan bir Petri kabına bir hücre yüzey belirtecine karşı bir antikorun yapıştırılmasını içerir (Şekil 1) ve ilgilenilen hücre tipleri için veya bunlara karşı seçim yapmak için kullanılabilir 4,5,6. Nöronal olmayan hücrelere karşı seçilecek immünopanning sıçan embriyonik DRG'leri daha önce Zuchero7 tarafından tanımlanmıştır. Bununla birlikte, fare DRG'lerine özgü bir immünopanning protokolü bulamadık. Bu protokolde, Zuchero protokolünün temel kiracıları üzerine inşa ettik, ancak bunun yerine yetişkin fare DRG kültürlerini zenginleştirmek için immünopanning dizisini uyarladık (Şekil 2). Bu, kültürdeki yerleşik duyusal nöronları incelemek için güçlü bir araçtır. Yetişkin farelerin genetik, hastalık ve yaralanma modellerinden kullanılmasına izin verdiği için avantajlıdır, böylece duyusal nöronları daha fazla özgüllükle incelenebilir.
Bu protokol, yetişkin fare DRG kültürlerinde nöronların oranını artırmak isteyen okuyucular için avantajlıdır. Bununla birlikte, immünopanning adımları da ihmal edilebilir ve bu protokol tüm DRG kültürleri için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Alberta Üniversitesi Sağlık Bilimleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (protokol 0000274) onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Reaktif hazırlama
- 1. gün için, aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: hücre kültürü sınıfı su; poli-D-lizin-tüm şişeyi 50 mL kültür sınıfı suda 100 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak bir stok hazırlayın, 4 ° C'de saklayın ve stok 1:10'u kültür sınıfı suda 10 μg / mL'lik son bir konsantrasyona seyreltin; tris-HCl-toz haline getirilmiş tris hidroklorürü kültür sınıfı suda 500 mM (50 mL'de 3.94 g), pH 9.5 stok konsantrasyonuna eriterek, filtre sterilize ederek (0.22 μm), 4 ° C'de depolayarak ve kültür sınıfı sudaki stoğu 1:10 oranında 50 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar seyrelterek bir stok hazırlayın; ikincil antikorlar (keçi anti-sıçan, -tavşan ve -fare).
- 2. gün için aşağıdaki reaktifleri hazırlayın.
- Hücre kültürü sınıfı Ca2+, Mg2 + içermeyen Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS; HBSS-/-) ve hücre kültürü sınıfı D-fosfat tamponlu salin (PBS) Ca 2+ ve Mg2+ ile. Bir laminin stok aliquot hazırlayın ve aldıktan hemen sonra -80 ° C'de saklayın; stoğu steril HBSS-/- içinde, çalışma stoğu için 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
- 400 mg BSA'yı 7,5 mL D-PBS (pH 7,4) içinde çözerek %4 sığır serum albümin (BSA) stoğu hazırlayın, hacmi 10 mL'ye getirin, filtre sterilize edin (0,22 μm), alikot edin ve -20 °C'de saklayın. 14.25 mL D-PBS'de 750 μL'lik %4'lük BSA'yı seyrelterek %0.2 BSA hazırlayın.
- 12.500 birim DNAse başına 1 mL Earle's dengeli tuz çözeltisi (EBSS) ekleyerek %0,4 DNAse stoğu hazırlayın, filtre sterilize edin (0,22 μm), alikot edin ve -20 °C'de saklayın. 27 mL D-PBS'ye 3 mL %0,2 BSA ve 100 μL %0,4 DNAse ekleyerek yatay kaydırma tamponunu (%0,02 BSA) hazırlayın. Primer antikorları hazırlayın (CD45, PDGRFβ, O4).
NOT: Bu protokol bir O4 hibridoma8,9 kullanır, ancak ticari olarak temin edilebilen 10 μg O4 antikoru da uygun olacaktır. - Bir şişe kombinasyon kollajenaz (50 mg) kombinasyon kollajenazını 5 mL HBSS-/-, aliquot içinde çözerek ve -20 ° C'de saklayarak kombinasyon kollajenaz stoğunu hazırlayın. 4.5 mL HBSS-/- 'ye 500 μL ısıtılmış kombinasyon kollajenaz ve 50 μL ısıtılmış% 0.4 DNaz ekleyerek iki fare başına bir çalışma stoğu hazırlayın.
- 150 mL D-PBS'ye 3 g BSA ekleyerek düşük ovomukoid hazırlayın, ardından 3 g tripsin inhibitörü ekleyin ve çözünmesi için karıştırın. PH'ı 7,4'e ayarlayın ve D-PBS ile hacmi 200 mL'ye çıkarın. Filtre sterilize edin, 1 mL alikot hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Diseksiyon gününde, çalışma çözeltisi için 9 mL D-PBS'de 1 mL düşük ovomukoid birleştirin.
- 7.5 g BSA'yı 50 mL HBSS-/- içinde çözerek %15 BSA hazırlayın (tamamen çözünmesi için bir çalkalayıcıya yerleştirin), filtre sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
- 23.2 mL DMEM, 23.2 mL nörobazal besiyer, 500 μL glutamax, 500 μL sodyum piruvat, 500 μL penisilin/streptomisin (varışta hemen aliquot ve -20 °C'de saklayın), 500 μL insülin (5 μg/mL final), 500 μL SATO, 50 μL N-asetil-L-sistein (NAC; 5 μg/mL final) ekleyerek 50 mL nöron ortamı hazırlayın, ve 1.000 μL B27+ (aldıktan sonra hemen aliquot ve -20 ° C'de saklayın).
- İnsülin stoğunu kültür sınıfı suda 0,5 mg/mL (100 mL'de 50 mg) konsantrasyonda çözerek hazırlayın, pH'ı 7,4'e ayarlayın, filtre sterilize edin (0,22 μm), 500 μL alikot hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
- 20 μL progesteron (100 μL etanol içinde 2.5 mg), 800 μL sodyum selenit (10 mL nörobazal ortamda 4 mg + 1 N NaOH içinde 10 μL), 800 mg BSA, 800 mg transferrin, 128 mg putresin dihidroklorür ve 80 mL nörobazal birleştirerek SATO stoğunu hazırlayın. Filtre sterilize edin (0,22 μm), 500 μL alikot hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Taze progesteron ve sodyum selenit çözeltileri yapmak esastır.
- Nörobazal ortamda 5 mg/mL (10 mL'de 50 mg) stok konsantrasyonuna kadar çözerek 50 μL N-asetil-L-sistein (NAC) stoğu hazırlayın, filtre sterilize edin (0.22 μm), alikot edin ve -20 °C'de saklayın.
- 4. ve 5. günler için aşağıdaki reaktifleri hazırlayın.
- 21.8 g sodyum fosfat dibazik (Na 2 HPO4) ve 8.34 g sodyum fosfat monobazik dihidratı (NaH 2 PO4) 1.000 mL suda çözerek0.2M fosfat tamponu (PB) hazırlayın. PH'ı 7,4'e ayarlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
- % 8 paraformaldehit (PFA) hazırlayın: bir duman davlumbazında, 50 mL suyu 55 ° C'ye ısıtın, ısıyı kapatın ve sürekli karıştırarak 8 g PFA prillleri ekleyin. Çözelti temizlenmeye başlayana kadar damla damla 1 N NaOH ekleyin, ardından 40 mL 0,2 M PB ekleyin ve temizlenene kadar karıştırmaya devam edin. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun, pH'ı 7,4'e ayarlayın ve hacmi 0,2 M PB ile 100 mL'ye çıkarın. Süzün ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- D-PBS + Triton X-100 (PBSTX), kültür sınıfı D-PBS'ye %0,2 Triton X-100 ekleyerek hazırlayın (1 mL Triton + 500 mL D-PBS). 4 °C'de saklayın. PBSTX'de% 1 normal eşek serumu (NDS) olan blokaj solüsyonunu hazırlayın. Önceden 1 mL NDS + 9 mL PBSTX hazırlanabilir ve -20 °C'de 10 mL alikotta saklanabilir.
- PBS TX'de% 0.2 NDS/% 0.2 BSA olan antikor çözeltisi hazırlayın: 200 μL NDS + 200 mg BSA + 9.6 mL PBSTX; önceden hazırlanabilir ve -20 °C'de 10 mL alikotlarda saklanabilir.
2. Ekipman kurulumu
- Aşağıdaki ekipmanları kurun: steril hücre kültürü biyogüvenlik kabini, mikropipet seti, serolojik pipetler ve pipet tabancası, 10 cm Petri tabakları, kaplama için istenen hücre kültürü tabakları (burada, görüntüleme için 24 kuyucuklu siyah cam tabanlı plakalar kullanılmıştır), 15 mL ve 50 mL konik tüpler, diseksiyon aletleri (yani: laminektomi ve sinir kırpma için ince yaylı makaslar, ince forsepsler, ve bir tıraş bıçağı), 37 ° C'ye ayarlanmış su banyosu, 70 μm hücre süzgeci, 15 mL konik tüpler için adaptörlerle santrifüj (300 x g'de 10 dakika), tripan mavisi ve hemositometre, duman davlumbaz ve manyetik karıştırma sıcak plakası.
3. Deneysel yöntem
- 1. Gün: Yemeklerin hazırlanması
- Bir biyogüvenlik kabininde, istenen kültür yüzeyini kuyunun tabanını örtecek kadar poli-D-lizin ile kaplayın. Gece boyunca 4 °C'de saklayın. Burada, görüntüleme için 24 delikli cam tabanlı plakalar kullanılmış ve böylece 300 μL poli-D-lizin kullanılmıştır.
- Bir biyogüvenlik kabininde, tava tabaklarını hazırlayın: CD45 kabı için, 10 cm'lik bir Petri kabına 10 mL çalışma tris-HCl çözeltisi ve 30 μL keçi anti-sıçan IgG ekleyin; PDGFRβ kabı için, 10 cm'lik bir Petri kabına 10 mL çalışma tris-HCl çözeltisi ve 30 μL keçi anti-tavşan IgG ekleyin; O4 hibridoma kabı için, 10 cm'lik bir Petri kabına 10 mL çalışma tris-HCl çözeltisi ve 30 μL keçi anti-fare IgG ekleyin. Çözeltinin tüm bulaşık alanını kapladığından emin olun ve gece boyunca 4 ° C'de bırakın.
- 2. Gün: diseksiyon, tritürasyon ve immünopanning
- Poli-D-lizini aspire edin, plakaları doku kültürü suyuyla üç kez yıkayın, kapağı açın ve yüzeyin bir biyogüvenlik kabininde tamamen kurumasını bekleyin. Her bir kuyucuğun tabanını kaplamak için plakalara yeterli laminin uygulayın ve 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. 24 delikli plakalar için 200 μL yeterlidir.
- Tava yemeklerini hazırlamayı bitirin. Her kabı D-PBS ile yıkayın ve 10 μg birincil antikor ile inkübe edin. Oda sıcaklığında en az 2 saat bekletin.
- CD45 kabı için, 5 mL% 0.2 BSA ve 20 μL CD45 primer ekleyin; PDGFRβ kabı için, 5 mL% 0.2 BSA ve 15.4 μL PDGFRβ ekleyin; O4 kabı için, 3 mL% 0.2 BSA, 2 mL O4 hibridom ve ilave 100 μL% 4 BSA ekleyin (nihai BSA konsantrasyonunun% 0.2'de kalmasını sağlamak için).
- 0.1 mL / kg sodyum pentobarbitol kullanarak bir ila dört fareyi ötenazi yapın (10 cm immünopanning kabı başına). 8-10 haftalıkken C57BL / 6 fareleri kullandık. Her iki cinsiyet de birbirinden ayrı olarak kullanılmış ve kültürlenmiştir. Hayvanı 30 mL soğuk% 0.9 salin ile perfüze edin.
- Ön ve arka pençeleri strafor bir aşamaya sabitleyin ve omurgayı arkadan açığa çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Omuriliği açığa çıkarmak için dorsal omuriliğin her iki tarafında yaklaşık yarıya kadar derin kesikler yaparak, kolonun dorsal yarısını çıkararak laminektomi yapın. Ya sinirleri yavaşça kesin ve omuriliği çıkarın ya da sinir bütünlüğünü koruyarak kordonu yavaşça yana doğru itin.
- Omuriliğin her iki tarafındaki tüm DRG'leri bulmak ve çıkarmak için omurilik sinir köklerini (kopmuş veya omuriliğe bağlı) kullanın. Her DRG'den sinir kalıntılarını çıkarılırken kesin (kültürdeki daha fazla sinir kalıntısı, zayıf kültür sağkalımına yol açabilir). DRG'leri buz üzerinde 15 mL HBSS-/- içinde 15 mL konik tüpte toplayın.
NOT: Dokunun açık havada diseke edildiğini, ancak DRG'lerin tüpe eklendikten sonra steril olarak muamele görmeleri ve sadece bir biyogüvenlik kabininde manipüle edilmeleri gerektiğini unutmayın. - Dondurulmuş stemksim 1 ve% 0.4 DNAse stoklarını, diseksiyonların bitiminden yaklaşık 30 dakika önce (kabaca son fareyi başlatırken) bir su banyosuna yerleştirin. Konik tüpün dibine yerleşmelerine izin verin, ardından protokolü bir biyogüvenlik kabininde devam ettirin.
- HBSS-/- 'nin çoğunu DRG'lerden aspire edin. <1 mL sıvı elde etmek için emmek yerine bir pipet kullanın ve doku kaybetme riskini almamak için ~ 100 μL sıvı bırakın.
- 1 mL HBSS-/- ile üç kez yıkayın. Dokuya 5 mL çalışma sapksim çözeltisi ekleyin. Kapağı şeffaf bir filmle örtün ve tüpü 1 saat boyunca 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosunda yan tarafında yüzdürün.
- Enzimde inkübasyondan sonra, tüpe 1 mL düşük ovo inhibitörü çözeltisi ekleyin. Hücreleri bir p1000 pipetle 10-15 kez hafifçe üçe koyun. Doku parçalarının yerleşmesine izin verin.
- En üstteki 2-3 mL çözeltiyi (ayrışmış hücreler içeren) taze düşük ovomukoid çözeltiye aktarın. Doku tamamen ayrışana ve görünür parçalar kalmayana kadar tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj. Son 1 mL için emme yerine bir pipet kullanarak ~ 100 μL bırakarak süpernatantı tekrar sifonlayın ve hücre peletini 1 mL kaydırma tamponunda yeniden askıya alın.
- Karıştırmak için hafifçe pipet yapın. 70 μm'lik bir hücre süzgecini 50 mL'lik bir konik tüp üzerinde 1 mL kaydırma tamponu ile önceden ıslatın. Hücre çözeltisini hücre süzgecinden geçirin.
- Tüpü 1 mL tava tamponu ile yıkayın, ardından süzgeçten geçirin (3 mL filtrat). Miyelin kalıntılarını gidermek için hücre süspansiyonunu nazikçe (bir seferde 1 mL) %15'lik bir BSA yastığının 2 mL'sinin üzerine yerleştirin. 2 mL'lik bir yastık iki fare için etkilidir ve 3 mL, dört fare için etkilidir.
- Katmanlama için, 2 mL BSA'yı tüpe yerleştirin, tüpün kenarlarını BSA ile kapatın ve nazikçe kaplayın. Ardından, tüpün yan tarafına pipetleme yaparak üstteki hücre süspansiyonunu yavaşça katmanlayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj (yavaş hızlanma ve yavaşlama). Üstteki berrak sıvıyı, aradaki miyelin fazını ve BSA'yı bir seferde 1 mL'den çıkarmak için bir P1000 pipet kullanın (her mL arasında uçları değiştirin). Peletleri rahatsız etmemek için ~ 100 μL BSA bırakın.
- 5 mL tava tamponu ekleyin ve tüpü 30-45 dakika boyunca 37 ° C,% 10 CO2 inkübatörde inkübe edin. Bu, antijen geri alımına izin verir. Gaz değişimine izin vermek için kapağı gevşettiğinizden emin olun.
- CD45 kabını D-PBS ile üç kez yıkayın. Son durulamayı dökün. Hücre süspansiyonunu CD45 kabına boşaltın.
- CD45 kabındaki hücreleri oda sıcaklığında toplam 20 dakika boyunca inkübe edin, hücrelerin antikora eşit erişimini sağlamak için 10 dakikalık noktada yavaşça döndürün.
- PDGFRβ kabını D-PBS ile üç kez durulayın ve son durulamayı dökün. Bağlanmamış hücreleri CD45 kabından PDGFRβ kabına aktarın.
- CD45 kabını yavaşça sallayın ve bir açıyla destekleyin. Bağlanmamış hücreleri toplamak için hücre süspansiyonunun 1 mL'sini çanak üzerine nazikçe pipetin. Kalan hücre süspansiyonunu PDGFRβ plakasına aktarmak için PDGFRβ kabına ve pipete boşaltın.
- PDGFRβ plakasını oda sıcaklığında toplam 20 dakika boyunca inkübe edin, hücrelerin antikora eşit erişmesine izin vermek için 10 dakikalık noktada hafifçe dönün.
- O4 kabını D-PBS ile üç kez durulayın ve son durulamayı dökün. Bağlanmamış hücreleri PDGFRβ kabından O4 kabına adım 3.2.19'da olduğu gibi aynı yöntemi kullanarak aktarın. O4 plakasını oda sıcaklığında toplam 20 dakika boyunca inkübe edin, hücrelerin antikora eşit erişmesine izin vermek için 10 dakikalık noktada hafifçe döndürün.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreleri istenen hacimde yeniden askıya alın ve hücre canlılığı için 1: 1'i tripan mavisi ile seyreltin. Bir hemositometre ile orta ila büyük hücreleri sayın (bu, kültürdeki nöron sayısının en iyi şekilde temsil edilmesini sağlayacaktır).
- Laminini çıkarın ve hücreleri istenen yoğunlukta plakalayın. Plakanın laminin çıkarılması ve kaplanması arasında kurumasına izin vermeyin ve hücreleri hemen ekleyin.
- Nöronal zenginleştirme için nicelleştirilmiş hücreleri kültürleyin (Şekil 3), 24 kuyucuklu plakalarda kuyu başına 25 μL kültür ortamında (1.2.7'de tanımlanmıştır) 500 nöron ile kültürlendirin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kuyuları 500 μL'lik son bir hacme kadar taşın.
- 4. Gün: İmmünositokimya (ICC) fiksasyonu, blokajı ve primer
- 48 saatlik büyümeden sonra, hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 8 PFA'nın 500 μL / kuyusu (veya kuyudaki ortama eşdeğer hacim) ekleyin. Medya analizi isteniyorsa, doğrudan% 4 PFA ile düzeltilebilir. Ancak, bunu test etmedik.
- Hücreleri D-PBS ile üç kez yıkayın. Not, bu hücreleri medya değişikliği olmadan kültürde maksimum 72 saat tuttuk, ancak özellikle medya yarı yarıya değiştirilirse, daha uzun süre hayatta kalabileceklerini varsayıyoruz.
- Son yıkamayı çıkarın ve hücreleri tamamen örtmek için kuyucuk başına yeterli blokaj çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edin. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve antikor çözeltisine birincil antikor ekleyin: 1: 1.000 seyreltmede β3-tübülin. Plakayı şeffaf filmle kapatın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Fibroblastların yokluğu için PDGFRβ, bağışıklık hücrelerinin yokluğu için CD45, miyelin yokluğu için P0 veya PMP22 veya uydu glia için fabp7 ile boyanması düşünülebilir.
- 5. Gün: ICC ikincil
- Hücreleri D-PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamayı çıkarın ve antikor çözeltisine ikincil antikorlar ekleyin: 1:500 seyreltmede anti-tavşan 488 ve 1:2.000 seyreltmede DAPI. Işıktan korunmuş oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- D-PBS ile üç kez yıkayın. Kuyunun altını örtecek kadar D-PBS ekleyin ve görüntü alın. Plaka şeffaf film ile kapatılabilir, ışıktan korunabilir ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DAPI ve β3-tübülin ile boyanan sabit hücreler daha sonra konfokal yüksek içerikli bir tarama sistemi ile görüntülendi. Görüntüler, β3-tübülin ile birlikte etiketlenen DAPI-pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için uygun ticari yazılım kullanılarak analiz edildi (Şekil 3). Tüm DRG kültürlerinde %42.36 ± %6.4 β3-tübülin boyama, immünopanlanmış DRG kültürlerinde ise %71.44 ±%7.43 β3-tübülin boyama olduğu belirlendi. Bu, immünopanning ile nöronal zenginleştirmede anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymaktadır (p < 0.0001, eşlenmemiş t-testi).
Şekil 1: İmmünuppanning temelleri. İkincil bir antikor bir gecede bir kültür kabına yapıştırılır ve daha sonra birincil antikorlar verilir. Bu, ilgilenilen hücrelerin plakaya bir yüzey antijeni ile bağlanmasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yetişkin fare DRG nöronun negatif seleksiyon ile immünopanizasyonu. DRG'ler toplanır, ayrıştırılır ve tek bir hücre çözeltisine süzülür. Miyelin kalıntıları bir BSA yastığından santrifüjleme ile uzaklaştırılır. Hücre süspansiyonu daha sonra nöronlar için zenginleştirilmiş bir kültür elde etmek için üç immünopanning kabından (CD45, PDGFRβ ve O4) geçirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İmmünupanjasyon ile DRG kültürü nöronal zenginleştirme. Sabit kültürler nöronlar için β3-tübülin ve tüm çekirdekler için DAPI ile boyandı. (A) Bütün (immünopansız olmayan) bir kültürün temsili görüntüsü. (B) İmmünpedan bir kültürün temsili görüntüsü. (C) Toplam DAPI-pozitif hücrelerin yüzdesi olarak β3-tübülin-pozitif hücrelerin nicelleştirilmesi. Çubuklar ortalamayı ± standart hata ortalamasını (SEM) gösterir. = p < 0.0001, eşlenmemiş t-testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu immünopanning protokolü, DRG primer kültürlerinde nöronal hücrelerin oranını arttırır. En iyi sonuç için, diseksiyonlar zamanında yapılmalı ve DRG'ler fazla sinirlerden kesilmelidir. Ayrışma adımı, hücrelerin gereksiz stresten korunmasını önlemek için dikkatlice izlenmeli ve 1 saati geçmemelidir. Özellikle immünopanning ile ilgili olarak, hücrelerin kaplanmış antikorlara erişmesine izin vermek için her plaka yarı yolda yavaşça döndürülmelidir. Plakalar, nöronal olmayan hücrelerin bağlandığından emin olmak için nöronal hücre süspansiyonu toplandıktan sonra bir kültür mikroskobu altında da görülmelidir.
Yetişkin farelerin kullanımındaki bir sınırlama, DRG'lerin yerleşik doğasıdır. Tüm nöronal olmayan hücre tiplerinin çıkarılamaması, kültürün kabaca% 30'unu nöronal olmayan olarak bırakır (Şekil 3). Bağışıklık hücrelerinin, fibroblastların ve Schwann hücrelerinin popülasyonunu kültürlerden ayırıp azaltabilirken, uydu glia'nın nöronlardan ayrılması son derece zor olabilir. Ayrıca, bu nöronların uydu glia10 tarafından sağlanan metabolik destek olmadan zayıf hayatta kalma sürelerine sahip olabileceğini varsayıyoruz. GFAP kullanarak bu hücreler için boyama girişimimiz zayıf antikor özgüllüğü nedeniyle başarısız olsa da, gelecekteki bir yön fabp7 kullanarak bu hücreler için boyama yapmak olabilir. Bu protokolde sorun giderirken uydu glia gibi CD9 pozitif nöronal olmayan hücreleri çıkarmaya çalıştık. Bununla birlikte, CD9 plakasında, birçok nöronun plakaya bağlı olduğu bulunmuştur. Fare nöronlarının bazı CD9 ekspresyonlarına sahip olabileceğini varsayıyoruz. Aslında, fare nöronu benzeri hücrelerden hücre dışı vezikül literatürü, CD9'u bir belirteç11 olarak kullanır. Uydu glia oranını azaltmak için daha uygun bir panning antikoru bulunabilirse, bu destekleyici hücrelerin kaybına karşı koymak için NGF, BDNF veya NT3 gibi büyüme faktörleri ile ek takviye düşünülebilir.
Bu immünopanning protokolü, kültürdeki nöronal hücrelerin oranını artırarak homojen DRG kültür örneklerinden elde edilen nöronal okumaların doğruluğunu artırabilir. Ayrıca, yetişkin fare DRG nöronlarının kültürlenmesi için bir yol sağlar ve genetik, hastalık ve yaralanma fare modellerinde nöronal fenotiplerin derinlemesine araştırılmasına olanak tanır.
İmmünuppanning aynı zamanda son derece özelleştirilebilir bir araçtır. Örneğin, hücre yüzey belirteci izolektin-B4, özellikle peptiderjik olmayan fare nosiseptörlerini seçmek için kullanılabilir. İmmünupanjin, kortikal nöronlar, mikroglia, astrositler ve oligodendrosit öncü hücreleri dahil olmak üzere diğer birincil kültürleri zenginleştirmek için de kullanılabilir. Birincil hücre kültürlerinin uygulamalarını genişletebilen güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü'nden (FRN-162434) bir Proje Hibesi ve Kanada MS Derneği'nden (EGID-3761) bir Keşif Hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar, ImageXpress sisteminin eğitimi ve kullanımı için Dr. Sun ve Cross Cancer Institute'a teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
