Summary
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.
Abstract
장내 마이크로바이옴의 구성은 동물의 발달과 생활 전반에 걸쳐 숙주 생리학에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 마이크로바이옴의 조성 변화를 측정하는 것은 이러한 생리적 변화 사이의 기능적 관계를 식별하는 데 매우 중요합니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )은 숙주-마이크로바이옴 상호작용의 분자 동인을 조사하기 위한 강력한 숙주 시스템으로 부상했습니다. 투명한 신체 구조와 형광 태그가 부착된 천연 미생물을 통해 개별 예쁜꼬마선 충 동물의 장내 미생물 군집 내 미생물의 상대적 수준은 대형 입자 분류기를 사용하여 쉽게 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 마이크로바이옴의 실험적 설정, 원하는 생애 단계에서 예쁜꼬마선충 개체군의 수집 및 분석, 분류기의 작동 및 유지 관리, 결과 데이터 세트의 통계 분석을 위한 절차를 설명합니다. 또한 관심 미생물을 기반으로 분류기 설정을 최적화하기 위한 고려 사항, 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 생애 단계에 대한 효과적인 게이팅 전략 개발, 장내 마이크로바이옴 구성을 기반으로 동물 개체군을 풍부하게 하기 위해 선별기 기능을 활용하는 방법에 대해서도 논의합니다. 잠재적인 응용 프로그램의 예가 프로토콜의 일부로 제시되며, 여기에는 처리량이 많은 응용 프로그램으로의 확장 가능성이 포함됩니다.
Introduction
동물의 진화는 끊임없는 미생물의 영향을 받고 있다1. 동물 숙주는 환경의 다양한 미생물로부터 숙주의 능력을 확장하고 생리적 특성과 질병에 대한 감수성을 촉진하는 특정 파트너2를 획득한다3. 예를 들어, 장내 마이크로바이옴에 대한 메타게놈 분석은 비만 마우스에서 더 많은 에너지 수확 및 저장을 제공할 수 있는 미생물 유전자의 풍부한 대사 클래스를 밝혀냈으며4 그 중 다수는 인간의 장내 마이크로바이옴에서도 발견된다5. 인과 관계를 확립하고 마이크로바이옴 영향의 분자 결정 요인을 정확히 찾아내야 할 필요성이 여전히 크지만, 대규모 스크리닝에 대한 숙주 시스템의 마이크로바이옴 복잡성과 다루기 쉬움으로 인해 진전이 방해를 받고 있습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans) 모델 유기체는 마이크로바이옴과 숙주 생리학 간의 연관성에 대한 분자적 이해를 증진할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 점막층과 융모 구조를 가진 20개의 장 세포를 가지고 있습니다. 이 세포는 미생물 생성물을 감지하고 잠재적으로 장내 집락을 조절하는 항균 분자를 생성하는 풍부한 화학 수용체 유전자를 갖추고 있습니다 6,7. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 보존된 생물학은 인슐린 신호전달, TGF-beta 및 MAP Kinase 8,9,10을 포함하여 장내 미생물을 조절하는 숙주 신호전달에 대한 엄청난 수의 발견으로 이어졌습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)은 발달 중 성장을 위한 식단과 성인이 된 마이크로바이옴 모두에서 미생물을 활용합니다. 나이가 들어감에 따라 일부 미생물은 장 내강에 과도하게 축적될 수 있으며, 숙주-미생물 관계는 공생에서 발병 기전으로 바뀔 수 있다11. 자연 서식지에서 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 다양한 박테리아 종을 만난다12,13. 자연 서식지(썩은 과일, 식물 줄기 및 동물 벡터)에서 수집된 대표 샘플에서 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과, 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 자연 마이크로바이옴은 프로테오박테리아(Proteobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 피르미쿠테스(Firmicutes), 악티노박테리아(Actinobacteria) 등 4가지 박테리아 문(phyla)이 지배적이라는 사실이 밝혀졌습니다. 이러한 구분 내에는 서식지12,13,14,15에 따라 박테리아의 다양성과 풍부함에 큰 차이가 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 연구 커뮤니티17를 위해 만들어진 최고의 마이크로바이옴 속(genera)을 대표하는 63명의 회원(BIGbiome)16 및 12명의 회원(CeMbio) 컬렉션을 포함하여 여러 정의된 커뮤니티가 구축되었습니다. 마이크로바이옴과 구성 균주는 모두 예쁜꼬마선충의 생리학에 신체 크기, 성장 속도 및 스트레스 반응과 같은 다양한 영향을 미칠 수 있습니다 9,16,17. 이러한 연구는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 마이크로바이옴 연구의 모델로 확립하기 위한 리소스와 사례를 제공합니다.
여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 시스템을 활용하여 인구 규모에서 마이크로바이옴 구성과 숙주 생리학의 기본 측정을 동시에 측정하는 대형 입자 분류기(LPS) 기반 워크플로우(그림 1)를 제시합니다. 미생물 측면에서, 워크플로우는 정의된 마이크로바이옴 또는 단일 미생물을 조합하여 증가하는 미생물 상호 작용과 함께 군집의 견고성과 가소성을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 숙주 측에서 워크플로우를 통해 고처리량 분석을 통해 마이크로바이옴에서 형광 미생물의 집락화 수준을 측정하고 발달, 신체 크기 및 번식 측면에서 숙주 생리학적 판독을 수행할 수 있습니다. 종합하면, 예쁜꼬마선충(C. elegans) 마이크로바이옴 모델은 숙주 생리학을 조절하는 대사 및 유전적 결정 요인을 정확히 찾아낼 수 있는 고처리량 스크리닝을 가능하게 합니다.
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Protocol
1. 마이크로바이옴 혼합물의 제조
- 글리세롤 냉동고 스톡에서 박테리아를 리소겐 브로스(LB) 플레이트 또는 적절한 성장 배지에 스탬핑 또는 줄무늬를 제거하고 관심 박테리아 균주를 기반으로 최적의 온도( 일반적으로 예쁜꼬마선충 천연 미생물의 경우 25°C)에서 밤새 성장합니다.
- LB 플레이트에서 각 박테리아 분리물(예: CeMbio 컬렉션의 박테리아 12개)에서 단일 콜로니를 사용하여 1mL 딥 웰 플레이트의 별도 웰에 800μL의 LB 배지를 접종합니다. 250rpm에서 진탕하여 최적의 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
참고: 이 프로토콜은 정의된 천연 마이크로바이옴(예: CeMbio)과 함께 사용하도록 최적화되어 있지만 적절한 조건 또는 기타 배양 용기(튜브)에서 성장을 통해 개별 미생물에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. - 분광광도법으로 각 미생물의 성장을 평가합니다. 20μL 부분 표본을 80μL의 LB로 옮기고 용액을 투명하고 평평한 바닥 96웰 플레이트에 추가합니다. 플레이트 리더에서 OD600 을 측정합니다.
- 하룻밤 동안 성장시킨 후 딥웰 배양 플레이트를 4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화하고 96웰 흡인 매니폴드 또는 멀티채널 피펫을 사용하여 흡인하여 상층액을 제거합니다.
- OD600 값을 사용하여 멸균 M9 배지를 사용하여 각 미생물의 농도를 최종 OD600 1.0으로 정규화합니다.
- 미생물을 결합하는 경우 실험에 필요한 박테리아 배양의 양을 결정하고 각 박테리아 균주를 충분한 크기의 튜브(예: 5mL 또는 15mL 튜브)에 동일한 부피로 결합하여 마이크로바이옴 마스터 믹스를 만듭니다.
- 최종 OD 600이 1.0인 미생물30-50μL 를 각 선충 성장 배지(NGM) 한천 함유 플레이트 또는 웰18의 중심에 배치합니다. 씨앗을 뿌린 마이크로바이옴이 최적의 온도(여기서는 25°C)에서 하룻밤 동안 자라도록 합니다.
알림: Wormbook의 지침에 따라 또는 미리 혼합된 NGM 분말18을 사용하여 NGM 한천 플레이트를 미리 준비하십시오. 예를 들어, 12웰 플레이트의 경우 3mL의 NGM이 추가되고 24웰 플레이트의 경우 1.5mL가 추가됩니다.
2. 마이크로바이옴 성장을 위한 동기화된 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 준비
- Escherichia coli OP50을 뿌린 NGM 플레이트(직경 6cm)에서 약 100마리의 지렁이를 성충이 될 때까지 키웁니다. 이 프로토콜의 목적을 위해 예쁜꼬마선충 N2 균주가 사용되었지만, 이 프로토콜은 다른 선충 균주에 쉽게 적용될 수 있습니다.
- M9 완충액 6mL(트리톤 X-100 0.01% 추가; M9-TX)를 플레이트에 넣고 위아래로 피펫팅하여 약 100마리의 육아형 성충을 15mL 원뿔형 튜브로 씻어냅니다.
- 표백제 2부와 5M NaOH 1부를 혼합하여 갓 만든 표백제 용액을 준비합니다.
- 웜을 3,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화합니다. 흡인하여 부피를 4mL로 낮춘 다음 표백제 용액 2mL를 추가합니다.
- 뚜껑을 단단히 닫고 튜브를 흔듭니다. 10x 배율로 실체 현미경으로 용액의 성충을 모니터링합니다. 일반적으로 3.5분 후에 성인의 몸이 부서지기 시작하면 흔들림을 멈추고 3,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다.
- 피펫으로 최소 부피로 흡인합니다. 재현탁, 원심분리 및 M9-TX에서 4회 흡인하여 표백제를 씻어냅니다.
- 4-6 mL의 M9-TX에 재현탁하고 튜브를 하룻밤 동안 회전기에 올려 알이 부화하고 L1 단계에서 동기화되도록 합니다.
- 다음날 튜브에서 M1-TX의 L9 웜 10μL를 가져와 깨끗한 페트리 접시에 떨어뜨립니다. 실체 현미경으로 살아있는 L1 웜의 수를 총 20배 배율로 계산합니다.
- L1 밀도에 따라 적절한 부피를 피펫팅하여 마이크로바이옴 시드 NGM 플레이트의 가장자리에 ~50개의 동기화된 L1 유충을 떨어뜨리고 20°C에서 배양합니다. 벌레가 원하는 나이(성충 2일 또는 3일)까지 자라도록 합니다.
3. 장내 마이크로바이옴 분석을 위한 기생충 집단 수집
- 1-2mL의 M9-TX로 박테리아 잔디밭에서 벌레를 멸균된 2mL 96웰 깊은 플레이트로 씻어냅니다.
알림: 중요한 생물막을 생성하는 미생물 균주의 경우 미생물 파편을 분해하기 위해 액체로 플레이트를 5분 동안 흔듭니다. - 딥웰 플레이트를 300 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화한 다음 흡입 매니폴드를 사용하여 액체를 제거합니다.
알림: 사용자는 흡입 매니폴드를 사용할 수 없는 경우 멀티채널 피펫을 사용하여 액체를 수동으로 제거할 수 있습니다. 웜 샘플의 손실을 방지하기 위해 피펫 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 하십시오. - 1.2mL 멀티채널 피펫을 사용하여 딥 웰 플레이트의 각 웰에 1.8mL의 M9-TX를 추가합니다. 피펫팅을 위아래로 몇 번 혼합하고 300 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 이 단계를 네 번 반복하여 액체의 박테리아를 제거합니다.
- 최종 세척 후 흡입 매니폴드를 사용하여 각 웰의 부피를 100μL로 가져옵니다.
알림: 중력을 사용하여 유충과 성충을 분리하려면 판을 벤치에 30-60초 동안 두어 성충이 우물 바닥으로 가라앉을 수 있도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 흡인하여 현탁액에서 유충을 제거합니다. - M9-TX에 100μL의 레바미솔을 각 웰에 넣고 웜이 5분 동안 마비되도록 합니다. 레바미솔 처리 후 필요한 경우 박테리아 덩어리를 줄이기 위해 2.3단계에서 설명한 표백제 용액 4%를 각 웰에 2분 동안 추가합니다. 표백제 처리 후 M9-TX로 두 번 세척하고 두 번째 세척 후 최종 부피 100μL까지 흡인합니다.
- 웜을 M9-TX에 150μL의 10mM 레바미솔을 함유한 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다. 웜 밀도를 우물당 50-100으로 유지하고 개체군이 너무 붐비면 웜을 여러 개의 우물로 나눕니다.
4. 대형 입자 분류기 및 자동 시료 주입기 설정
- 공기 압축기, 컴퓨터 및 LPS 기기를 켭니다. 폐기물 탱크를 확인하고 비우십시오. 그런 다음 빈 폐기물 탱크에 표백제 500mL를 추가합니다. 양이 적으면 덮개와 물 탱크를 확인하고 다시 채우십시오. 250μm 유체 및 광학 코어 어셈블리(FOCA)가 제자리에 있는지 확인합니다.
- 품질 관리를 위해 제어 입자를 실행합니다. LPS 악기 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어 창에서 Enable Lasers (레이저 활성화)를 선택하여 488nm 및 561nm 레이저를 켭니다.
알림: 제어 입자가 지난 4.2주 이내에 실행되었고 해당 시간 동안 FOCA가 변경되지 않은 경우 4.5-2단계를 건너뛸 수 있습니다. - 컨트롤 파티클 설정(Set Up > Control Particles) 을 선택합니다. 프롬프트에서 아니요 를 선택하여 기본 설정으로 이동합니다. 매번 사용하기 전에 대조군 입자(50mL 원뿔형 튜브에 10mL dH,2O및 10mL 대조군 입자)를 소용돌이치게 하고 시료 포트에 로드합니다.
- 준비가 되면 Acquire 를 클릭하여 500개의 이벤트를 기록합니다. 이벤트 속도가 초당 15–30개 이벤트인지 확인합니다.
알림: 이벤트 속도가 15–30 events/s가 아닌 경우 엔지니어에게 연락하여 기계 설정을 조정해야 합니다. - 모든 모수에 대한 변동 계수(CV)를 조사합니다. CV가 15%<면 품질 관리를 통과하고 LPS 소프트웨어를 닫을 수 있습니다. CV> 15%이면 다시 실행하고 새로 만든 대조군 입자로 마이크로미터를 조정하여 레이저를 플로우 셀에 맞춥니다.
- 오토샘플러를 연결하고 켭니다. 오토샘플러 기기 소프트웨어를 엽니다. 그러면 오토샘플러와 LPS 소프트웨어가 열립니다. LPS 소프트웨어 창에서 파일 > 새 실험으로 이동한 다음 파일 > 새 샘플로 이동합니다. 아직 수행하지 않은 경우 Enable Lasers(레이저 활성화)를 선택하여 488nm 및 561nm 레이저를 켭니다.
- LPS 소프트웨어 창에서 TOF(Time of Flight), 소멸(EXT) 및 형광 채널을 사용하여 획득 점도표를 위한 템플릿을 만들 수 있습니다. 모든 웜을 포획할 수 있는 좋은 시작 최대 수는 TOF 및 EXT의 경우 8,000개입니다. 형광 스케일은 각 미생물에 따라 다릅니다. 비형광 미생물(예: OP50)에서 성장한 대조군 웜 샘플과 각 형광 미생물 단독(미생물을 혼합하는 경우)을 모든 실험에 대조군으로 포함합니다.
- 그래프 본문 내에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 배율을 수정합니다. Day 1 성체 또는 동기화된 L1(또는 관심 개체군)과 같은 대조 동물을 사용하여 TOF 및 EXT 게이팅 선택을 지원합니다.
- 오토샘플러 창에서 Prime을 선택합니다. 파일 > 스크립트 열기 로 이동하여 올바른 기본 제공 스크립트를 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
- 분석의 경우에만 Acquire가 있는 스크립트를 선택합니다. 정렬을 위해 Dispense가 있는 스크립트를 선택합니다. 96웰 플레이트에서 수집하려면 96웰이 있는 스크립트를 선택합니다. 384웰 플레이트에서 수집하려면 384웰이 있는 스크립트를 선택합니다. 시료 부피(40 또는 100 μL)의 경우 해당 부피가 있는 스크립트를 선택합니다.
- 오토샘플러 소프트웨어 메뉴의 플레이트 템플릿(Plate Template )으로 이동하여 분석할 웰을 선택합니다. 대조군 샘플을 불러옵니다. 플레이트를 오토샘플러 스테이지에 로드하고 고정한 후 오토샘플러 창에서 플레이트 실행 을 누릅니다. 메시지가 표시되면 파일을 저장합니다.
참고: 제어 샘플 및 설정은 LP 샘플러를 부착하기 전에 LPS 샘플 포트의 50mL 원뿔형 튜브로 수행할 수 있습니다. - 수집이 완료되면 LPS 소프트웨어 창의 상단 리본에 있는 데이터 저장 버튼을 클릭하고 데이터를 다시 저장합니다.
5. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 특징과 동물별 장내 마이크로바이옴 수준 분석
- 원시 데이터는 .lmd, .bxr3, .txt 등 세 가지 파일 형식으로 저장됩니다. 분석을 위해 .txt 파일이라는 텍스트 파일을 R 프로그램에 로드합니다. R19에서 아래 단계를 완료합니다.
- tidyverse20 패키지를 분석의 프레임워크로 사용하십시오.
- ggplot 함수(tidyverse에 포함됨)를 사용하여 TOF 값을 x축으로, EXT 값을 y축으로 사용하여 LPS 데이터를 플로팅합니다. 일반 플롯에는 두 개의 점 구름이 표시됩니다. 하나는 유충 및 작은 파편과 같은 작은 입자를 나타내는 원점과 x축에 가깝고 두 번째 입자 그룹은 플롯의 오른쪽 상단에 있으며 성체 선충을 나타냅니다.
- 이 그룹화를 가이드로 사용하여 적절한 TOF 및 EXT 컷오프 값을 선택합니다. 게이팅은 생리학의 변화에 따라 다른 미생물에 대한 예쁜꼬마선충 균주에 따라 달라질 수 있습니다(예: 어두운 동물과 투명한 동물 또는 계란 운반의 변화는 EXT 계수를 변경할 수 있음).
- 함수 서브셋을 사용하여 성충과 유충을 TOF 및 EXT 게이팅으로 분리합니다. 이 예에서는 TOF > 1,200 및 EXT > 1,000 설정을 사용하여 성체 동물을 게이트합니다.
- 결과 데이터 세트에서 통계적 차이를 분석합니다. 이 실험에는 R의 t-검정 함수를 사용합니다.
- 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 크기와 광학 밀도에 대한 마이크로바이옴의 영향을 확인하려면 조건 간에 각각 TOF 및 EXT 값을 비교합니다. TOF는 벌레 크기를 나타내며 특정 시기에 동물의 성장 속도 변화를 나타낼 수 있습니다. EXT 변화는 난자에 의해 산란되는 빛으로 인해 발달 말기와 성체 사이에 가장 크며 그 전환 시기와 생식력의 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분석 중에 자손이 유지된 경우 자손의 비율과 분포를 평가합니다.
- 장내 마이크로바이옴 집락 수준의 변화를 확인하려면 먼저 각 동물에 대한 개별 TOF 값으로 나누어 형광 값(예: 빨간색 또는 녹색 열)을 정규화합니다. 벌레의 크기가 커지고 성충이 되면 장의 부피도 커집니다. 정규화는 표본 동물 크기 분포의 차이로 인한 아티팩트를 줄이는 데 도움이 됩니다. 정규화된 동물을 사용하여 조건에 따른 장내 마이크로바이옴 집락화의 변화를 평가합니다.
참고: 원시 데이터 예제 및 해당 R 스크립트는 보충 파일 1 JOVE_worm_microbiome.txt 및 보충 파일 2 JOVE_worm_microbiome.r에서 찾을 수 있습니다. 그림 2와 그림 3은 두 개의 형광 박테리아를 사용한 숙주와 마이크로바이옴 분석의 대표적인 예를 참조하십시오.
6. 예 쁜꼬마선충(C. elegans) 동물의 장내 마이크로바이옴 특징별 분류
- 3단계에서 설명한 대로 형광 표지 미생물(예: RFP)에서 성장한 예쁜꼬마선충(C. elegans) 개체군을 수집합니다. 웜은 최소 5mL의 샘플과 함께 50mL 원뿔형 튜브에 넣어야 합니다. 모든 성충과 자손을 포함하여 약 2,000마리의 벌레/mL를 목표로 합니다.
알림: 이것은 LP 샘플러를 사용하여 평평한 바닥 96웰 플레이트에서도 수행할 수 있습니다. 웜 밀도를 웰당 50-100으로 유지합니다.- LP sampler를 사용한 경우 LP를 끄고 분리하십시오.amp레러. 분류하기 전에 샘플 및 퍼지 라인을 LPS에 다시 연결합니다.
- LPS 소프트웨어를 열고 파일 > 새 실험으로 이동한 다음 파일 > 새 샘플로 이동합니다. x축에 TOF가 있고 y축에 Extinction이 있는 점도표를 만듭니다. x축에 TOF가 있고 y축에 빨간색이 있는 또 다른 점플롯을 만듭니다. 이전에 사용한 것과 동일한 축 스케일 및 레이저 설정을 사용합니다. Enable Lasers(레이저 활성화)를 선택하여 488nm 및 561nm 레이저를 켭니다.
참고: 이러한 플롯이 이전에 생성된 경우 File > Open Experiment 및 File > Open Sample로 이동하여 그래프를 로드합니다.- 제어 배치ample 튜브를 s에 놓습니다.amp르 포트. Acquire/Dispense 대화 상자에서 Acquire를 클릭합니다. 메시지가 표시되면 파일을 저장합니다. 개체군을 구별할 수 있을 만큼 충분한 웜을 측정한 후 중단을 클릭합니다.
알림: 유속은 약 15–30 이벤트/초여야 합니다. 그렇지 않은 경우 웜 농도를 조정하여 개별 동물이 비말별로 분석되거나 분류되도록 합니다. LPS에서 웜은 다양한 위치(직선 대 말림 또는 구부러짐)에서 레이저 경로를 통과합니다. 위치에 따라 레이저와 검출기를 통과하는 데 다른 시간이 걸릴 수 있습니다. - TOF 대 Extinction 점도표에서 성인 인구 주위에 게이트를 그립니다. TOF 대 Red 점 그림에서 마이크로바이옴 집락화 수준이 다른 성충의 관심 영역으로 빨간색 값이 높고 낮은 영역 주위에 게이트를 그립니다. View > Gating Hierarchy(게이트 계층 구조 보기)로 이동하여 형광 게이트가 성인 인구 게이트 아래에 나열되어 있는지 확인합니다. 설정을 최적화한 후 파일 > 실험 저장 및 파일 > 샘플 저장으로 이동합니다.
참고: 여기의 예에서는 성체용 TOF/EXT 게이트를 기준으로 동물을 선택하고 적색 형광 단백질 발현 박테리아에 대한 집락화가 높거나 낮은 풀로 분류합니다. 그러나 LPS에 의해 측정된 매개변수의 모든 조합을 사용하여 관심 있는 모집단을 식별할 수 있습니다.
- 제어 배치ample 튜브를 s에 놓습니다.amp르 포트. Acquire/Dispense 대화 상자에서 Acquire를 클릭합니다. 메시지가 표시되면 파일을 저장합니다. 개체군을 구별할 수 있을 만큼 충분한 웜을 측정한 후 중단을 클릭합니다.
- 분류하기 전에 적절한 수집 장치가 로드되었는지 확인하십시오. 96웰 플레이트를 수집 장치에 로드하려면 수집/분배(Acquire/Dispense) 대화 상자의 이동 단계(Move Stage) 섹션에서 플레이트 A 로드( Load Plate A ) > 이동(Move )을 선택하여 수집 단계가 96웰 플레이트를 로드할 수 있는 위치로 이동할 수 있도록 합니다.
- 벌크 분류의 경우 적절한 튜브 크기를 선택하고 이동 을 클릭하여 15mL 또는 50mL 코니컬 튜브를 로드합니다. Acquire/Dispense 대화 상자의 Sorting(정렬) 섹션에 있는 생성된 영역의 드롭다운 목록에서 정렬 게이트를 선택합니다. 정의된 영역에서 플로우 셀 노즐 바로 아래에 있는 수집 튜브로 분주할 물체의 수를 입력합니다. Acquire/Dispense 대화 상자 아래의 Bulk Sort 버튼을 클릭합니다.
- 96웰 플레이트에 디스펜싱하려면 Setup > Plates(플레이트 설정) > Calibrated Plates(보정된 플레이트) > 96-well Plate(96웰 플레이트)로 이동합니다. 그런 다음 플레이트 템플릿 보기(View > Plate Template)로 이동하여 웜을 정렬할 웰을 선택하고 각 웰에 정렬할 개체 수를 입력한 다음 관심 있는 게이트 영역을 선택합니다. 둘 이상의 게이트 영역이 동일한 플레이트로 정렬되는 경우 Gate Each Well 확인란을 선택합니다. 확인을 클릭하여 변경 사항을 저장합니다.
- 정렬 번호와 위치를 지정한 후 획득/분배 대화 상자에서 플레이트 채우 기 버튼을 클릭하여 96웰 플레이트에 대한 디스펜싱을 시작합니다.
- 전체 96웰 플레이트를 채우기 전에 동물 또는 대조군의 하위 집합을 96웰 플레이트로 테스트 분류하고 실체현미경을 사용하여 분석하여 적절한 수와 원하는 동물 개체군이 분류되었는지 확인합니다. 정확한 분류가 확인되면 실험 샘플에 대해 6.3-6.6단계를 반복합니다. LPS 소프트웨어 창의 상단 리본에 있는 데이터 저장 버튼을 클릭하여 데이터를 다시 저장합니다.
알림: 분류된 동물에 대한 모든 측정값(EXT, TOF, RFP, GFP 등)도 수집하여 분류되지 않은 동물과 비교할 수 있습니다. 이를 통해 원하는 경우 분석 및 정렬 모드를 동시에 실행할 수 있습니다.
- 전체 96웰 플레이트를 채우기 전에 동물 또는 대조군의 하위 집합을 96웰 플레이트로 테스트 분류하고 실체현미경을 사용하여 분석하여 적절한 수와 원하는 동물 개체군이 분류되었는지 확인합니다. 정확한 분류가 확인되면 실험 샘플에 대해 6.3-6.6단계를 반복합니다. LPS 소프트웨어 창의 상단 리본에 있는 데이터 저장 버튼을 클릭하여 데이터를 다시 저장합니다.
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Representative Results
성충 및 유충 개체군 게이트 정의
여기에서 동기화된 예쁜꼬마선충(C. elegans) L1은 표준 실험실 식단인 E. coli OP50(Eco)으로 파종된 NGM 플레이트에서 성장했습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 개체군은 20°C에서 96시간 또는 120시간 성장한 후 LPS 분석을 위해 수집되었습니다(그림 2A). 멸종의 점도표(EXT, 신체 밀도의 대리물)와 비행 시간(TOF, 신체 길이의 대리)은 시각적으로 분리된 두 개의 동물 구름을 만듭니다. 각 점은 유충에 비해 성충에서 더 높은 EXT 및 TOF 값이 관찰되는 단일 동물을 나타냅니다(그림 2B). 이 두 매개변수는 개체군 증가와 생리학에 대한 귀중한 추론입니다. 예를 들어, 유충 TOF의 밀도 플롯은 유충 단계의 분포를 시각화할 수 있습니다. 생후 2일 된 성체의 자손은 TOF가 200 미만인 L1 및 L2 단계가 지배적이었던 반면, 생후 3일 된 성체의 자손은 대부분 L3 및 L4 단계에 도달했습니다(그림 2C). 또한 2D 밀도 및 상자 수염 플롯은 대장균에서 자랄 때 2일차에 비해 3일차에 TOF 및 EXT 값이 증가하기 때문에 성인 신체 크기 및 밀도의 변화를 시각화하는 데 유용합니다(그림 2D-F). 이 관계는 일반적으로 성인기 동안 선형 관계이지만 생리학의 일부 변화는 다른 기능보다 한 기능에 더 많은 영향을 미칠 수 있습니다(예: 난자가 없는 성인은 TOF에 영향을 주지 않고 더 낮은 EXT 값을 가질 수 있음).
형광 표지 미생물을 사용한 장내 마이크로바이옴 조성 프로파일링
다양한 수준의 군집을 설명하기 위해 천연 예쁜꼬마선충 마이크로바이옴 dTomato-tagged Ochrobactrum BH3(Och)와 녹색 형광 단백질(GFP) -taged E. coli OP50의 우세한 군집체를 비교합니다. 이 두 가지는 NGM 플레이트에서 OD(1:1 혼합)를 기반으로 동일한 혼합물로 개별적으로 파종되었습니다. 동기화된 예쁜꼬마선충(C. elegans) L1을 세 가지 조건에서 성장시키고 120시간에 수집하여 생후 3일 된 성체의 집락 역학을 조사했습니다(그림 3A). 2D 밀도 및 상자 수염 플롯은 예쁜꼬마선충(C. elegans)이 Ochrobactrum BH3에서 성장하고 배양물을 혼합할 때 성체 TOF 및 EXT 값에 차이가 있음을 보여주었습니다(그림 3B-E). 박테리아의 장내 집락화는 개별 선충에서 검출된 형광 수준으로 추론할 수 있습니다. 적색 형광 판독 값의 상자 수염 플롯은 Ochrobactrum BH3 단독보다 혼합 조건에서 Ochrobactrum BH3 집락화가 증가했음을 보여줍니다. 대조적으로, 녹색 형광 값은 OP50 단독보다 혼합 조건에서 OP50 집락화가 더 낮다는 것을 나타냅니다. TOF 정규화 형광 신호에서도 유사한 경향을 관찰할 수 있으며, 이는 신체 크기의 영향을 제거하고 집단 내 변동을 줄입니다(그림 3F-I). 여러 형광 표지 미생물이 있는 정의된 마이크로바이옴의 경우 점도표는 이러한 미생물의 집락화 패턴을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 2인 혼합 마이크로바이옴에서 적색 형광 단백질(RFP)과 GFP 채널의 점도표는 웜이 y축(RFP) 쪽으로 심하게 치우쳐 있음을 보여주며, 이는 대부분의 웜에서 OP50 집락화가 낮은 반면 Ochrobactrum BH3 집락화 수준은 개체군에 고르게 분포되어 있음을 시사합니다(그림 3J). 마찬가지로, RFP와 EXT의 점도표는 Ochrobactrum BH3 집락화 수준과 체밀도와 같은 숙주 발달 사이의 관계를 밝힐 수 있습니다(그림 3K). 또한 번식 패턴의 차이는 세 가지 조건에 대한 각 유충 개체군의 밀도 플롯을 표시하여 관찰할 수 있습니다(그림 3L).
마이크로바이옴 집락화에 기반한 표적 집단에 대한 농축
2인 혼합 마이크로바이옴에서 자란 3일 된 성체는 광범위한 RFP 강도를 나타내며, 이는 그룹 내 Ochrobactrum BH3 집락화의 개인차를 나타냅니다(그림 4A). 이러한 하위 그룹을 더 분리하기 위해 전체 웰의 RFP 이미지에서 볼 수 있듯이 RFP가 높고 낮은 분류 게이트를 수동으로 그려 각 게이트의 15개체를 96웰 플레이트로 분류했습니다(그림 4B). 더 높은 배율에서 명시야 및 RFP 채널의 오버레이 이미지는 분류 방법이 높고 낮은 Ochrobactrum BH3 집락화 웜을 선택한다는 것을 확인시켜 표현형 결과 및 분자 동인의 추가 특성을 분석할 수 있습니다(그림 4C).
그림 1: 장내 마이크로바이옴 및 숙주 생리학을 평가하기 위한 유동 지렁이 기반 방법의 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성충과 유충 개체군 정의. (A) 성충 2일차와 3일차에 예쁜꼬마선충 개체군을 수집하는 워크플로. (B) 성충 2일차(회색)와 3일차(빨간색)에 예쁜꼬마선충 개체군에 대한 비행 시간(TOF) 대 멸종(EXT)의 점도표. (C) 성충 2일차와 3일차에 유충 TOF의 밀도 플롯. (D-E) 성인기 2일차와 3일차에 성인에 대한 TOF와 EXT의 점 및 수염 그림. (F) 성충 2일차와 3일차의 성체 멸종에 대한 상자와 수염 그림. p-값은 학생의 t-검정(*** p < 0.001; 2일차 n = 38; 3일차 n = 88). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형광 표지 미생물을 사용한 장내 마이크로바이옴 집락화 프로파일링. (A) Ochrobactrum BH3에서 자란 3일 된 성체 개체군 수집(dTomato-expressing; Och), 대장균 OP50 (GFP 발현; Eco) 또는 두 박테리아의 1:1 혼합(혼합). (B) 믹스에서 자란 3일차 성인에 대한 TOF와 EXT의 점도표. (씨-E) Ochrobactrum BH3에서 자란 3일 된 성인에 대한 TOF와 EXT의 점 및 상자 수염 플롯. 회색 점선은 OP50에서 성장한 모집단의 평균값을 나타냅니다. (에프지) Mix 및 Ochrobactrum BH3 단독으로 자란 3일 된 성인에 대한 원시 및 TOF 정규화 dTomato(RFP) 값의 상자 수염 플롯. (H-I) 믹스 및 OP50에서 자란 3일 된 성인을 위한 원시 및 TOF 정규화 GFP의 상자 및 수염 플롯. (J) 혼합으로 자란 3일 된 성인에 대한 Ochrobactrum BH3(RFP) 대 E. coli OP50(GFP)의 점도표. (K) 혼합으로 자란 3일 된 성체에 대한 RFP 대 EXT의 점도표. (L) 혼합, Ochrobactrum BH3 및 OP50에서 자란 3일 된 성충의 유충 밀도 플롯. 모든 P-값은 학생의 t-검정(*** p < 0.001; ** p < 0.01; n.s., 유의하지 않음; 혼합 n = 230; Och n = 45)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마이크로바이옴 집락을 기반으로 표적 개체군을 강화 합니다. (A) 생후 3일 된 성인에 대한 TOF와 RFP(Ochrobactrum BH3)의 점도표. 높은(빨간색 상자) 및 낮은(검은색 상자) RFP 게이트를 그려 예 쁜꼬마선충(C. elegans) 을 높고 낮은 Ochrobactrum BH3 집락으로 풍부하게 합니다. (B) 높은 RFP 게이트와 낮은 RFP 게이트(Bar = 1mm)에서 분류된 15개의 웜을 포함하는 웰의 대표 RFP 이미지(4x). (C) 높고 낮은 RFP 게이트(Bar = 100μm)의 개별 웜의 대표 이미지(10x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 대장균 OP50 및 Ochrobactrum BH3에서 자란 2일차 및 3일차 성체의 N2 집단에 대해 대형 입자 분류기에 의해 생성된 대표 데이터 세트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: R 환경에서 대표 데이터셋의 분석 및 그림 생성에 사용되는 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유동 지렁이 측정법은 여러 연구에서 병원균 집락화 및 독성에 대한 예쁜꼬마선충 유전자 및 경로를 특성화하는 데 사용되었습니다21,22. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 사용하여 장내 마이크로바이옴이 숙주 생리학을 조절하는 방법을 조사하는 고처리량 조정 가능한 접근법을 제시합니다. 콜로니 형성 단위(CFU) 또는 16S rRNA 앰플리콘 염기서열분석 9,16,17,23,24를 사용하는 기존 방법과 비교할 때 이 접근 방식은 노동 집약적인 계수가 필요하거나 잠재적인 PCR 바이어스를 도입하지 않습니다. 전체 개체군에서 마이크로바이옴을 측정하는 것 외에도 이 접근 방식을 통해 사용자는 개체군 내의 개별 변이를 시각화할 수 있습니다. 이 접근법은 형광 단백질 발현 또는 미생물 염색의 가용성과 LPS의 검출 채널 수에 의해서만 제한됩니다. 실험 설계에 대한 추가 고려 사항은 사용자가 필요에 따라 맞춤형 워크플로우를 생성할 수 있도록 아래에 설명되어 있습니다.
정의된 마이크로바이옴 생성 및 시드에 대한 고려 사항
먼저, 각 박테리아 배양액은 서로 다른 균주를 혼합하기 전에 OD600 값 1로 정규화됩니다. 군집의 복잡성과 종간 관계에 따라, 시작 밀도가 확립된 마이크로바이옴 조성에 다양한 영향을 미칠 수 있다는 점에 주목할 필요가 있다23. OD는 분광 광도계로 쉽게 측정할 수 있지만, 한 가지 주의할 점은 박테리아마다 동일한 OD 값에 대해 농도가 다르기 때문에(예: mL당 세포 수) 그에 따라 조정해야 한다는 것입니다. 둘째, 잔디밭의 마이크로바이옴 구성의 변화를 고려해야 합니다. 마이크로바이옴이 NGM 플레이트(또는 다른 배지)에 파종되면 마이크로바이옴은 동기화된 L1 C. elegans 개체군을 플레이트에 떨어뜨리기 전에 실온에서 밤새 성장할 수 있습니다. 박테리아 균주 간의 성장 속도 및 종간 상호 작용의 변화로 인해 NGM 플레이트 또는 성장을 위한 기질이 있는 플레이트에서 자란 마이크로바이옴은 원래 종자 혼합물과 구성이 다릅니다. 펩톤이 없는 NGM 플레이트를 사용하면 원래의 미생물 군집을 보존할 수 있다13. 그러나 펩톤이 없는 플레이트의 마이크로바이옴 성장이 제한되어 있기 때문에 플레이트당 더 높은 파종 OD 또는 감소된 동기화된 L1 수가 필요할 수 있습니다. 이렇게 하면 개체군이 원하는 분석 연령에 도달하기 전에 굶주리는 것을 방지할 수 있습니다. 또 다른 접근법은 잔디밭에 있는 미생물의 비율을 순서를 정하거나 달리 결정하기 위한 것이다.
마이크로바이옴 집락화와 예쁜꼬마선충(C. elegans) 생리학 측정
첫째, 성체에 대한 멸종(EXT) 및 비행 시간(TOF) 게이팅 임계값은 연령, 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 균주 배경 및 이들이 자라는 미생물에 따라 달라질 수 있습니다. 각 벌레/박테리아 상태에 대한 실험에서 생후 1일 된 성체 개체군을 보유하는 것은 TOF 및 멸종 컷오프를 결정하고 성장 배지 및 환경으로 인한 변동을 제어하는 데 유용할 수 있습니다. 성충을 위한 게이팅 외에도 TOF와 EXT를 유충의 게이트에 적용할 수 있으며, 자손의 밀도 플롯을 통해 개체군 수준에서 번식 시기와 생산량을 추정할 수 있습니다(그림 3L). 둘째, 신호 대 잡음비를 최대화하고 포화를 피하기 위해 신호 범위를 설정하기 위해 LPS의 PMT 이득과 전압을 조정해야 합니다. 이것은 박테리아 균주의 형광 강도와 집락화 수준에 따라 다릅니다. 350의 기본 PMT는 Ochrobactrum BH3와 같은 높은 콜로니저에 적합하지만 사용자는 E. coli OP50과 같은 낮은 콜로니저에 대해 PMT 또는 전압 값을 높여야 할 수 있습니다. 셋째, 형광단의 특성과 형질전환 박테리아 균주에서의 발현 수준의 차이로 인해 형광 값은 마이크로바이옴에 존재하는 박테리아의 절대 수를 반영하지 않습니다. 그러므로, GFP와 RFP 가치는 2개의 다른 형광성 미생물 사이 집락화를 직접 비교하기 위하여 이용될 수 없습니다. 살아있는 박테리아 수를 식별하기 위해 동물을 파괴하고 플레이팅하면 이러한 관계를 더 잘 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다24.
강화 기반 전략의 잠재적 응용 분야
이 방법은 집단 수준에서 숙주 생리학에 대한 마이크로바이옴 변화의 영향을 조사할 수 있는 고처리량 플랫폼을 제공합니다. 미생물 측면에서, 박테리아 게놈25,26,27을 편집하기 위한 도구 및 자원의 가용성이 증가함에 따라 예쁜꼬마선충 자연 마이크로바이옴과 관련된 형광 및 기능성 미생물 돌연변이의 수가 증가할 것입니다. 숙주 측에서는 수많은 형광 리포터를 사용하여 세포 신호전달과 마이크로바이옴 조성 사이의 연관성을 탐구할 수 있습니다. 특정 마이크로바이옴 집락화 특징을 가진 돌연변이가 발생한 집단(예: EMS forward mutagenesis)28 또는 풀링된 야생 균주(pooled wild strains)29로부터 숙주 집단 또는 돌연변이를 농축하는 능력은 마이크로바이옴 영향을 조절하는 숙주 유전자를 연결하는 능력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한, 숙주 및/또는 마이크로바이옴 특성에 기반한 집단 선택은 오믹스 기반 프로파일링 양식의 핵심도 용이하게 할 수 있습니다. 이 접근법은 유연성이 뛰어나며 숙주-마이크로바이옴 상호 작용의 분자 매개자에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 DP2DK116645(B.S.S.), Dunn Foundation 파일럿 상 및 NASA 보조금 80NSSC22K0250(B.S.S.)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 베일러 의과대학의 세포분석 및 세포 분류 코어(Cytometry and Cell Sorting Core)의 지원을 받아 CPRIT Core Facility Support Award(CPRIT-RP180672), NIH(S10 OD025251, CA125123 및 RR024574), Joel M. Sederstrom의 지원과 LPS NIH 보조금(S10 OD025251)을 위한 계측 보조금을 받았습니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 CGC에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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