Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ"א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.

Abstract

גירויים מסוימים, כגון מיקרואורגניזמים, גורמים לנויטרופילים לשחרר מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), שהם בעצם מבנים דמויי רשת המורכבים מדנ"א עם חלבוני גרגירים, כגון myeloperoxidase (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE), וחלבונים ציטופלזמיים וציטו-שלד. למרות שהעניין ב- NETs גדל לאחרונה, אין שיטת בדיקה רגישה ואמינה זמינה למדידת NETs במסגרות קליניות. מאמר זה מתאר בדיקה אימונוסורבנטית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של NETs במחזור, MPO-DNA וקומפלקסים NE-DNA, שהם רכיבים ספציפיים של NETs ומשוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs. הבדיקה משתמשת בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. MPO או NE נקשר לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. בדיקה זו מראה ליניאריות טובה ודיוק גבוה בין בדיקות ותוך מבחנים. השתמשנו בו ב-16 חולי COVID-19 עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה נלווית ומצאנו כי ריכוזי ה-MPO-DNA וה-NE-DNA בפלזמה היו גבוהים משמעותית מאשר בפלזמה שהתקבלה מקבוצת ביקורת בריאה. בדיקת זיהוי זו היא שיטה אמינה, רגישה ביותר ושימושית לחקירת המאפיינים של NETs בפלזמה אנושית ובתרבית-על.

Introduction

מאמר זה מתאר שיטה לכימות היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים (NET) בנוזלים ביולוגיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים סנדוויץ' (ELISA) כדי לזהות קומפלקסים של מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE) עם DNA 1,2. NETs מורכבים מעמוד שדרה של DNA המעוטר בפרוטאזות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בגרגרי נויטרופילים 3,4. הן קומפלקסים MPO-DNA והן NE-DNA הם מרכיבים חשובים וספציפיים של NETs והם משוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs 3,4.

מלבד תפקידם הפיזיולוגי החשוב בהגנה אנטי-מיקרוביאלית3, ל-NETs יש גם השפעות פתולוגיות שונות4,5, כולל קידום טרומבוגנזה6 והחמרה באלח דם7. בהתאם לכך, רשתות צוברים תשומת לב לאחרונה. עם זאת, כימות in vivo של NETs הוכח כמאתגר בשל היעדר שיטת בדיקה כמותית רגישה ואמינה.

קיימות מספר שיטות, כולל מדידה ישירה של NETs במיקרוסקופ פלואורסצנטי8,9 וציטומטריית זרימה 10 ומדידה עקיפה של דנ"א נטול תאים במחזור, נוקלאוזומים והיסטון H3 ציטרולינציה, אך לכל שיטה יתרונות ומגבלות משלה11. למרות שהשיטה המיקרוסקופית האימונופלואורסצנטית היא ספציפית ל- NETs ומראה בבירור את הלוקליזציה ואת מידת היווצרות ה- NET, הדגימות מוגבלות לרקמת ביופסיה וחומרים מופרשים. יתר על כן, שיטה זו צריכה להתבצע על ידי חוקרים מיומנים ודורשת זמן רב לקבלת תוצאות. מדידת רמות במחזור של רכיבים הקשורים ל- NET באמצעות ציטומטריית זרימה היא קלה ומספקת תוצאות במהירות; עם זאת, השיטה אינה ספציפית ל- NETs12.

אנו13 ואחרים1,2 פיתחנו בדיקה רגישה ואמינה ביותר למדידת רכיבי NET במחזור, MPO-conjugated או NE-conjugated DNA, בפלזמה אנושית עם טכניקת ELISA שונה המשתמשת בנוגדנים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. בדיקה זו יכולה לשמש גם ex vivo כדי לזהות רכיבי NET בסופרנאטנטים של תרביות תאים המשתחררים על ידי נויטרופילים פעילים בתגובה לגירוי phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי מועצות הסקירה המוסדיות של האוניברסיטה הרפואית אאיצ'י (2017-H341, 2019-H137). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל משתתף.

1. הכנת מגיב

הערה: כדי לבצע את בדיקת הכריך ELISA, הריאגנטים מוכנים כמתואר להלן.

  1. חיץ ציפוי:
    1. כדי ליצור חיץ של 0.1 mol/L קרבונט-ביקרבונט, שקול 10.6 גרם נתרן פחמתי נטול מים (משקל מולקולרי, 106 גרם/מול) ו-8.4 גרם נתרן ביקרבונט (משקל מולקולרי, 84 גרם/מול).
    2. מוסיפים אותו לכ-900 מ"ל מים מזוקקים בכד.
    3. התאם את ה- pH של המאגר ל- 9.6 על ידי הוספת הכמות הנדרשת של חומצה הידרוכלורית מדוללת או נתרן הידרוקסידי.
    4. בדוק את ה- pH עם מד pH.
    5. לאחר מכן, הוסף את הנפח הנדרש של מים מזוקקים כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
    6. אחסנו מאגר זה של 0.1 מול/ליטר פחמתי-ביקרבונט במקרר בטמפרטורה של 4°C.
  2. חיץ חוסם:
    1. הוסף כ-250 מיקרוליטר של 20% נתרן אזיד ו-1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-70 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המורכב מ-137 mmol / L NaCl, 8.1 mmol / L Na 2 HPO 4, 2.68 mmol/ L KCl ו- 1.47 mol/L KH2PO 4 (pH7.4), וערבב בעדינות.
    2. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע לנפח כולל של 100 מ"ל. הריכוזים הסופיים של אלבומין בסרום בקר ונתרן אזיד הם 1% ו-0.05%, בהתאמה. המתן 10 דקות, ואז הפתרון מוכן לשימוש.
  3. תמיסת כביסה: הכינו 0.5% t-אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול, אתר פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל (Triton X-100) במים מזוקקים.
    1. יש לדלל 100% Triton X-100 עד 10% במים מזוקקים, ולאפשר לתמיסה 10% לעמוד יום אחד לפני השימוש.
    2. לאחר מכן, דללו מחדש את תמיסת 10% Triton X-100 פי 20 עם מים מזוקקים כדי להשיג ריכוז של 0.5%.
  4. דילול נוגדנים:
    1. יש לדלל את נוגדן הלכידה (נוגדן אנטי-MPO [1 מ"ג/מ"ל] או נוגדן אנטי-NE [1 מ"ג/מ"ל]) ל-1:2,000 במאגר הציפוי (pH 9.6) לפני השימוש ביום הראשון של הבדיקה (ראה להלן) ואת נוגדן הזיהוי (נוגדן אנטי-DNA מצומד לפרוקסידז) ל-1:40 עם PBS לפני השימוש ביום השלישי של הבדיקה (ראה להלן).
      הערה: לצורך הניסוי הראשוני, דללו את הנוגדנים מסוג ISO (ארנב IgG [5 מ"ג/מ"ל] ושיבוט עכבר IgG1 Ci4 [0.5 מ"ג/מ"ל]) ל-1:10,000 ו-1:1,000 במאגר הציפוי (pH 9.6).
  5. תמיסת מצע ABTS: בהתאם למספר הדגימות, יש להמיס אחת, שתיים או שלוש טבליות 2,2'-azino-bis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) ב-5 מ"ל, 10 מ"ל או 15 מ"ל של מאגר ABTS (המכיל נתרן פרבוראט, חומצת לימון ודיסודיום מימן פוספט); יש צורך ב-100 μL לכל דגימה. אחסנו את התמיסה המוכנה בטמפרטורה של 2-8°C כשהיא מוגנת מפני אור. הפתרון יציב עד 3 חודשים.

2. איסוף ואחסון דוגמאות

  1. בידוד פלזמה:
    1. לאסוף 4 מ"ל של דגימות דם היקפיות לתוך צינור ליתיום הפרין איסוף דם על ידי ניקור עם מזרק 22 G, וצנטריפוגה ב 1,600 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    2. העבירו את הסופרנאטנט לצינור דגימה בעל מנעול כספת בנפח 2 מ"ל.
    3. צנטריפוגה מחדש של הסופרנאטנט ב 16,000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים שיורית.
    4. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינור דגימה חדש לנעילה בטוחה מבלי להפריע לגלולה בתחתית הצינור.
    5. יש לאחסן את הפלזמה המתקבלת בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
      הערה: כדי להשיג תוצאות תפוקה גבוהה עם בדיקה זו, נדרשות דגימות באיכות טובה. אם נעשה שימוש בדגימות פלזמה, בצע צנטריפוגה שנייה כדי להסיר תאים שיורית. הימנעו מהפשרה חוזרת ונשנית של הדגימות. השתמש הפרין כמו נוגד קרישה כי EDTA משפיע על פעילות DNase.
  2. בידוד נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים
    1. לאסוף את דגימות הדם ההיקפיות לתוך צינור ליתיום הפרין איסוף דם על ידי venipuncture עם מזרק 22 G.
    2. שכבה 6 מ"ל של דם על 6 מ"ל של פולימורפים בצעד אחד, וצנטריפוגה את הצינורות ב 1,000 x גרם במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. קצרו את שכבת הפרווה השלישית המכילה נויטרופילים, ושטפו אותה שלוש פעמים ב-RPMI-1640 ללא אדום פנול במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.
    4. יש להשהות מחדש את הנויטרופילים בסל"ד אדום פנול ללא RPMI-1640 המכיל 2 מילימטר L-גלוטמין בתוספת 6% נסיוב בקר עוברי מומת חום, ולספור את התאים בשדה המיקרוסקופ עם המוציטומטר.
      הערה: שיטה זו מניבה טוהר של 96% עד 98% עם כדאיות של יותר מ- 95%, כפי שהוערך על ידי אי הכללת צבע כחול טריפאן.
  3. הפעלה של נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים ו- NETosis in vitro
    1. לדלל נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים טריים שבודדו ל-1 × 105 תאים/מ"ל בפנול ללא אדום RPMI-1640 המכיל 2 mM L-גלוטמין בתוספת 6% סרום בקר עוברי מומת חום, ולזרוע אותם בצלחות תרבית 35 מ"מ.
    2. כדי לגרום ל-NETs, לעורר נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים עם PMA של 25 ננומטר למשך 4 שעות ב-37°C ב-5% CO2/95% אוויר.
    3. לאחר 4 שעות של דגירה, לעכל חלקית את ה- NETs על ידי הוספת 0.6 מיקרוגרם / מ"ל DNase I ישירות לצלחות התרבית למשך 15 דקות ב- RT, ולהפסיק את פעילות DNase I על ידי הוספת 5 mM EDTA.
    4. אסוף את המדיום המכיל את רשתות המסונתזות, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את פסולת התא.
    5. השיגו את הסופרנאטנטים מארבע בקרות בריאות, ערבבו ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
      הערה: נויטרופילים המעוכלים על ידי PMA המעוכלים על ידי DNase המתקבלים מארבע בקרות בריאות משמשים כתקן NET 1,14,15. צור עקומת כיול מהתקן NET בדילול סדרתי עם PBS, והקצה את ערכי הצפיפות האופטית (OD) המתקבלים מתקן NET לא מדולל כ- 100% NET.

3. שיטת Assay

הערה: השלבים לביצוע הבדיקה מתוארים בפירוט להלן.

  1. יום 1
    1. החל סך של 100 μL של נוגדן מדולל anti-MPO או anti-NE המכיל 0.05 מיקרוגרם של נוגדן על כל באר של הצלחת, כולל הבאר הריקה.
      הערה: חיץ הציפוי אינו יכול להכיל כל סוג של חומר ניקוי מכיוון שאחרת, הנוגדנים עלולים שלא להיקשר באופן שווה וחלק לדפנות של כל באר. כדי למנוע את אפקט הוו, ריכוז חלבון הציפוי לא חייב להיות יותר מ -20 מיקרוגרם / מ"ל, מכיוון שריכוזים מעל רמה זו ירוו את רוב האתרים הזמינים על לוח המיקרוטייטר. טווח הריכוז האופייני של תמיסות ציפוי חלבון הוא 2-10 מיקרוגרם/מ"ל. עבור הניסוי הראשוני, השתמש נוגדן בקרה מדולל מסוג ISO IgG ארנב לציפוי במקום נוגדנים חד שבטיים ספציפיים נגד MPO. השתמש בעכבר נוגדן בקרה מסוג ISO מדולל IgG1 לציפוי במקום נוגדנים חד שבטיים ספציפיים נגד NE.
    2. מכסים את הצלחת בכיסוי פלסטיק דביק כדי למנוע אידוי של הדגימה, ודגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר קשירה של נוגדני הלכידה.
  2. יום 2
    1. השליכו את תמיסת הנוגדנים המדוללת מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר, וחזרו על הליך כביסה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    2. הסר עודפי PBS על ידי הקשה יבשה על הצלחת על מגבת נייר.
    3. חסום כל באר של צלחת ELISA עם 200 μL של מאגר החסימה.
    4. מכסים את הצלחת היטב בכיסוי פלסטיק דביק, ודגרים עליה במשך 1.5-2 שעות ב- RT כדי לחסום את הבארות.
    5. השליכו את תמיסת החסימה לחלוטין מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר, וחזרו על הליך שטיפה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    6. הסר עודפי PBS על ידי הקשה יבשה על הצלחת על מגבת נייר.
    7. החל סך של 25 μL של פלזמה או בינוני על כל באר למעט באר ריקה, ולהוסיף 75 μL של PBS כמו מדלל כדי להפוך את נפח הסופי 100 μL; הוסף 100 μL של PBS לבאר הריקה.
    8. לאחר מכן, ערבבו את הדגימות ב-RT במשך 10 שניות על ידי הנחת הצלחת על שייקר ב-250 סל"ד.
    9. יש למרוח 2 μL של DNase I מדולל פי 100 (0.03 מ"ג/מ"ל) על כל באר, כולל הבאר הריקה (ריכוז סופי של DNase I בתערובת התגובה: 0.6 מיקרוגרם/מ"ל).
    10. אטמו את הצלחת עם כיסוי פלסטיק דביק, וערבבו היטב את הדגימות ב-RT במשך 10 שניות על ידי הנחת הצלחת על שייקר ב-250 סל"ד.
      הערה: כדי להעריך את התנאים האופטימליים לעיכול DNA, בעת פיתוח הבדיקה, דגרנו על דגימות המכילות DNA הקשור ל- MPO מחולים עם COVID-19 עם 0-0.9 מיקרוגרם / מ"ל DNase I במשך 15 דקות ב- RT והשתמשנו בצלחות מצופות בנוגדן לכידה ספציפי עבור MPO או נוגדן בקרה מסוג ISO תואם מין.
    11. דגרו על הדגימות במשך 15 דקות ב- RT.
    12. הסר את כיסוי הפלסטיק הדביק, והחל 1 μL של 0.5 M EDTA על כל באר כדי לעצור את תגובת DNase.
    13. אטמו מחדש את הצלחת עם כיסוי פלסטיק דביק, ונערו אותה ב-RT למשך 15 שניות על ידי הנחתה על שייקר ב-250 סל"ד.
    14. לאחר מכן, דגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר לרכיבי החלבון של ה-NETs להיצמד לנוגדנים שנלכדו.
  3. יום 3
    1. הסירו את מכסה הפלסטיק הדביק, והשליכו את התמיסה מהבארות.
    2. השליכו את התמיסה לחלוטין מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת השטיפה לכל באר, וחזרו על הליך כביסה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    3. החל סך של 100 μL של נוגדן אנטי DNA מצומד peroxidase מצומד על כל באר.
    4. אטמו היטב את הצלחת עם כיסוי פלסטיק דביק, ודגרו עליה במשך שעה וחצי ב-RT.
    5. השליכו את התמיסה לחלוטין מהבארות, ולאחר מכן פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר, וחזרו על הליך כביסה זה שלוש עד ארבע פעמים.
    6. הסר בזהירות את התמיסה השיורית.
    7. יש למרוח על כל באר סך של 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע ABTS, ולכסות את הצלחת בכיסוי פלסטיק דביק.
    8. דוגרים על הצלחת בחושך ב-RT למשך 20-30 דקות על שייקר ב-250 סל"ד.
      הערה: נטר את הצלחת במרווחים של 5 דקות עד לקבלת קריאות OD רצויות.
    9. הוסף סך של 50 μL של 2 M חומצה גופרתית כדי לעצור את התגובה.
    10. מערבבים את התוכן הנוזלי של הבארות על ידי הקשה בזהירות על הצד של הצלחת.
    11. הפעל את קורא המיקרו-לוחות וחבר אותו למחשב.
    12. פתח את יישום התוכנה במחשב.
    13. בשורת המצב, צור ניסוי חדש ותן לו שם.
    14. הגדר את כל הפרמטרים הבאים לקריאת לוחות: סוג קריאה, ספיגה; מצב קריאה, נקודת קצה; אורכי גל, 2; Lm-1, 405 ננומטר; Lm-2, 490 ננומטר; ערבוב אוטומטי וריקון לפני, כבוי; צלחת קריאה מראש, כבוי; כיול אוטומטי, מופעל; רצועות, לקרוא צלחת שלמה; עדיפות אורך גל עמודה, עדיפות עמודה; מהירות הכרכרה, רגילה; וקריאה אוטומטית, כבוי.
    15. לאחר מכן, הכניסו את צלחת 96 הבאר המכילה את הדגימות למגירה וסגרו אותה.
    16. לבסוף, בחר בלחצן קרא כך שהלוח ייקרא מיד.
    17. קרא את הבליעה של כל באר באורך גל של 405 ננומטר באמצעות קורא microplate (בשלב זה, השתמש באורך גל של 490 ננומטר כהפניה).
    18. בצע חיסור אוטומטי של ערך הספיגה של מדיום הבדיקה בלבד מכל הדגימות הלא ידועות, ושמור את הנתונים.
      הערה: השתמש בעקומה סטנדרטית המתקבלת מהתקן NET בדילול סדרתי כדי לחשב את הריכוז היחסי של NET במדגם 1,14,15. כאן, התוצאות הסופיות מוצגות כ"קומפלקסים MPO או NE-DNA (% מסטנדרט NET)". גבול הגילוי (LOD) חושב מתוך סטיית התקן (SD) ושיפוע עקומת הכיול (S) באופן הבא: LOD = 3.3(SD/S).

4. סטטיסטיקה

  1. לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית מתאימה. כאן SigmaPlot v14.5 שימש. אחוזים ומשתנים רציפים מוצגים כחציון עם הטווח הבין-רבעוני עקב ההתפלגות המוטה של רוב הפרמטרים.
  2. השווה את רמות MPO-DNA ו- NE-DNA בפלזמה בין חולי COVID-19 לבקרות בריאות באמצעות מבחן סכום הדירוג של Wilcoxon. השתמש בניתוח מתאם כדי לחקור את הקשר בין צפיפות אופטית לבין אחוז תקן NET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו השתמשה בכריך ELISA עם נוגדנים חד-שבטיים אנטי-MPO, אנטי-NE ואנטי-דנ"א כדי למדוד דנ"א הקשור ל-MPO ול-NE (איור 1). בשיטה זו, הבארות של צלחת מיקרוטיטר צופו בנוגדן חד-שבטי ספציפי ל-MPO או NE ספציפי כדי ללכוד MPO הקשור ל-DNA ו-NE הקשור ל-DNA, כמו גם MPO ו-NE שאינם קשורים ל-DNA. כדי לחשב את מקדם השונות התוך-מבחני (CV), בוצעו מדידות כפולות בתוך אותה צלחת עבור 30 דגימות שנאספו מחולי COVID-19 וקבוצת ביקורת בריאה, וה-%CV חושב כממוצע של המדידות הכפולות; כדי לחשב את קורות החיים בין הבדיקות (כלומר, עקביות צלחת לצלחת), שני סוגים של דגימות מחולים עם COVID-19 ובקרות בריאות נמדדו בריבוע על 10 לוחות שונים; כדי להדגים את הספציפיות של בדיקה זו, ריכוזים שונים של מתחמי MPO-DNA ו- NE-DNA נבדקו באמצעות לוחות המצופים בנוגדני בקרה מסוג ISO במקום נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים נגד MPO ו- NE; וכדי לחשב את הרגישות והליניאריות של הבדיקה, נבדק תקן NET בדילול סדרתי שנעשה על ידי גירוי נויטרופילים אנושיים מבודדים עם PMA ועיכול DNase קל, וחושב מקדם המתאם וגבול הגילוי (LOD).

עקומות הכיול של MPO-DNA ו-NE-DNA שנלקחו מהתקן NET בדילול סדרתי מוצגות באיור 2. עקומות סטנדרטיות אמינות עבור MPO-DNA ו- NE-DNA (R2 = 0.958 ו- 0.963, בהתאמה) מתקבלות כאשר ערכי הספיגה אינם עולים על ריכוזים של 0.93 ו- 0.90, בהתאמה. ערכי LOD שחושבו מה-SD ומשיפוע עקומת הכיול היו 0.132% ו-0.126% עבור MPO-DNA ו-NE-DNA (%NET standard), בהתאמה.

ה-OD הגבוה ביותר התקבל כאשר 0.6 מיקרוגרם/מ"ל DNase I הוחל (איור 3). לכן, עיכול הדנ"א הוגבל להוספת תערובת תגובה של 0.6 מיקרוגרם/מ"ל של DNase I למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר הלוחות צופו בנוגדן בקרה מסוג ISO במקום בנוגדן החד-שבטי הספציפי כנגד MPO, התגלו ערכי OD נמוכים מאוד (<0.09 יחידות ספיגה [AU]) בריכוזים שונים של DNase I.

כדי לחשב את מקדם השונות (CV) עבור MPO-DNA ו- NE-DNA, בוצעו מדידות כפולות ב -30 דגימות מחולים עם COVID-19 ובקרות בריאות באותה צלחת; %CV חושב באמצעות הממוצע הכפול. קורות החיים של MPO-DNA ו-NE-DNA היו 1.871 ו-0.987, בהתאמה, בבקרות בריאות, ו-2.532 ו-2.010, בהתאמה, בחולי COVID-19 (טבלה 1). ממוצע קורות החיים של MPO-DNA ו-NE-DNA היה 2.202 ±-0.467 ו-1.497 ±-0.723, בהתאמה (ממוצע ± SD) (טבלה 1).

כדי לחשב את קורות החיים בין הבדיקות עבור MPO-DNA ו- NE-DNA, שני סוגים של דגימות שנאספו מחולים עם COVID-19 ובקרות בריאות נמדדו בריבוע על 10 לוחות שונים כדי לפקח על עקביות צלחת לצלחת. ממוצע קורות החיים של MPO-DNA ו-NE-DNA היה 6.524 ±-2.672 ו-4.389 ±-0.923, בהתאמה (ממוצע ± SD) (טבלה 2).

כדי להעריך את הספציפיות של נוגדני הלכידה לקומפלקסים MPO-DNA ו-NE-DNA, בחנו ריכוזים שונים של קומפלקסים MPO-DNA ו-NE-DNA באמצעות לוחות המצופים בנוגדני בקרה מסוג ISO במקום נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים כנגד MPO ו-NE. טבלה 3 מראה כי נוגדני הבקרה מסוג ISO הגיבו מעט עם קומפלקסים MPO-DNA ו-NE-DNA בריכוזים השונים (0.035 AU עד 0.078 AU ו-0.007 AU עד 0.096 AU, בהתאמה).

רמות MPO-DNA ו-NE-DNA בסופרנאטנט של נויטרופילים מעוכלים PMA מעוכלים הוגדרו כ-100% תקן NET, ונתוני דגימת הפלזמה בוטאו כ-%NET-standard. רמות MPO-DNA (X NET-STANDARD) היו גבוהות משמעותית בפלזמה מחולי COVID-19 (n = 16; 29.1% [IQR, 25.8, 41.5]) מאשר בפלזמה מקבוצת ביקורת בריאה (n = 10; 13.4% [IQR, 12.4, 14.8]), וכך גם רמות NE-DNA (%NET-standard) (46.4% [IQR, 32.7, 53.7] לעומת 12.1% [IQR, 9.9, 14.7], בהתאמה, P < 0.01; איור 4).

Figure 1
איור 1: שלבים בסיסיים של שיטת בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' למדידת myeloperoxidase-DNA או אלסטאז-דנ"א נויטרופילים בדגימות. (A) הבארות מצופות בנוגדן אנטי-מיאלופרוקסידאז (MPO) או אנטי-נויטרופיל אלסטאז (NE). (B) אתרי קשירת החלבונים הנותרים חסומים על-ידי חומרים חוסמים. (C) דגימות המכילות דנ"א מצומד NE ו-MPO מצומד. (D) מתבצע עיכול DNase מוגבל, והדגימה מודגרת בבארות כדי להיקשר עם נוגדן הלכידה. (E) מוסיפים נוגדן אנטי-דנ"א משני המסומן בפרוקסידז. (F) נוגדן אנטי-דנ"א משני לא מאוגד המסומן בפרוקסידז מוסר. (G) מוסיפים את המצע 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ומפקחים על התפתחות הצבע. קיצורים: ABTS = 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); MPO = myeloperoxidase; NE = אלסטאז נויטרופילים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ליניאריות היחסים בין ערכי העוצמה לבין הדילולים השונים של תקן מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים. הסופרנאטנט של נויטרופילים מעוכלים ב-DNase 12-myristate 13-אצטט מגורה דולל סדרתית, ורמות ה-myeloperoxidase-DNA ו-neutrophil elastase-DNA נבדקו כדי ליצור עקומת כיול. יחידות הספיגה (AU) שהתקבלו מהתקן למלכודת נויטרופילים חוץ-תאיות לא מדוללות (תקן NET) הוקצו כ-100%NET, והתוויית ערך העוצמה ב-405 ננומטר מול תקן %NET חשפה קשר ליניארי. קיצורים: MPO = myeloperoxidase; NE = אלסטאז נויטרופילים; NET = מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית: לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תגובת מינון של DNase I בעיכול דנ"א חוץ-תאי של מלכודת נויטרופילים. הדגימה הוכנסה לבארות מצופות מיאלופרוקסידאז. לאחר מכן נוסף DNase I (0 מיקרוגרם/מ"ל, 0.3 מיקרוגרם/מ"ל, 0.6 מיקרוגרם/מ"ל או 0.9 מיקרוגרם/מ"ל). לאחר 15 דקות של עיכול, פעילות האנזים הופסקה, והשלבים הנותרים של בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' בוצעו בהתאם. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. N = 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: רמות פלזמה של קומפלקסים של myeloperoxidase-DNA ו-neutrophil elastase-DNA בחולים עם COVID-19. הנתונים מבוטאים כאחוזים מתכולת המלכודת החוץ-תאית של נויטרופילים (תקן NET) ומוצגים כחציון וטווחים בין-רבעוניים. חולי COVID-19, n = 16; בקרות בריאות, n = 10. ** P < 0.01 לעומת קבוצת ביקורת בריאה. קיצורים: HC = בקרות בריאות; NET = מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מקדם שונות תוך מבחן. שלושים דגימות נמדדו בכפילות כדי לעקוב אחר מקדמי שונות בודדים, ובכך לקבוע את מקדם השונות תוך הבדיקה. קיצורים: AU = יחידות ספיגה; CV = מקדמי שונות לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: מקדם שונות בין מבחנים. הדגימות נמדדו בריבוע על 10 לוחות שונים כדי לעקוב אחר השונות מצלחת לצלחת, ובכך לקבוע את מקדם השונות הבין-מבחן. קיצורים: AU = יחידות ספיגה; CV = מקדם ההשתנות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: בדיקת ספציפיות ללכידת נוגדנים. הלוחות צופו בנוגדני בקרה מסוג ISO עבור anti-myeloperoxidase (MPO) ואלסטאז אנטי-נויטרופילים (NE) כדי להעריך את הספציפיות של נוגדני הלכידה עבור מתחמי MPO-DNA ו- NE-DNA. קיצורים: AU = יחידות ספיגה; MPO = myeloperoxidase; NE = אלסטאז נויטרופילים אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיארנו שיטת סנדוויץ' ELISA שבה MPO או NE נקשרים לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. לאחר השטיפה, "הכריך" הושלם על ידי דגירה של הדגימות עם נוגדן חד שבטי הקשור לפרוקסידז נגד DNA. לאחר הסרת נוגדן משני לא קשור, מצומד הפרוקסידז הכבול מזוהה על ידי תוספת של מצע כרומוגני ABTS peroxidase, אשר מניב תוצר סופי מסיס שניתן לקרוא ספקטרופוטומטרית ב 405 ננומטר. הליניאריות הטובה והדיוק הגבוה בין הבדיקות והתוך בדיקות מצביעים על כך שבדיקת ELISA המתוארת במאמר זה ובאחרים 1,2 היא אמינה ואפשרית ליישום קליני. יתר על כן, כאשר הסופרנאטנט של נויטרופילים המטופלים ב-PMA המטופלים ב-DNase מוקצה כאות מקסימלי עבור תקן NET, בדיקת ELISA זו יכולה לשמש כשיטה כמותית למחצה 1,14,15.

חוטי הכרומטין הארוכים של NETs מעוטרים בחלבוני MPO ו- NE. כדי להגביר את הקישור בין נוגדן הלכידה לבין מתחמי MPO-DNA או NE-DNA, החוטים נחתכים לחתיכות קצרות יותר על ידי עיכול DNA מוגבל עם האנזים DNase; תוספת של ריכוז DNase גבוה מדי עלולה להוביל לעיכול יתר של הדנ"א ובכך לירידה בספיגה. תוצאות ניסוי ראשוני (ראו איור 3) הראו כי יש צורך בכמות מתאימה של תוספת DNase כדי לשחרר את השאריות שמקורן ב-NETs. הניסויים שהשתמשו בנוגדני בקרה מסוג ISO במקום בנוגדני לכידה ספציפיים הראו כי נוגדני הלכידה ששימשו בבדיקה זו היו ספציפיים עבור קומפלקסים של MPO-DNA ו- NE-DNA.

השלב המוקדם של היווצרות NET מאופיין בכרומטין מעובה ושימור עוצמת קרום הפלזמה 9,16,17. נויטרופילים בעלי גרעין מעובה זוהו כנויטרופילים שעוברים היווצרות נטו וניתן לכמת אותם באמצעות ציטומטריית זרימה10. למרות שציטומטריית זרימה יכולה לנתח מספר רב של תמונות מתאים בזמן קצר, לא ניתן להשתמש בה כדי להעריך את השלבים המאוחרים יותר של היווצרות NET לאחר קרע בקרום התא והאקסטרוזיה של כרומטין. היסטונים ציטרוליניים H3, הידועים כסמנים ספציפיים ל-NET, ניתנים לזיהוי על ידי כתמים מערביים18 ו-ELISA19; עם זאת, שיטות אלה ספציפיות רק ליצירת NET הקשור ל- PAD4 ולא ניתן להשתמש בהן כדי להעריך NETs20 שאינם תלויים ב- PAD4.

הממצא כי רמות שאריות נטו בסרום היו גבוהות יותר בחולים עם COVID-19 מאשר בקבוצת ביקורת בריאה תואם את הדיווחים הקודמים21,22. ממצא זה מצביע על כך שהפעלת נויטרופילים, כולל היווצרות NET, עשויה לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של COVID-19.

לבדיקה זו יש מגבלה. דיווחים אחרונים הראו כי גנים הקשורים למערכת החיסון, כולל MPO ו- ELANE, המקודדים MPO ו- NE, בהתאמה, מתבטאים מאוד בתנאים דלקתיים בלתי מבוקרים23 ונמצאים בקורלציה חיובית עם חומרת המחלה ותמותה24. מכיוון ש-MPO ו-NE מעורבים ביצירת NETs ללא תלות בפעילויות אנזימטיות אלה15, רמות חלבון מוגברות של NE ו-MPO בנויטרופילים עשויות להשפיע על תוצאות בדיקה זו.

אנו מסיקים כי שיטת סנדוויץ' ELISA זו מודדת ישירות DNA חוץ תאי עם חלבוני גרגיר, כולל NE ו- MPO, שהם ספציפיים ליצירת NET. בדיקת זיהוי זו היא שיטה אמינה, רגישה ביותר ושימושית לחקירת המאפיינים של NETs בדגימות אנושיות ובתרביות-על.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל הנתונים שנוצרו ו / או נותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר זה שפורסם. המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר הוק מוחמד אמינול על סיועו בעיון בכתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 195
כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter