Summary
El presente protocolo establece y caracteriza un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), ya que los modelos PDX se están convirtiendo rápidamente en el estándar en el campo de la oncología traslacional.
Abstract
Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) preservan fielmente las características histológicas y genéticas del tumor primario y mantienen su heterogeneidad. Los resultados farmacodinámicos basados en modelos PDX están altamente correlacionados con la práctica clínica. El carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) es el subtipo más maligno de cáncer de tiroides, con fuerte invasividad, mal pronóstico y tratamiento limitado. Aunque la tasa de incidencia de ATC representa solo el 2% -5% del cáncer de tiroides, su tasa de mortalidad es tan alta como 15% -50%. El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es una de las neoplasias malignas de cabeza y cuello más comunes, con más de 600,000 casos nuevos en todo el mundo cada año. En este documento, se presentan protocolos detallados para establecer modelos PDX de ATC y HNSCC. En este trabajo, se analizaron los factores clave que influyen en la tasa de éxito de la construcción del modelo y se compararon las características histopatológicas entre el modelo PDX y el tumor primario. Además, la relevancia clínica del modelo se validó mediante la evaluación de la eficacia terapéutica in vivo de fármacos representativos utilizados clínicamente en los modelos PDX construidos con éxito.
Introduction
El modelo PDX es un modelo animal en el que el tejido tumoral humano se trasplanta en ratones inmunodeficientes y crece en el ambiente proporcionado por los ratones1. Los modelos tradicionales de líneas celulares tumorales sufren de varias desventajas, como la falta de heterogeneidad, la incapacidad de retener el microambiente tumoral, la vulnerabilidad a las variaciones genéticas durante los pasajes in vitro repetidos y la aplicación clínica deficiente 2,3. Los principales inconvenientes de los modelos animales genéticamente modificados son la pérdida potencial de las características genómicas de los tumores humanos, la introducción de nuevas mutaciones desconocidas y la dificultad para identificar el grado de homología entre los tumores de ratón y los tumores humanos4. Además, la preparación de modelos animales genéticamente modificados es costosa, lenta y relativamente ineficiente4.
El modelo PDX tiene muchas ventajas sobre otros modelos tumorales en cuanto a reflejar la heterogeneidad tumoral. Desde la perspectiva de la histopatología, aunque la contraparte del ratón reemplaza al estroma humano con el tiempo, el modelo PDX preserva bien la estructura morfológica del tumor primario. Además, el modelo PDX conserva la identidad metabolómica del tumor primario durante al menos cuatro generaciones y refleja mejor las complejas interrelaciones entre las células tumorales y su microambiente, lo que lo hace único en la simulación del crecimiento, la metástasis, la angiogénesis y la inmunosupresión del tejido tumoral humano 5,6,7. A nivel celular y molecular, el modelo PDX refleja con precisión la heterogeneidad intertumoral e intratumoral de los tumores humanos, así como las características fenotípicas y moleculares del cáncer original, incluidos los patrones de expresión génica, el estado de mutación, el número de copias y la metilación del ADN y la proteómica 8,9. Los modelos PDX con diferentes pasajes tienen la misma sensibilidad a la terapia farmacológica, lo que indica que la expresión génica de los modelos PDX es altamente estable10,11. Estudios han demostrado una excelente correlación entre la respuesta del modelo PDX a un fármaco y las respuestas clínicas de los pacientes a ese fármaco12,13. Por lo tanto, el modelo PDX se ha convertido en un poderoso modelo de investigación preclínica y traslacional, particularmente para la detección de fármacos y la predicción del pronóstico clínico.
El cáncer de tiroides es un tumor maligno común del sistema endocrino y es una neoplasia maligna humana que ha mostrado un rápido aumento de la incidencia en los últimos años14. El carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) es el cáncer de tiroides más maligno, con una mediana de supervivencia del paciente de sólo 4,8 meses15. Aunque sólo una minoría de los pacientes con cáncer de tiroides son diagnosticados con ATC cada año en China, la tasa de mortalidad es cercana al 100%16,17,18. El ATC generalmente crece rápidamente e invade los tejidos adyacentes del cuello, así como los ganglios linfáticos cervicales, y aproximadamente la mitad de los pacientes tienen metástasis a distancia19,20. El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más común en el mundo y una de las principales causas de muerte por cáncer, con un estimado de 600,000 personas que sufren de HNSCC cada año21,22,23. El HNSCC incluye una gran cantidad de tumores, incluidos los de la nariz, los senos paranasales, la boca, las amígdalas, la faringe y la laringe24. ATC y HNSCC son dos de las principales neoplasias malignas de cabeza y cuello. Para facilitar el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos y tratamientos personalizados, es necesario desarrollar modelos animales preclínicos robustos y avanzados, como los modelos PDX de ATC y HNSCC.
Este artículo presenta métodos detallados para establecer el modelo PDX subcutáneo de ATC y HNSCC, analiza los factores clave que afectan la tasa de toma del tumor en la construcción del modelo y compara las características histopatológicas entre el modelo PDX y el tumor primario. Mientras tanto, en este trabajo, se realizaron pruebas farmacodinámicas in vivo utilizando los modelos PDX construidos con éxito para validar su relevancia clínica.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y protocolos de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan. Para el presente estudio se utilizaron ratones inmunodeficientes NOD-SCID de 4 a 6 semanas de edad (de ambos sexos) y ratones desnudos Balb/c hembras de 4 a 6 semanas de edad. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). El comité de ética del West China Hospital autorizó el estudio con sujetos humanos (protocolo número 2020353). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito.
1. Preparación experimental
- Coloque cuchillas desechables, tijeras y pinzas esterilizadas y otros instrumentos necesarios para el trasplante de tumores, colóquelos en el banco de trabajo ultralimpio e irradie con luz ultravioleta por adelantado.
- Prepare solución salina estéril y placas de Petri para usar durante la prueba.
2. Adquisición y transporte de tejido tumoral fresco
- Obtenga muestras frescas de tumores (generalmente de más de 5 mm x 5 mm de tamaño) del quirófano y colóquelas en un tubo centrífugo de 15 ml o 50 ml que contenga solución estéril de HTK (consulte la Tabla de materiales) o solución salina. Etiquete los tubos de la centrífuga.
NOTA: Se obtuvieron muestras tumorales frescas mediante extirpación quirúrgica o punción de pacientes con ATC o HNSCC. - Coloque los tubos de la centrífuga en una nevera preparada de antemano.
NOTA: Durante este tiempo, el operador del trasplante debe preparar los elementos necesarios para el trasplante (consulte la Tabla de materiales). - Asegúrese de que el tiempo entre la recolección de muestras y el transporte al laboratorio para la construcción de PDX no exceda las 2 h. Durante el transporte, rodee los tubos que contienen los tejidos con una mezcla de agua helada o bolsas de hielo para preservar la actividad del tejido.
3. Trasplante de tumores
- Una vez que los tejidos tumorales lleguen al laboratorio, regístrelos y vuelva a numerarlos.
NOTA: Para el presente estudio, la información del paciente se mantuvo estrictamente confidencial. Los pasos restantes del procedimiento se realizaron en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Al ingresar al laboratorio, se recomienda usar una bata sobre la ropa de trabajo o ropa protectora, un sombrero y una máscara. El tratamiento del tejido tumoral se lleva a cabo en un gabinete de bioseguridad. - Desinfecte los tubos de centrífuga que contienen los tejidos tumorales con alcohol al 75% y colóquelos en la mesa de operaciones. Transfiera los tejidos tumorales a placas de Petri de 6 cm llenas de solución salina utilizando fórceps oftálmicos esterilizados. A continuación, córtalos en trozos pequeños de aproximadamente 2 mm x 2 mm y 3 mm x 3 mm con una cuchilla.
- Transfiera los pedazos de tejidos tumorales a una placa de Petri de 6 cm que contenga la cantidad adecuada de solución salina, envuelva el plato con la película de sellado, colóquelo en una nevera y llévelo a la sala de animales libre de patógenos específicos (SPF) junto con los instrumentos necesarios (un par de tijeras, fórceps y agujas de inoculación).
- Prepare al animal siguiendo los pasos a continuación.
- Retire el vello en el tórax lateral derecho de ratones inmunodeficientes hembra o macho NOD-SCID hembra o macho de 4-6 semanas de edad, y desinfecte la piel con alcohol al 75%. Anestesiar a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina (ver Tabla de materiales), y untar sus ojos con ungüento veterinario para prevenir la sequedad. Confirme la profundidad de la anestesia mediante la pérdida del reflejo pedal.
- Haga una incisión de 2 mm con tijeras a través de la piel en el centro del tórax lateral derecho de los ratones.
- Tome una pieza tumoral de la placa de Petri y colóquela en la aguja de trócar de 2.4 mm x 2.0 mm (consulte la Tabla de materiales) con fórceps.
- Sostenga el ratón, apriete la piel en el sitio de punción, use el trócar que contiene las piezas tumorales para insertar el tumor a través de la incisión inicial de piel de 2 mm, muévase hacia la parte posterior del hombro y empuje el núcleo del trócar.
- Asegúrese de que la pieza tumoral se empuje hacia afuera y se deje en el seno de transición formado por la punción del trócar, y luego saque el trócar.
- Si el tumor se mueve con la aguja cuando se retira, use el trócar para restablecerlo y suturar la incisión.
NOTA: En este estudio, cada ratón fue inoculado en las extremidades dorsales anteriores y posteriores. Se inocularon de uno a tres ratones por muestra tumoral de cada paciente según el tamaño del tumor.
4. Preservación del tejido tumoral, fijación y congelación de proteínas
NOTA: Los tejidos tumorales restantes se utilizaron para la preservación de semillas, la fijación y la congelación de ADN / ARN / proteínas, respectivamente.
- Retire la solución salina de la superficie del tumor con una gasa estéril antes de colocarla en el tubo de criopreservación para asegurarse de que la superficie del tumor no esté excesivamente húmeda.
- Coloque de cuatro a seis piezas de tejido tumoral de 2 mm x 2 mm en un tubo de criopreservación de células de 2 ml, agregue 1 ml de solución de criopreservación compuesta de suero bovino fetal al 90% (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en el tubo, coloque el tubo en una caja de enfriamiento de gradiente, congélelo a -80 ° C durante la noche y, finalmente, Transfiéralo a nitrógeno líquido.
- Coloque los bloques de tejido tumoral de 3 mm x 3 mm en formalina tamponada al 10% para la fijación tisular para el examen patológico.
- Coloque el bloque de tejido de 3 mm x 3 mm en un tubo de criopreservación celular de 2 ml, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y luego transfiéralo a un refrigerador de -80 ° C para la extracción de ADN / ARN y proteínas.
- Recopilar la información clínica de los pacientes, como los antecedentes de tabaquismo, el tamaño del tumor, la diferenciación, el subtipo patológico, el grado de cáncer, el estadio del cáncer, la metástasis a distancia, el origen, la historia clínica, la inmunohistoquímica, la infección por el virus del papiloma humano (VPH) en pacientes con HNSCC y la medicación del tratamiento.
5. Pasaging, criopreservación y reanimación de tumores modelo PDX
- Mida la longitud y el ancho de los tumores subcutáneos en ratones utilizando calibradores vernier una vez a la semana, y calcule el volumen del tumor de acuerdo con la fórmula: volumen tumoral = 0.5 × largo × ancho2. Dibujar la curva de crecimiento del tumor.
- Cuando el tumor PDX alcanza los 2.000 mm3, pasarlo a la siguiente generación de ratones y realizar un nuevo trasplante del tumor. Realice la preparación de los instrumentos siguiendo el paso 4.
- Eutanasia a los ratones por luxación cervical después de anestesiar con 80 mg/kg de ketamina.
- Desinfectar la piel con alcohol al 75%. Luego, corte la piel que rodea el tumor con tijeras, luego retire el tumor con fórceps y colóquelo en una placa de Petri.
- Realice el procedimiento de trasplante de tumor siguiendo el paso 3.
- Realizar la preservación y criopreservación de los tumores modelo PDX siguiendo el paso 4.
- Para la reanimación del tejido tumoral, siga el principio de congelación lenta y disolución rápida. Después de extraer los crioviales del nitrógeno líquido, colóquelos rápidamente en un baño de agua a 37 ° C para una rápida disolución.
- Agite suavemente los crioviales en el baño de agua para acelerar el proceso de descongelación.
- Descongelar, transferir las piezas tumorales a la solución salina normal preparada para el lavado y luego inocular a la próxima generación de ratones. Para la operación específica, consulte el procedimiento de trasplante de tejido en el paso 3.
6. Determinación de la eficacia terapéutica de lenvatinib y cisplatino en el modelo ATC PDX
NOTA: Se utilizó el modelo ATC PDX para probar el efecto terapéutico del inhibidor de la tirosina cinasa lenvatinib y del fármaco quimioterapéutico cisplatino25,26,27.
- Seleccione el tejido tumoral de generación P5 de un modelo ATC PDX (THY-017), corte en trozos de tejido de2-4 mm 3 e inocule por vía subcutánea (paso 3) a la espalda derecha de diez ratones desnudos Balb/c hembra de 4-6 semanas.
- Seleccione 15 ratones con volúmenes tumorales entre 50-150 mm3 y divídalos en tres grupos.
- Administrar lenvatinib (10 mg/kg) por vía intragástrica a un grupo una vez al día durante 15 días, administrar cisplatino (3 mg/kg) por vía intraperitoneal a un grupo cada 3 días para un total de seis dosis, y administrar el grupo control con el mismo volumen de solución salina normal.
- Mida el peso corporal y el volumen tumoral de los ratones dos veces por semana.
- Al final de la prueba, sacrificar a los ratones (paso 5.3) y pesar los tumores.
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Representative Results
Se trasplantaron un total de 18 muestras de cáncer de tiroides y se construyeron con éxito cinco modelos PDX de cáncer de tiroides (tasa de toma de tumores del 27,8 %), incluidos cuatro casos de cáncer de tiroides indiferenciado y un caso de cáncer anaplásico de tiroides. Se analizó la correlación entre la tasa de éxito de la construcción del modelo y la edad, el sexo, el diámetro del tumor, el grado tumoral y la diferenciación. Aunque la tasa de éxito del modelo de muestras tumorales de grado 4 fue mayor que para las muestras con grados más bajos, y la tasa de éxito de las muestras tumorales indiferenciadas también fue mayor que la de las muestras altamente diferenciadas, los resultados del análisis de correlación mostraron que estos factores no se asociaron con la tasa de éxito del modelo PDX (Tabla 1). Se inocularon diecisiete muestras de HNSCC y se construyeron con éxito cuatro modelos PDX de HNSCCC. El análisis de correlación entre la tasa de captación tumoral en la construcción del modelo y los parámetros clínicos de las muestras tumorales demostró que el grado de diferenciación se asoció con la tasa de éxito del modelo, mientras que la edad, el sexo, los antecedentes de tabaquismo, el diámetro tumoral, el grado de cáncer, la metástasis y la infección por VPH no afectaron la tasa de captación tumoral (Tabla 2).
Las curvas de crecimiento tumoral para cada modelo PDX se trazaron para comprender mejor las tasas de crecimiento de los modelos PDX de diferentes pacientes (Figura 1, Figura 2 y Tabla 3). Los ciclos tumorigénicos promedio (tiempo desde la inoculación hasta un tamaño tumoral de 1.000 mm3) de THY-004 de las generaciones P0 a P5 fueron de 68 días, 87 días, 29 días, 34 días, 28 días y 26 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de THY-012 de las generaciones P0 a P5 fueron de 119 días, 61 días, 66 días, 55 días, 87 días y 116 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de THY-017 de las generaciones P0 a P5 fueron de 27 días, 17 días, 30 días, 13 días, 22 días y 15 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de THY-018 de las generaciones P0 a P3 fueron de 134 días, 70 días, 48 días y 48 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de THY-021 de las generaciones P0 a P3 fueron de 53 días, 66 días, 35 días y 49 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de OTO-017 de las generaciones P0 a P4 fueron de 118 días, 86 días, 67 días, 129 días y 88 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de OTO-022 de las generaciones P0 a P5 fueron de 155 días, 55 días, 32 días, 37 días, 27 días y 46 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de OTO-030 de las generaciones P0 a P2 fueron de 133 días, 93 días y 104 días, respectivamente. Los ciclos tumorigénicos promedio de OTO-031 de las generaciones P0 a P5 fueron de 144 días, 58 días, 33 días, 34 días, 52 días y 50 días, respectivamente. Las muestras de ATC se pasaron de manera estable a la generación P3 y más tarde, mientras que dos casos de muestras de HNSCC no lograron formar tumores después de pasar a la generación P1. Las tasas de crecimiento de algunas muestras fueron relativamente lentas en la generación P0, pero sus tasas de crecimiento se aceleraron después de pasar a la generación P1 y posteriores. Se compararon las características histopatológicas de los tumores de los pacientes con las de diferentes generaciones de modelos PDX. Los resultados mostraron que los tumores PDX y los tumores primarios derivados de pacientes fueron morfológicamente casi similares (Figura 3), con ligeras diferencias que pueden deberse a la heterogeneidad en el área de muestreo entre pacientes y diferentes generaciones de PDX.
La eficacia antitumoral de lenvatinib (un inhibidor de la tirosina cinasa multidiana aprobado para el tratamiento del cáncer de tiroides avanzado28) se evaluó en el modelo PDX de ATC. Como se muestra en la Figura 4A, el tratamiento con lenvatinib inhibió significativamente el crecimiento tumoral en el modelo ATC PDX en comparación con el grupo control salino normal (P < 0,05). Al final del experimento, el tejido tumoral se extirpó y se pesó para determinar el peso del tumor. En comparación con el grupo control, el peso tumoral del grupo de tratamiento con lenvatinib fue menor, aunque no se logró una diferencia estadística (Figura 4B). Además, no se observaron cambios evidentes en el estado general y el peso corporal en los ratones tratados con lenvatinib (Figura 4C). Debido a la frecuencia excesiva de la administración de cisplatino durante los experimentos, los ratones mostraron toxicidad significativa, manifestada por pérdida de peso e incluso muerte. La eficacia antitumoral del cisplatino se muestra en la Figura Suplementaria 1.
Figura 1: Curva de crecimiento tumoral de modelos ATC PDX de diferentes pacientes. Cada color representa la generación especificada y cada curva representa un solo tumor. De uno a tres ratones fueron inoculados en la generación del pasaje 0 (P0), y cinco ratones fueron inoculados en los pasajes posteriores (P1-P5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curva de crecimiento tumoral de los modelos HNSCC PDX de diferentes pacientes. Cada color representa la generación especificada y cada curva representa un solo tumor. De uno a tres ratones fueron inoculados en la generación P0, y cinco ratones fueron inoculados en P1 y generaciones posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estudio histopatológico. Comparación histopatológica entre los tumores primarios del paciente y las PDX correspondientes (pasaje 1 y pasaje 3) de ATC (THY-012, THY-017) y HNSCC (OTO-017) (tinción hematoxilina-eosina, 100x). Los subtipos patológicos de THY-012 y THY-017 fueron carcinoma anaplásico de tiroides, y el subtipo patológico de OTO-017 fue carcinoma de células escamosas. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Eficacia terapéutica de lenvatinib en el modelo ATC PDX. Cambios en (A) volumen tumoral, (B) peso tumoral y (C) peso corporal de ratones portadores de ATC PDX después del tratamiento con lenvatinib (10 mg/kg). Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas T para comparar levatinib con control. *P < 0,05 versus control se consideró estadísticamente significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetros | Clase | Tasa de toma del tumor (%) | P |
| Edad (años) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Género | Masculino | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Hembra | 33.33 (4/12) | ||
| Diámetro del tumor | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Etapa patológica TNM | Yo | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Diferenciación | Alto | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Pobre | 25.00 (1/4) | ||
| Indiferenciado | 57.14 (4/7) |
Tabla 1: Correlación entre la tasa de captación tumoral ATC y las características clínicas de los pacientes.
| Parámetros | Clase | Tasa de toma del tumor (%) | P |
| VPH | Negativo | 33.33 (2/6) | 1 |
| Desconocido o positivo | 36.36 (4/11) | ||
| Edad (años) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Género | Masculino | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Hembra | 14.29 (1/7) | ||
| Estado de tabaquismo | Alguna vez | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Nunca | 25.00 (2/8) | ||
| Diámetro del tumor | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Etapa patológica TNM | Yo | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Metástasis a distancia | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Diferenciación | Alto | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Moderado a alto | 100.00 (2/2) | ||
| Moderado | 0.00 (0/2) | ||
| Moderado a pobre | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabla 2: Correlación entre la tasa de captación tumoral de HNSCC y las características clínicas de los pacientes. *P < 0,05.
| Nombre de la muestra | Generación P a P0 | Generación P0 a P1 | Generación P1 a P2 | Generación P2 a P3 | Generación P3 a P4 | Generación P4 a P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabla 3: El ciclo tumorigénico promedio (tiempo desde la inoculación hasta un tamaño tumoral de 1.000 mm3) de los modelos ATC y HNSCC.
Figura complementaria 1: La eficacia terapéutica del cisplatino en el modelo ATC PDX. Cambios en (A) volumen tumoral, (B) peso tumoral y (C) peso corporal de ratones portadores de ATC PDX después del tratamiento con cisplatino (3 mg/kg). Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas T para comparar cisplatino con el control. *P < 0,05 versus control se consideró estadísticamente significativo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este estudio ha establecido con éxito los modelos PDX subcutáneos de ATC y HNSCC. Hay muchos aspectos a los que prestar atención durante el proceso de construcción del modelo PDX. Cuando el tejido tumoral se separa del paciente, debe colocarse en la caja de hielo y enviarse al laboratorio para su inoculación lo antes posible. Después de que el tumor llega al laboratorio, el operador debe prestar atención al mantenimiento de un campo estéril y practicar procedimientos asépticos. Para las muestras de biopsia con aguja, debido a que el tejido tumoral es particularmente pequeño, la inoculación después de mezclar la muestra con el gel de matriz sería más propicia para establecer el modelo. El tejido tumoral primario también debe preservarse, fijarse y congelarse tanto como sea posible para futuras investigaciones. Durante la inoculación, el aire en el trócar debe ser expulsado tanto como sea posible después de que las piezas tumorales se hayan colocado en el trócar antes de su uso. Después de la inoculación tumoral, el crecimiento tumoral debe observarse en ratones durante 1-4 meses, y los ratones sin crecimiento tumoral durante más de 6 meses pueden ser sacrificados29.
Los ratones inmunodeficientes son generalmente elegidos como hospedadores para la construcción del modelo PDX 29,30. Desde la generación P0 hasta la generación P2, generalmente se utilizan ratones diabéticos no obesos con deficiencia inmune severa severa (NOD-SCID) o ratones NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG). En la generación P3 y más allá, se considera que las muestras pasan de manera estable, por lo que los ratones desnudos generalmente también pueden servir como huésped, y los tumores también pueden crecer normalmente. Además, el tiempo total de operación, el tiempo de aislamiento tumoral, la supervivencia libre de enfermedad y la tasa de supervivencia general de los pacientes, el grado maligno del tumor y el subtipo histológico se asociaron con la tumorigenicidad del modelo PDX31,32,33,34. El sitio de trasplante también tiene un impacto en la tasa de éxito del modelado PDX, y los estudios han demostrado que la cápsula renal y el trasplante ortotrópico tienen una alta tasa tumorigénica33,35. Además, el uso de Matrigel también puede mejorar la tasa tumorigénica36,37. Se ha notificado que la infección por el virus del papiloma humano (VPH) afecta la tasa de éxito del trasplante en los tumores HNSCC; Los tumores VPH negativos tienen una tasa de toma superior en comparación con los tumores VPH positivos38,39. Este estudio no llegó a la misma conclusión, probablemente debido a los pequeños números de muestra y la información incompleta sobre la infección por VPH.
A diferencia de los modelos ortotópico y de trasplante de cápsula renal, el modelo subcutáneo es más conveniente para observar el crecimiento de tumores y también es propicio para la operación40,41,42. Sobre la base de los datos de crecimiento tumoral del modelo ATC y HNSCC PDX, se encontró que las tasas de crecimiento de los tumores de diferentes pacientes fueron inconsistentes, lo que refleja la heterogeneidad intertumoral. La tasa de crecimiento tumoral de la generación P0 de la mayoría de los modelos PDX fue relativamente más lenta que para los últimos pasajes, lo que probablemente se debió a la adaptación del microambiente del ratón. En particular, la tasa de crecimiento de algunos tumores derivados de pacientes aumentó en diferentes pasajes después de la generación P1, consistente con el intervalo de paso acortado reportado por Pearson et al.43. El examen histopatológico demostró que los tumores PDX conservaron las características morfológicas de los tumores primarios. La correlación entre el modelo PDX y los pacientes clínicos ATC también se reflejó en los resultados de las pruebas farmacodinámicas in vivo, que demostraron que Lenvartinib exhibió un buen efecto antitumoral, consistente con los informes clínicos25,26,27.
Sin embargo, el modelo PDX también tiene ciertas desventajas. Por ejemplo, el tiempo de formación del tumor es relativamente largo, lo que no es adecuado para pacientes con tumores avanzados o agresivos. Además, el tiempo y los costos monetarios de la detección de drogas de alto rendimiento son demasiado altos44. De hecho, la combinación del modelo PDX con organoides tumorales y el establecimiento de un modelo de organoide derivado del paciente (DOP) correspondiente al modelo PDX compensaría esta deficiencia44,45,46. Los modelos de trasplante ortotópico pueden ser utilizados para estudiar la patogénesis y los mecanismos metastásicos de los tumores40,41,47. La falta de un sistema inmune funcional es otra desventaja del modelo PDX, por lo que un número creciente de experimentos están utilizando ratones humanizados para construir el modelo PDX para la investigación de inmunología tumoral48,49,50.
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Disclosures
No se revelan posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología de la Provincia de Sichuan (Subvención Nos. 2019JDRC0019 y 2021ZYD0097), el proyecto 1.3.5 para disciplinas de excelencia, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (Subvención No. ZYJC18026), el proyecto 1.3.5 para disciplinas de excelencia-Proyecto de Incubación de Investigación Clínica, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (Subvención No. 2020HXFH023), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (SCU2022D025), el Proyecto de Cooperación Internacional de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Chengdu (Subvención No. 2022-GH02-00023-HZ), el Proyecto de Chispa de Innovación de la Universidad de Sichuan (Subvención No. 2019SCUH0015) y el Fondo de Capacitación de Talentos para la Integración de Ingeniería Médica del Hospital de China Occidental - Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónicas (Subvención No. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
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