Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifiering av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex från neutrofila extracellulära fällor med hjälp av en modifierad sandwich-ELISA

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Vi presenterar ett protokoll för en modifierad sandwichenzymkopplad immunadsorberande analysteknik för att kvantitativt mäta två komponenter av neutrofila extracellulära fällrester, myeloperoxidaskonjugerat DNA och neutrofilelastaskonjugerade DNA-komplex, härledda från aktiverade neutrofiler.

Abstract

Vissa stimuli, såsom mikroorganismer, får neutrofiler att frigöra neutrofila extracellulära fällor (NET), som i grunden är nätliknande strukturer som består av DNA med granulära proteiner, såsom myeloperoxidas (MPO) och neutrofila elastas (NE), och cytoplasmatiska och cytoskelettala proteiner. Även om intresset för NET har ökat på senare tid finns det ingen känslig och tillförlitlig analysmetod för att mäta NET i kliniska miljöer. Denna artikel beskriver en modifierad sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys för att kvantitativt mäta två komponenter av cirkulerande NET, MPO-DNA och NE-DNA-komplex, som är specifika komponenter i NET och släpps ut i det extracellulära utrymmet som nedbrytningsprodukter av NET. Analysen använder specifika monoklonala antikroppar för MPO eller NE som infångningsantikroppar och en DNA-specifik detektionsantikropp. MPO eller NE binder till ett ställe för infångningsantikroppen under den första inkubationen av prover som innehåller MPO-DNA eller NE-DNA-komplex. Denna analys visar god linjäritet och hög precision mellan och inom analysen. Vi använde det på 16 patienter med covid-19 med åtföljande akut andnödssyndrom och fann att plasmakoncentrationerna av MPO-DNA och NE-DNA var signifikant högre än i plasma från friska kontroller. Denna detektionsanalys är en tillförlitlig, mycket känslig och användbar metod för att undersöka egenskaperna hos NET i humanplasma och odlingssupernatanter.

Introduction

Denna artikel beskriver en metod för att kvantifiera neutrofil extracellulär fällbildning (NET) i biologiska vätskor genom att använda sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) för att detektera komplex av myeloperoxidas (MPO) och neutrofil elastas (NE) med DNA 1,2. NET består av en DNA-ryggrad dekorerad med antimikrobiella proteaser som härrör från neutrofilgranulat 3,4. Både MPO-DNA- och NE-DNA-komplex är viktiga och specifika komponenter i NET och släpps ut i det extracellulära rummet som nedbrytningsprodukter av NET 3,4.

Förutom sin viktiga fysiologiska roll i det antimikrobiella försvaret3 har NET också olika patologiska effekter4,5, inklusive främjande av trombogenes6 och försämring av sepsis7. Följaktligen har NET fått uppmärksamhet nyligen. Icke desto mindre har in vivo-kvantifieringen av NET visat sig vara utmanande på grund av bristen på en känslig, tillförlitlig kvantitativ analysmetod.

Ett fåtal metoder finns tillgängliga, inklusive direkt mätning av NET med fluorescensmikroskopi8,9 och flödescytometri 10 och indirekt mätning av cirkulerande cellfritt DNA, nukleosomer och citrullinerad histon H3, men varje metod har sina egna fördelar och begränsningar11. Även om den immunofluorescensmikroskopiska metoden är specifik för NET och tydligt visar lokalisering och grad av NET-bildning, är proverna begränsade till biopsivävnad och utsöndrade material. Dessutom behöver denna metod utföras av skickliga forskare och kräver lång tid för att resultat ska erhållas. Att mäta cirkulerande nivåer av NET-relaterade komponenter med flödescytometri är enkelt och ger snabba resultat. Metoden är dock inte specifik för NET12.

Vi13 och andra1,2 har utvecklat en mycket känslig och tillförlitlig analys för att mäta de cirkulerande NET-komponenterna, MPO-konjugerat eller NE-konjugerat DNA, i human plasma med en modifierad ELISA-teknik som använder specifika antikroppar för MPO eller NE som infångningsantikroppar och en DNA-specifik detektionsantikropp. Denna analys kan också användas ex vivo för att identifiera NET-komponenter i cellodlingssupernatanter som frisätts av aktiverade neutrofiler som svar på phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje deltagare.

1. Beredning av reagens

OBS: För att utföra sandwich ELISA-analysen bereds reagenserna enligt beskrivningen nedan.

  1. Buffert för beläggning:
    1. För att göra en 0,1 mol/l karbonat-bikarbonatbuffert, väg 10,6 g vattenfritt natriumkarbonat (molekylvikt, 106 g/mol) och 8,4 g natriumbikarbonat (molekylvikt, 84 g/mol).
    2. Tillsätt det till cirka 900 ml destillerat vatten i en bägare.
    3. Justera buffertens pH till 9,6 genom att tillsätta erforderlig mängd utspädd saltsyra eller natriumhydroxid.
    4. Kontrollera pH-värdet med en pH-mätare.
    5. Tillsätt sedan den erforderliga volymen destillerat vatten för att uppnå en total volym på 1 000 ml.
    6. Förvara denna 0,1 mol/L karbonat-bikarbonatbuffert i kylskåp vid 4 °C.
  2. Blockerande buffert:
    1. Tillsätt ca 250 μl 20 % natriumazid och 1 g bovint serumalbumin (BSA) till 70 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) bestående av 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L KCl och 1,47 mol/L KH2PO 4 (pH7,4) och blanda försiktigt.
    2. Tillsätt destillerat vatten för att uppnå en total volym på 100 ml. De slutliga koncentrationerna av bovint serumalbumin och natriumazid är 1 % respektive 0,05 %. Vänta i 10 minuter och sedan är lösningen klar att användas.
  3. Tvättlösning: Bered 0,5 % t-oktylfenoxipolyetoxietanol, polyetylenglykoltert-oktylfenyleter (Triton X-100) i destillerat vatten.
    1. Späd 100 % Triton X-100 till 10 % med destillerat vatten och låt 10 %-lösningen stå i 1 dag före användning.
    2. Späd sedan om 10 % Triton X-100-lösningen 20 gånger med destillerat vatten för att uppnå en koncentration på 0,5 %.
  4. Utspädning av antikroppar:
    1. Späd infångningsantikroppen (anti-MPO-antikropp [1 mg/ml] eller anti-NE-antikropp [1 mg/ml]) till 1:2 000 i beläggningsbufferten (pH 9,6) före användning på dag 1 av analysen (se nedan) och detektionsantikroppen (peroxidaskonjugerad anti-DNA-antikropp) till 1:40 med PBS före användning på dag 3 av analysen (se nedan).
      Anm.: För det preliminära experimentet, späd antikropparna av iso-typ (IgG-kanin [5 mg/ml] och IgG1-musklon Ci4 [0,5 mg/ml]) till 1:10 000 och 1:1 000 i beläggningsbufferten (pH 9,6).
  5. ABTS-substratlösning: Beroende på antalet prover, lös upp en, två eller tre 2,2'-azino-bis(3 etylbensotiazolin-6-sulfonsyra (ABTS) tabletter i 5 ml, 10 ml eller 15 ml ABTS-buffert (innehållande natriumperborat, citronsyra och dinatriumvätefosfat); 100 μl behövs per prov. Förvara den beredda lösningen vid 2-8 °C skyddad från ljus. Lösningen är stabil i upp till 3 månader.

2. Provtagning och förvaring

  1. Plasmaisolering:
    1. Samla in 4 ml perifera blodprover i ett litiumheparinbloduppsamlingsrör genom venpunktion med en 22 G spruta och centrifugera vid 1 600 x g i 10 minuter vid 4 °C.
    2. Överför supernatanten till ett 2 ml safe-lock provrör.
    3. Centrifugera supernatanten på nytt vid 16 000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna eventuella cellrester.
    4. Samla supernatanten i ett nytt safe-lock sample rör utan att störa pelleten i botten av röret.
    5. Förvara den erhållna plasman vid −80 °C tills den används vidare.
      OBS: För att få resultat med hög genomströmning med denna analys krävs samples av god kvalitet. Om plasmaprover används, utför en andra centrifugering för att avlägsna eventuella kvarvarande celler. Undvik upprepad upptining av proverna. Använd heparin som antikoagulantia eftersom EDTA påverkar DNase-aktiviteten.
  2. Isolering av polymorfonukleära neutrofiler
    1. Samla de perifera blodproverna i ett litiumheparinbloduppsamlingsrör genom venpunktion med en 22 G spruta.
    2. Skikta 6 ml blod på 6 ml enstegspolymorfer och centrifugera rören vid 1 000 x g i 45 minuter vid rumstemperatur (RT).
    3. Skörda det tredje buffyskiktet som innehåller neutrofiler och tvätta det tre gånger i fenolröd RPMI-1640 vid 400 x g i 10 minuter vid RT.
    4. Återsuspendera neutrofilerna i fenolrödfri RPMI-1640 innehållande 2 mM L-glutamin kompletterat med 6 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum och räkna cellerna i mikroskopfältet med en hemocytometer.
      OBS: Denna metod ger 96 % till 98 % renhet med mer än 95 % viabilitet, bedömd genom uteslutning av trypanblått färgämne.
  3. Aktivering av polymorfonukleära neutrofiler och NETos in vitro
    1. Späd nyisolerade polymorfonukleära neutrofiler till 1 × 105 celler/ml i fenolrödfri RPMI-1640 innehållande 2 mM L-glutamin kompletterat med 6 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum, och frö dem i 35 mm odlingsskålar.
    2. För att inducera NETs, stimulera polymorfonukleära neutrofiler med 25 nM PMA i 4 timmar vid 37 °C i 5 % CO2/95 % luft.
    3. Efter 4 timmars inkubation bryts NET-värdena delvis genom att 0,6 μg/ml DNas I tillsätts direkt till odlingsskålarna under 15 minuter vid RT och DNas I-aktiviteten stoppas genom tillsats av 5 mM EDTA.
    4. Samla upp mediet som innehåller de syntetiserade NET-ämnena och centrifugera vid 400 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna cellresterna.
    5. Hämta supernatanterna från fyra friska kontroller, blanda och förvara vid −80 °C fram till användning.
      OBS: DNasnedsmälta PMA-stimulerade neutrofiler erhållna från fyra friska kontroller används som NET-standard 1,14,15. Generera en kalibreringskurva från en serieutspädd NET-standard med PBS och tilldela de optiska densitetsvärdena (OD) som erhålls från en outspädd NET-standard som 100 % NET.

3. Analysmetod

OBS: Stegen för att utföra analysen beskrivs i detalj nedan.

  1. Dag 1
    1. Applicera totalt 100 μl utspädd anti-MPO- eller anti-NE-antikropp innehållande 0,05 μg antikroppar på varje brunn på plattan, inklusive blindbrunnen.
      OBS: Beläggningsbufferten får inte innehålla någon form av rengöringsmedel eftersom antikropparna annars kanske inte binder lika och smidigt till väggarna i varje brunn. För att förhindra krokeffekten får beläggningsproteinkoncentrationen inte vara mer än 20 μg/ml, eftersom koncentrationer över den nivån kommer att mätta de flesta av de tillgängliga ställena på mikrotiterplattan. Det typiska koncentrationsintervallet för proteinbeläggningslösningar är 2-10 μg/ml. För det preliminära experimentet, använd utspädd iso-typkontrollantikropp IgG-kanin för beläggning istället för specifika monoklonala antikroppar mot MPO. Använd utspädd iso-typkontrollantikropp IgG1-mus för beläggning i stället för specifika monoklonala antikroppar mot NE.
    2. Täck plattan med ett självhäftande plasthölje för att förhindra avdunstning av provet och inkubera över natten vid 4 °C så att infångningsantikropparna kan bindas.
  2. Dag 2
    1. Kassera den utspädda antikroppslösningen från brunnarna och pipettera sedan över 300 μl tvättlösning per brunn och upprepa denna tvättprocedur tre till fyra gånger.
    2. Ta bort överflödig PBS genom att knacka plattan torr på en pappershandduk.
    3. Blockera varje brunn på ELISA-plattan med 200 μL av blockeringsbufferten.
    4. Täck plattan tätt med ett självhäftande plastlock och inkubera den i 1.5-2 timmar vid RT för att blockera brunnarna.
    5. Kassera den blockerande lösningen helt från brunnarna och pipettera sedan 300 μL tvättlösning per brunn och upprepa denna tvättprocedur tre till fyra gånger.
    6. Ta bort överflödig PBS genom att knacka plattan torr på en pappershandduk.
    7. Applicera totalt 25 μl plasma eller medium i varje brunn utom blindbrunnen och tillsätt 75 μL PBS som spädningsmedel för att göra den slutliga volymen till 100 μL. Tillsätt 100 μl PBS till blindbrunnen.
    8. Blanda sedan proverna vid RT i 10 s genom att placera plattan på en shaker vid 250 rpm.
    9. Applicera 2 μl 100-faldigt utspätt DNas I (0,03 mg/ml) på varje brunn, inklusive blindbrunnen (slutlig koncentration av DNas I i reaktionsblandningen: 0,6 μg/ml).
    10. Försegla plattan med ett självhäftande plastlock och blanda proverna noggrant vid RT i 10 s genom att placera plattan på en shaker vid 250 rpm.
      OBS: För att bedöma de optimala förhållandena för DNA-nedbrytning, när vi utvecklade analysen, inkuberade vi prover innehållande MPO-associerat DNA från patienter med COVID-19 med 0-0,9 μg/ml DNas I i 15 minuter vid RT och använde plattor belagda med specifik infångningsantikropp för MPO eller en artmatchad iso-typkontrollantikropp.
    11. Inkubera proverna i 15 minuter vid RT.
    12. Ta bort det självhäftande plasthöljet och applicera 1 μL 0.5 M EDTA på varje brunn för att stoppa DNase-reaktionen.
    13. Återförslut plattan med ett självhäftande plastlock och skaka den vid RT i 15 s genom att placera den på en shaker vid 250 rpm.
    14. Inkubera sedan plattan över natten vid 4 °C så att proteinkomponenterna i NET kan fästa vid infångningsantikropparna.
  3. Dag 3
    1. Ta bort det självhäftande plasthöljet och kassera lösningen från brunnarna.
    2. Kassera lösningen helt från brunnarna och pipettera sedan 300 μL av tvättlösningen per brunn och upprepa denna tvättprocedur tre till fyra gånger.
    3. Applicera totalt 100 μl av den utspädda peroxidaskonjugerade anti-DNA-detektionsantikroppen i varje brunn.
    4. Försegla plattan tätt med ett självhäftande plastlock och inkubera den i 1.5 h vid RT.
    5. Kassera lösningen helt från brunnarna och pipettera sedan 300 μL tvättlösning per brunn och upprepa denna tvättprocedur tre till fyra gånger.
    6. Ta försiktigt bort den kvarvarande lösningen.
    7. Applicera totalt 100 μL ABTS-substratlösning på varje brunn och täck plattan med ett självhäftande plastlock.
    8. Inkubera plattan i mörker vid RT i 20-30 min på en shaker vid 250 rpm.
      OBS: Övervaka plattan med 5 minuters intervall tills önskade OD-avläsningar erhålls.
    9. Tillsätt totalt 50 μL 2 M svavelsyra för att stoppa reaktionen.
    10. Blanda det flytande innehållet i brunnarna genom att försiktigt knacka på sidan av tallriken.
    11. Slå på mikroplattläsaren och anslut den till datorn.
    12. Öppna programmet på datorn.
    13. Skapa ett nytt experiment i statusfältet och namnge det.
    14. Ställ in alla följande parametrar för plattavläsning: Lästyp, absorbans; Läsläge, slutpunkt; Våglängder, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisk blandning och blankning före, av; Förläst plåt, Av; Automatisk kalibrering, På; Remsor, Läs hela plattan; Kolumnens våglängdsprioritet, Kolumnprioritet; Vagnshastighet, normal; och Automatisk läsning, Av.
    15. Lägg sedan 96-brunnsplattan som innehåller proverna i lådan och stäng den.
    16. Slutligen väljer du knappen Läs så att plattan läses omedelbart.
    17. Läs absorbansen för varje brunn vid en våglängd på 405 nm med hjälp av en mikroplattläsare (i detta skede, använd en våglängd på 490 nm som referens).
    18. Utför automatisk subtraktion av enbart analysmediets absorbansvärde från alla okända prover och spara data.
      Anm.: Använd en standardkurva erhållen från serieutspädd NET-standard för att beräkna den relativa koncentrationen av NET i provet 1,14,15. Här presenteras de slutliga resultaten som "MPO- eller NE-DNA-komplex (% av NET-standard)." Detektionsgränsen (LOD) beräknades utifrån standardavvikelsen (SD) och lutningen på kalibreringskurvan (S) enligt följande: LOD = 3,3(SD/S).

4. Statistik

  1. Utför alla statistiska analyser med hjälp av lämplig programvara för statistisk analys. Här användes SigmaPlot v14.5. Procentsatser och kontinuerliga variabler visas som medianen med kvartilintervallet på grund av den skeva fördelningen av de flesta parametrarna.
  2. Jämför plasma-MPO-DNA- och NE-DNA-nivåerna mellan COVID-19-patienter och friska kontroller med hjälp av Wilcoxon-rangsummatestet. Använd korrelationsanalys för att undersöka sambandet mellan optisk densitet och procentandelen NET-standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna metod använde en sandwich-ELISA med monoklonala anti-MPO-, anti-NE- och anti-DNA-antikroppar för att mäta MPO-associerat och NE-associerat DNA (Figur 1). I denna metod belades brunnarna i en mikrotiterplatta med en MPO-specifik eller NE-specifik monoklonal antikropp för att fånga DNA-associerad MPO och DNA-associerad NE, såväl som icke-DNA-associerad MPO och NE. För att beräkna intraanalyskoefficienten för variabilitet (CV) utfördes dubbla mätningar inom samma platta för 30 samples som samlats in från patienter med COVID-19 och friska kontroller, och %CV beräknades som medelvärdet av de dubbla mätningarna; för att beräkna inter-assay CV (dvs. konsistensen mellan plattor och plattor) mättes två typer av prover från patienter med covid-19 och friska kontroller i fyrsikater på 10 olika plattor; För att påvisa specificiteten hos denna analys analyserades olika koncentrationer av MPO-DNA- och NE-DNA-komplex med hjälp av plattor belagda med kontrollantikroppar av iso-typ i stället för specifika monoklonala antikroppar mot MPO och NE. och för att beräkna analysens känslighet och linjäritet analyserades en seriespäd NET-standard framställd genom att stimulera isolerade humana neutrofiler med PMA och mild DNas-nedbrytning, och korrelationskoefficienten och detektionsgränsen (LOD) beräknades.

Kalibreringskurvorna för MPO-DNA och NE-DNA från en serieutspädd NET-standard visas i figur 2. Tillförlitliga standardkurvor för MPO-DNA och NE-DNA (R2 = 0,958 respektive 0,963) erhålls när absorbansvärdena inte överstiger koncentrationer på 0,93 respektive 0,90. LOD-värdena beräknade från SD och lutningen på kalibreringskurvan var 0,132 % och 0,126 % för MPO-DNA respektive NE-DNA (%NET-standard).

Den högsta OD erhölls när 0,6 μg/ml DNas I applicerades (figur 3). Därför begränsades DNA-uppslutningen till att tillsätta en 0,6 μg/ml reaktionsblandning av DNas I under 15 minuter vid rumstemperatur. När plattorna belades med kontrollantikroppen iso-typ istället för den specifika monoklonala antikroppen mot MPO detekterades mycket låga OD-värden (<0,09 absorbansenheter [AU]) vid olika koncentrationer av DNas I.

För att beräkna intraanalyskoefficienten för variabilitet (CV) för MPO-DNA och NE-DNA utfördes dubbla mätningar i 30 prover från patienter med COVID-19 och friska kontroller på samma platta; %CV beräknades med hjälp av det duplicerade medelvärdet. CV inom analysen för MPO-DNA och NE-DNA var 1,871 respektive 0,987 hos friska kontroller och 2,532 respektive 2,010 hos covid-19-patienter (tabell 1). Medelvärdet för intraanalys-CV för MPO-DNA och NE-DNA var 2,202 ± 0,467 respektive 1,497 ± 0,723 (medelvärde ± SD) (tabell 1).

För att beräkna CV mellan analyser för MPO-DNA och NE-DNA mättes två typer av prover som samlats in från patienter med COVID-19 och friska kontroller i fyrsikater på 10 olika plattor för att övervaka konsistensen mellan plattorna. Medelvärdet för CV mellan analyser av MPO-DNA och NE-DNA var 6,524 ± 2,672 respektive 4,389 ± 0,923 (medelvärde ± SD) (tabell 2).

För att utvärdera specificiteten hos infångningsantikropparna mot MPO-DNA- och NE-DNA-komplex analyserade vi olika koncentrationer av MPO-DNA- och NE-DNA-komplex genom att använda plattor belagda med kontrollantikroppar av iso-typ istället för specifika monoklonala antikroppar mot MPO och NE. Tabell 3 visar att kontrollantikropparna av iso-typ reagerade lite med MPO-DNA- och NE-DNA-komplexen vid de olika koncentrationerna (0,035 AU till 0,078 AU och −0,007 AU till 0,096 AU, respektive).

Nivåerna av MPO-DNA och NE-DNA i supernatanten av DNas-nedsmälta PMA-stimulerade neutrofiler definierades som 100 % NET-standard, och plasmaprovdata uttrycktes som %NET-standard. Nivåerna av MPO-DNA (%NET-standard) var signifikant högre i plasma från patienter med covid-19 (n = 16; 29,1 % [IQR, 25,8, 41,5]) än i plasma från friska kontroller (n = 10; 13,4 % [IQR, 12,4, 14,8]), liksom nivåerna av NE-DNA (%NET-standard) (46,4 % [IQR, 32,7, 53,7] jämfört med 12,1 % [IQR, 9,9, 14,7], P < 0,01; Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Grundläggande stadier av en sandwichenzymkopplad immunadsorberande analysmetod för mätning av myeloperoxidas-DNA eller neutrofilt elastas-DNA i prover. (A) Brunnarna är belagda med antikroppar som fångar upp antikroppar av anti-myeloperoxidas (MPO) eller anti-neutrofila elastaser (NE). (B) De återstående proteinbindningsställena blockeras av blockerande medel. C) Prover som innehåller NE-konjugerat och MPO-konjugerat DNA läggs till. D) Begränsad DNas-uppslutning utförs och provet inkuberas i brunnarna för att binda till infångningsantikroppen. (E) En sekundär peroxidasmärkt anti-DNA-antikropp tillsätts. F) Obundna sekundära peroxidasmärkta anti-DNA-antikroppar avlägsnas. (G) Substratet 2,2'-azino-bis(3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra) tillsätts och färgutvecklingen övervakas. Förkortningar: ABTS = 2,2'-azino-bis(3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra); MPO = myeloperoxidas, NE = neutrofil elastas Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Linjäriteten i sambanden mellan intensitetsvärdena och de olika utspädningarna av standarden för neutrofila extracellulära fällor. Supernatanten av DNas-nedsmälta forbol-12-myristat-13-acetatstimulerade neutrofiler späddes ut seriellt och nivåerna av myeloperoxidas-DNA och neutrofil-elastas-DNA analyserades för att generera en kalibreringskurva. Absorbansenheterna (AU) som erhölls från den outspädda neutrofila extracellulära fällstandarden (NET-standarden) tilldelades som 100 % NET, och plottning av intensitetsvärdet vid 405 nm mot %NET-standarden avslöjade ett linjärt samband. Förkortningar: MPO = myeloperoxidas; NE = neutrofil elastas; NET = neutrofil extracellulär fälla Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Dos-respons för DNas I vid neutrofil extracellulär fälla-DNA-nedbrytning. Provet sattes in i myeloperoxidasbelagda brunnar. Därefter tillsattes DNas I (0 μg/ml, 0,3 μg/ml, 0,6 μg/ml eller 0,9 μg/ml). Efter 15 minuters matsmältning stoppades enzymaktiviteten och de återstående stegen i den sandwichenzymkopplade immunadsorberande analysen utfördes i enlighet med detta. Uppgifterna visas som medelvärdet ± SD. N = 12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Plasmanivåer av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex hos patienter med covid-19. Data uttrycks i procent av innehållet av neutrofila extracellulära fällor (NET-standard) och presenteras som medianer och interkvartilintervall. Patienter med covid-19, n = 16; Friska kontroller, n = 10. ** P < 0,01 jämfört med friska kontroller. Förkortningar: HC = friska kontroller; NET = neutrofil extracellulär fälla. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Variabelkoefficient inom analysen. Trettio prover mättes i duplikat för att övervaka individuella variabilitetskoefficienter och därmed bestämma variabilitetskoefficienten inom analysen. Förkortningar: AU = absorbansenheter; CV = variabilitetskoefficienter Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Variabelkoefficient mellan analyser. Proverna mättes i fyrsikatform på 10 olika plattor för att övervaka variation mellan plattor och därmed bestämma variationskoefficienten mellan analyserna. Förkortningar: AU = absorbansenheter; CV = variabelkoefficient. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Specificitetstest för avskiljningsantikroppar. Plattorna belades med iso-typkontrollantikroppar för anti-myeloperoxidas (MPO) och anti-neutrofil elastas (NE) för att utvärdera specificiteten hos infångningsantikropparna för MPO-DNA- och NE-DNA-komplexen. Förkortningar: AU = absorbansenheter; MPO = myeloperoxidas, NE = neutrofil elastas Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit en sandwich ELISA-metod där MPO eller NE binder till ett ställe av infångningsantikroppen under den initiala inkubationen av prover som innehåller MPO-DNA eller NE-DNA-komplex. Efter tvättning avslutas "sandwichen" genom att proverna inkuberas med en peroxidasassocierad monoklonal anti-DNA-antikropp. Efter avlägsnande av obundna sekundära antikroppar detekteras det bundna peroxidaskonjugatet genom tillsats av ett kromogent ABTS-peroxidassubstrat, vilket ger en löslig slutprodukt som kan avläsas spektrofotometriskt vid 405 nm. Den goda linjäriteten och den höga precisionen mellan och inom analyserna indikerar att ELISA-analysen som beskrivs i denna artikel och andra 1,2 är tillförlitlig och genomförbar för klinisk tillämpning. Dessutom, när supernatanten av DNase-behandlade PMA-stimulerade neutrofiler tilldelas som en maximal signal för NET-standarden, kan denna ELISA-analys användas som en semikvantitativ metod 1,14,15.

De långa kromatintrådarna i NET är dekorerade med MPO- och NE-proteiner. För att öka bindningen mellan infångningsantikroppen och MPO-DNA- eller NE-DNA-komplexen skärs trådarna i kortare bitar genom begränsad DNA-nedbrytning med enzymet DNas; tillsatsen av en DNase-koncentration som är för hög kan leda till överdriven nedbrytning av DNA och därmed en minskning av absorbansen. Resultaten av ett preliminärt experiment (se figur 3) visade att en lämplig mängd DNas-tillsats är nödvändig för att lossa resterna från NET. Experimenten som använde iso-typkontrollantikroppar istället för specifika infångningsantikroppar visade att de infångningsantikroppar som användes i denna analys var specifika för MPO-DNA- och NE-DNA-komplex.

Det tidiga stadiet av NET-bildning kännetecknas av dekondenserat kromatin och bevarandet av intensiteten hos plasmamembranet 9,16,17. Neutrofiler med en kondenserad kärna har identifierats som neutrofiler som genomgår NET-bildning och kan kvantifieras med flödescytometri10. Även om flödescytometri kan analysera ett stort antal bilder från celler på kort tid, kan den inte användas för att utvärdera de senare stadierna av NET-bildning efter cellmembranruptur och extrudering av kromatin. Citrullinerade histoner H3, som är kända för att vara NET-specifika markörer, kan detekteras med western blotting18 och ELISA19; Dessa metoder är dock endast specifika för PAD4-relaterad NET-bildning och kan inte användas för att bedöma PAD4-oberoende NET20.

Fyndet att nivåerna av serumrester av NET var högre hos patienter med covid-19 än hos friska kontroller stämmer överens med tidigare rapporter21,22. Detta fynd tyder på att neutrofilaktivering, inklusive NET-bildning, kan spela en viktig roll i patogenesen av COVID-19.

Denna analys har en begränsning. Nya rapporter har visat att immunrelaterade gener, inklusive MPO och ELANE, som kodar för MPO respektive NE, uttrycks i hög grad under okontrollerade inflammatoriska förhållanden23 och är positivt korrelerade med sjukdomens svårighetsgrad och dödlighet24. Eftersom MPO och NE är involverade i bildandet av NET oberoende av dessa enzymatiska aktiviteter15, kan ökade proteinnivåer av NE och MPO i neutrofiler påverka resultaten av denna analys.

Vi drar slutsatsen att denna sandwich-ELISA-metod direkt mäter extracellulärt DNA med granulära proteiner, inklusive NE och MPO, som är specifika för NET-bildning. Denna detektionsanalys är en tillförlitlig, mycket känslig och användbar metod för att undersöka egenskaperna hos NET i humana prover och odlingssupernatanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

All data som genererats och/eller analyserats under denna studie ingår i denna publicerade artikel. Författarna förklarar att de inte har några motstridiga intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr. Huq Muhammad Aminul för att ha hjälpt till med att granska manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 195
Kvantifiering av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex från neutrofila extracellulära fällor med hjälp av en modifierad sandwich-ELISA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter