Summary
Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.
Abstract
Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto altamente variável de defeitos estruturais e prejuízos cognitivos que surgem devido à exposição pré-natal ao etanol. Devido à complexa patologia do TEAF, modelos animais têm se mostrado críticos para nossa compreensão atual dos defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. O peixe-zebra provou ser um modelo poderoso para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol devido ao alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento entre peixes-zebra e humanos. Como um sistema modelo, o peixe-zebra possui muitos atributos que os tornam ideais para estudos de desenvolvimento, incluindo um grande número de embriões fertilizados externamente que são geneticamente tratáveis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem com precisão o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em vários contextos genéticos. Uma importante ferramenta genética disponível no peixe-zebra é a transgênese. No entanto, gerar construções transgênicas e estabelecer linhagens transgênicas pode ser complexo e difícil. Para resolver essa questão, os pesquisadores do peixe-zebra estabeleceram o sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon. Este sistema modular usa uma abordagem de clonagem de Gateway multisite para a montagem rápida de construções transgênicas completas baseadas em transposon Tol2. Aqui, descrevemos a caixa de ferramentas do sistema flexível Tol2 e um protocolo para geração de construções transgênicas prontas para a transgênese de peixe-zebra e seu uso em estudos de etanol.
Introduction
A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da teratogenicidade do etanol, e os resultados desses sistemas modelo têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em estudos com etanol humano 5,6. Dentre estes, o zebrafish tem emergido como um poderoso modelo para o estudo da teratogênese do etanol7,8, em parte devido à sua fecundação externa, alta fecundidade, tratabilidade genética e embriões translúcidos. Esses pontos fortes se combinam para tornar o peixe-zebra ideal para estudos de imagem ao vivo em tempo real do FASD usando linhas transgênicas de peixe-zebra.
O peixe-zebra transgênico tem sido extensivamente utilizado para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento embrionário9. No entanto, criar construções transgênicas e linhas transgênicas subsequentes pode ser extremamente difícil. Um transgene padrão requer um elemento promotor ativo para conduzir o transgene e um sinal poli A ou "cauda", tudo em um vetor bacteriano estável para manutenção geral do vetor. A geração tradicional de uma construção transgênica multicomponente requer várias etapas demoradas de subclonagem10. Abordagens baseadas em PCR, como a montagem Gibson, podem contornar alguns dos problemas associados à subclonagem. No entanto, primers únicos devem ser projetados e testados para a geração de cada construção transgênica única10. Além da construção de transgenes, a integração genômica, a transmissão germinativa e a triagem para a integração adequada de transgenes também têm sido difíceis. Descrevemos aqui um protocolo para utilização do sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon (Tol2Kit)10,11. Este sistema modular usa clonagem de Gateway multissite para gerar rapidamente várias construções transgênicas a partir de uma biblioteca em constante expansão de vetores de "entrada" e "destino". Os elementos transponíveis integrados Tol2 aumentam consideravelmente a taxa de transgênese, permitindo a rápida construção e integração genômica de múltiplos transgenes. Usando este sistema, mostramos como a geração de uma linhagem de zebrafish transgênico endoderme pode ser usada para estudar os defeitos estruturais tecido-específicos subjacentes ao TEAF. Em última análise, neste protocolo, mostramos que a configuração modular e a construção de construções transgênicas ajudarão muito a pesquisa de FASD baseada em peixe-zebra.
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Protocol
Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram criados e criados seguindo os protocolos estabelecidos pela IACUC12. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade de Louisville.
NOTA: A linhagem de peixe-zebra selvagem, AB, e a linhagem dupla mutante bmp4st72;smad5b1100 foram usadas neste estudo. Toda a água utilizada neste procedimento foi água de osmose reversa estéril. As imagens confocais foram obtidas em microscópio confocal de varredura a laser. As medidas da endoderme foram realizadas utilizando-se a ferramenta de medida do ImageJ. Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio de software estatístico.
1. Fazendo as soluções e mídias
- Meio bacteriano: Dissolver o caldo LB ou ágar conforme as instruções do fabricante, e autoclave. Antes de despejar o meio em placas de Petri de 100 mm, adicione ampicilina (50 μg/mL), canamicina (50 μg/mL) ou uma combinação de ampicilina/cloranfenicol (50 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente).
- Para fazer 20x estoque de meio embrionário, dissolver o seguinte em 1 L de água: 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl 2, 0,41 g de K 2 HPO 4, 0,142 g de Na 2 HPO 4 e 4,9 g de MgSO4·7H 2O. Filtrar-esterilizar a solução-mãeusando um sistema de filtração a vácuo de 0,22 μm, e armazenar a 4 °C.
NOTA: Ignore o precipitado branco que se forma; isso não vai impactar a mídia. - Em 19 L de água, dissolver 1,2 g de NaHCO3 e adicionar 1 L do stock de 20x de meios embrionários para gerar a solução de meio embrionário de trabalho e manter esta solução a 28 °C.
- Para solução de vermelho de fenol a 2%, dissolver 20 mg de sal de sódio vermelho de fenol em 1 mL de água livre de RNase e armazenar à temperatura ambiente.
2. Moldes de injeção de embriões
- Para fazer a placa de injeção de agarose, dissolver a agarose no meio embrionário até uma concentração final de 3% aquecendo para ferver.
- Despeje 50 mL de agarose em placas de Petri de 100 mm e, enquanto a agarose ainda estiver líquida, coloque suavemente o molde de injeção na agarose para evitar a formação de bolhas sob o molde.
- Deixe as placas de agarose esfriar. Quando a agarose estiver sólida, remova o molde de injeção e guarde a 4 °C até estar pronto para usar.
3. Pipetas de injeção
- Puxe os capilares de 1,0 mm (OD) contendo um filamento em agulhas usando um extrator de pipeta vertical com o solenoide ajustado para 2,5 e o elemento de aquecimento ajustado para 14,6.
NOTA: Qualquer extrator aquecido funcionará se puxar os capilares em duas agulhas de forma limpa e uniforme, mas as agulhas de injeção precisam ser puxadas dentro de 1 semana após a injeção dos embriões de peixe-zebra para resultados consistentes da injeção.- Coloque o capilar no puxador, aperte a braçadeira em cada extremidade e, em seguida, ative o elemento de aquecimento.
- Puxe os capilares para criar duas agulhas de injeção.
- Retire os capilares do puxador e guarde-os em uma placa de Petri vazia com uma tira de argila modeladora que atua como suporte da agulha.
4. Preparação de mRNA de transposase
- Linearizar o plasmídeo Tol2Kit contendo transposase com uma endonuclease de restrição NotI, combinando o seguinte em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL: 10 μL de plasmídeo transposase (150 ng/μL), 1,5 μL de tampão de reação de endonuclease de restrição, 0,3 μL de endonuclease NotI.
- Encha a reação até 20 μL com água sem RNase e, em seguida, misture e digerir a 37 °C durante a noite.
- Pare a digestão da transposase adicionando 1 μL de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 2 μL de 5 M NH4OAc e 80 μL de 100% de EtOH à reação de digestão e, em seguida, misture e resfrie a -20 °C durante a noite.
- Centrifugar a solução a 14.000x g durante 20 min a 4 °C e, em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender a pastilha de ADN em água isenta de RNase.
- Determinar a concentração de plasmídeo linear em nanogramas por microlitro (ng/μL) usando um fluorômetro executando primeiro 2 μL de um branco de água livre de RNase e, em seguida, executando 2 μL do plasmídeo linearizado.
NOTA: As concentrações plasmidiais normalmente variam entre 100-200 ng/μL - Configure a produção de mRNA do SP6 combinando os seguintes componentes em ordem em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL: 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampão de reação 10x, 0,1-1 μg de molde de DNA linear e 2 μL de mistura enzimática SP6.
- Encher a reação até 20 μL com água sem RNase e, em seguida, misturar e incubar a 37 °C por 2 h.
- Após incubar por 2 h, adicionar 1 μL de DNase, misturar bem e incubar por mais 15 min a 37 °C.
- Para interromper a reação SP6, adicione 30 μL de solução de precipitação de LiCl ao tubo de reação e, em seguida, misture e resfrie a -20 °C durante a noite.
- Centrifugar a solução a 14.000 x g por 20 min a 4 °C para pellet do mRNA, aspirar o sobrenadante e lavar o pellet de mRNA com 1 mL de EtOH 80% (diluído com água livre de RNase).
- Centrifugar a solução a 14.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para pelar o mRNA e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Deixe o pellet secar ao ar.
- Ressuspender a pastilha de mRNA em 20 μL de água livre de RNase, determinar a concentração de mRNA em nanogramas por microlitro (ng/μL) usando um fluorômetro conforme descrito na etapa 4.5 (deve ser de pelo menos 100 ng/μL), alíquota de 100 ng de mRNA por tubo para uso único e armazenar a −80 °C.
NOTA: Para garantir que o mRNA não seja degradado, 2 μL de mRNA podem ser executados rapidamente em um gel de eletroforese de DNA para confirmar uma única banda a 1.950 bps.
5. Clonagem de Multisite Gateway para criar vetores de entrada para transgênese
NOTA: Este protocolo é modificado de Kwan et al.10, com a reação LR escrita como uma reação de meio LR e com um volume total de 5 μL. Para gerar novos elementos de entrada, é necessário utilizar reações de PB utilizando vetores doadores de 5', meio e 3'10,13.
- Para realizar a reação, reúna 10 fmol cada de p5E, pME e p3E e 20 fmol do vetor de destino (pDest).
NOTA: A recombinação de LR multissítio usa quatro vetores plasmidiais diferentes: um vetor de entrada de 5' (p5E), um vetor de entrada do meio (pME), um vetor de entrada de 3' (p3E) e um vetor de destino (pDest), para gerar uma construção transgênica única flanqueada por repetições de Tol2 prontas para serem injetadas em embriões de peixe-zebra.- Identifique o tamanho de todos os quatro vetores em pares de bases da fonte de plasmídeo (Tabela 1, Tol2Kit Wiki página14 ou Addgene11; veja a Tabela de Materiais).
NOTA: Para novos vetores, o sequenciamento completo de plasmídeos por meio de empresas de sequenciamento comercial pode fornecer o tamanho exato do plasmídeo em bps. - Determinar a concentração dos quatro vectores em nanogramas por microlitro (ng/μL) utilizando um fluorómetro, conforme descrito no passo 4.5.
- Usando o peso do DNA como 660 g/mol e o tamanho do plasmídeo (em bps), calcule o total de nanogramas (ng) de plasmídeo necessários para atingir 10 fmol (vetores de entrada) ou 20 fmol (vetor de destino).
NOTA: O laboratório Mosimann da Universidade do Colorado, Anschutz Medical Campus, gerou uma planilha disponível gratuitamente para calcular a quantidade de plasmídeo necessária (em ng) e o volume (em μL) dos vetores necessários na reação LR15.
- Identifique o tamanho de todos os quatro vetores em pares de bases da fonte de plasmídeo (Tabela 1, Tol2Kit Wiki página14 ou Addgene11; veja a Tabela de Materiais).
- Para gerar a construção descrita abaixo, sox17: EGFPCAAX, use os seguintes vetores: um vetor p5E contendo o promotor zebrafish sox17 , que é 6.918 pb no tamanho16; um vetor pME contendo o EGFP prenilado, que é de 3.345 pb no tamanho10; um vetor p3E contendo a sequência de sinal SV40 late poly A, que é de 2.838 pb no tamanho10; e o pDest, que tem 5.883 pb no tamanho10.
- Usando a concentração de plasmídios determinada na etapa 5.1.2 e a quantidade em nanogramas (ng) para cada vetor (etapa 5.1.3), calcule o total de microlitros (μL) de cada plasmídeo necessário para atingir 10 fmol (vetores de entrada) ou 20 fmol (vetor de destino) e, em seguida, divida isso por dois para uso nas reações de 5 μL de meio LR (todos os valores listados abaixo estão listados na Tabela 2).
- Para gerar 10 fmol de p5E-sox17, use 45,66 ng (na concentração de 140,3 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 4 para obter 0,65 μL.
- Para gerar 10 fmol de pME-EGFPCAAX, use 22,08 ng (a uma concentração de 213,5 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 10 para obter 0,52 μL.
- Para gerar 10 fmol de p3E-poly A, use 15,73 ng (na concentração de 276,1 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 20 para obter 0,57 μL.
- Para 20 fmol do vetor de destino, use 77,66 ng de pDest (a uma concentração de 307,3 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 5 para obter 1,63 μL.
- Para estabelecer uma reação de 5 μL de meio-LR, combine os volumes de p5E, pME, p3E e pDest determinados na etapa 5.3 em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e, em seguida, adicione água estéril para atingir um volume total de reação de 4 μL.
- Vórtice vigorosamente a mistura enzimática LR 2x por 1 min cada para garantir a mistura adequada e, em seguida, adicione 1 μL à reação e misture completamente.
- Incubar a 25 °C durante a noite (16+ h).
- Parar a reação LR adicionando 0,5 μL de proteinase K (2 μg/μL), incubar a 37 °C por 10 min e arrefecer até à temperatura ambiente.
- Transformar 3-4 μL de plasmídeo em células descongeladas e quimicamente competentes, adicionando o plasmídeo e deixando as células ficarem no gelo por 25-30 min.
- Enquanto as células ficam no gelo, aqueça duas placas de ágar LB-ampicilina à temperatura ambiente.
- Choque térmico das células em banho-maria a 42°C por precisamente 30 s.
- Após o choque térmico, adicionar 250 μL de meio líquido rico e livre de antibióticos às células e incubar com agitação a 37 °C por 1,5 h.
- Espalhe 300 μL de bactérias em uma placa de ampicilina e incube a 37°C durante a noite.
- Na manhã seguinte, rastrear as colônias quanto à presença de dois fenótipos, claro e opaco, escolher as colônias claras (como descrito em Kwan et al.10), uma de cada vez, inocular a cultura líquida e, em seguida, agitar a 37 °C durante a noite.
NOTA: Colônias claras quase sempre contêm a colônia LR correta (>85% das vezes). - Usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante, execute uma preparação de plasmídio em cada cultura líquida e digere diagnóstica cada plasmídeo para confirmar o tamanho apropriado da construção transgênica, o que indica que a reação de gateway LR funcionou corretamente.
- Re-transformar as construções transgênicas corretas usando o protocolo padrão de transformação bacteriana como descrito nas etapas 5.4-5.12 usando 0,5-1 μL do plasmídeo, e incubar apenas a 37 °C por 1 h.
- Re-estriar as colônias e confirmar que cada uma tem a construção transgênica LR como na etapa 5.14.
- Determinar a concentração plasmidial conforme descrito na etapa 4.5 (pelo menos 150 ng/μL são necessários para a injeção do embrião).
6. Injeção do transgene nos embriões
- Descongelar uma amostra de mRNA transposase de uso único e a construção transgênica de Tol2 no gelo e pré-avisar uma placa de injeção de agarose à temperatura ambiente.
- Combinar o seguinte no gelo: 150 ng de plasmídeo, 100 ng de mRNA de transposase e 2% de vermelho de fenol (0,3 μL). Em seguida, adicione água livre de RNA para completar o volume de 3 μL.
- Transfira embriões em estágio celular usando pipetas de transferência para a placa de injeção (descrita na etapa 2) preenchida com EM cobrindo completamente o ágar e, em seguida, pressione suavemente aproximadamente 50-75 embriões por slot da placa de injeção.
- Adicione a mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol à extremidade aberta de uma agulha de injeção capilar, coloque a agulha capilar na armadura do equipamento de injeção e ligue o equipamento de injeção.
NOTA:A plataforma de injeção usa gás comprimido, como ar, para pulsar o volume desejado (descrito na etapa 6.5) da mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no embrião quando ativado. - Abaixe a agulha capilar para o EM da placa de injeção e quebre a ponta usando pinça para permitir que apenas uma pequena quantidade de mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol seja bombeada para fora pelo equipamento de injeção.
- Injetar os embriões com um pequeno bolus de 3 nL da mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no corpo celular do embrião.
NOTA: Um bolus de 3 nL é um volume de mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no qual sete bolus podem teoricamente se encaixar igualmente na linha média do embrião. - Quando terminar de injetar os embriões, remova-os da placa de injeção, retirando-os suavemente da ranhura e transferindo-os para uma placa de Petri de 100 mm com EM fresco (aproximadamente 40 mL) e, em seguida, incube a 28,5 °C para permitir que os embriões se desenvolvam.
7. Triagem de embriões para inserção transgênica
- Para a expressão de proteínas fluorescentes, escolher o estágio de desenvolvimento apropriado em que o transgene fluorescente deve ser expresso e rastrear a presença de fluorescência em um microscópio dissecante fluorescente.
OBS: Estes embriões serão mosaicos em sua expressão e apresentarão uma inserção genômica da construção transgênica. - Triagem de transgenes não fluorescentes por triagem de um marcador transgênico fluorescente (conforme descrito na etapa 7.1), como GFP conduzido pelo promotor cardíaco-específico para o gene cmlc2 ou mCherry impulsionado pelo promotor específico da lente de αcyrstallin, que estão contidos em vetores de destino distintos.
- Permitir que os embriões positivos para inserção transgênica se desenvolvam completamente até os estágios de peixe-zebra adulto.
- Uma vez que os peixes transgênicos potenciais atinjam a idade de reprodução, selecione-os individualmente para transmissão germinativa e expressividade transgênica, reproduzindo-os para peixes-zebra selvagens.
- Os adultos cujos embriões se desenvolvem normalmente e dão a expressão transgênica mais forte e apropriada são mantidos como linhagens únicas de peixes-zebra transgênicos para futuros trabalhos e análises.
NOTA: Como uma abordagem alternativa para a triagem para a inserção genômica de construções transgênicas, projete primers de PCR que apenas amplificam a construção transgênica e não o DNA selvagem.
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Representative Results
Para gerar as construções transgênicas, foi utilizado o sistema de transgênese Tol2. Três vetores de entrada, incluindo p5E, que contém os elementos promotores/potencializadores do gene, pME, que mantém o gene a ser expresso pelos elementos promotores/intensificadores, e p3E, que, no mínimo, contém a cauda poliA, foram usados para gerar a construção transgênica via clonagem LR de gateway multissite. O vetor de destino, pDest, fornece as repetições de Tol2 para a inserção genômica da construção transgênica em embriões de peixe-zebra e contém todas as informações genéticas essenciais para o crescimento bacteriano (Figura 1A). Para os propósitos deste manuscrito, criamos e injetamos um construto transgênico sox17:EGFPCAAX . O promotor do marcador endodérmico, sox17, foi usado para conduzir EGFP marcado com membrana na endoderme em desenvolvimento do peixe-zebra. Para construções transgênicas que expressam proteínas não-fluoróforas, um vetor pDest que contém um marcador transgênico fluorescente como cmlc2:EGFP pode ser usado para auxiliar na inserção genômica (Figura 1A).
Usando os valores descritos no protocolo acima (Tabela 2), a construção transgênica sox17:EGFPCAAX foi gerada, e 4 μL dessa construção foram transformadas em células de Escherichia coli quimicamente competentes. Depois de incubar a 37 °C durante a noite, a placa de ágar continha aproximadamente 250 colônias (reações LR tipicamente média 150-300 colônias por placa em nosso laboratório). A triagem dessas colônias foi realizada com base na opacidade. Em nossas mãos, as colônias que estavam claras tinham o produto correto sox17:EGFPCAAX >85% das vezes, enquanto as colônias opacas nunca continham o produto correto de recombinação (Figura 1B, ponta de seta vs. seta). Após o isolamento do plasmídeo de várias colônias, a digestão de restrição dos produtos recombinantes foi realizada com a enzima de restrição, NcoI. Duas colônias claras e uma colônia opaca foram digeridas. Ambas as colônias claras tinham uma única banda no tamanho correto de 9.544 pb (plasmídeos não digeridos carregados como controle digestivo), enquanto a colônia opaca não tinha nenhuma banda (Figura 2A). Essas construções positivas de sox17:EGFPCAAX foram retransformadas, as colônias subsequentes foram re-estriadas, essas colônias foram confirmadas como tendo o plasmídeo e estoques de congelamento bacteriano de -80 °C foram gerados. As concentrações do plasmídeo sox17:EGFPCAAX e do mRNA da transposase cappeada foram determinadas para que ambos pudessem ser usados para injeção (Figura 2B).
Os embriões foram preparados para injeção colocando-se embriões em estágio celular em um molde de injeção de embriões pré-aquecidos (Figura 3A-C). Uma vez colocada no molde de injeção, a agulha de injeção contendo o mRNA sox17:EGFPCAAX foi colocada em um suporte de micropipeta no micromanipulador (Figura 3D,E). Os embriões foram injetados com 100 ng de mRNA de transposase, 150 ng de plasmídeo sox17:EGFPCAAX e vermelho de fenol (corante de rastreamento de injeção). Um bolus de 3 nL (determinado pelo tamanho descrito no protocolo, passo 6.6) foi injetado no corpo celular e não na gema do embrião para maior chance de integração (Figura 3F)10.
Após a injeção, os embriões foram retirados do molde de injeção e deixados desenvolver-se por 24 h. Nas 24 h pós-fertilização (hpf), os embriões foram triados para a expressão endodérmica de EGFPCAAX. A expressão de EGFPCAAX endoderme em mosaico foi observada em ~75% dos embriões injetados (Figura 4A,A'). Para a triagem dos embriões injetados com transgenes não fluorescentes, como Gal4 ou CreERT2, pode-se utilizar um vetor de destino que também contenha um marcador transgênico (i.e., cmlc2:EGFP) (Figura 1A) (Figura 4B,B'). Zebrafish adultos que apresentaram transgênese germinativa de sox17:EGFPCAAX geraram embriões fluorescentes com a endoderme totalmente marcada com EGFPCAAX (Figura 4C).
Usando a recém-criada linha transgênica sox17:EGFPCAAX, pudemos avaliar diretamente o impacto do etanol na formação das bolsas endodérmicas. As bolsas são protrusões que se formam na borda lateral da endoderme e são importantes para a formação do esqueleto facial e de múltiplos sistemasorgânicos17. Demonstramos anteriormente que o bloqueio da sinalização da proteína morfogenética óssea (Bmp) resulta em hipoplasia das bolsas18. Agora mostramos que o tratamento com etanol de mutantes Bmp de 10-18 hpf tem um impacto sutil, mas significativo, no tamanho da bolsa. O comprimento dorso-ventral de cada bolsa das bolsas 1-5 (o peixe-zebra tem seis bolsas, mas a sexta ainda não havia se formado completamente no estágio de desenvolvimento imageado) foi medido em embriões mutantes Bmp selvagens tratados com controle e tratados com etanol (Figura 5A). Como controle dos impactos gerais do crescimento devido à exposição ao etanol, o comprimento anteroposterior de toda a endoderme foi medido (Figura 5A). O comprimento total da endoderme não foi afetado pelo genótipo ou tratamento (Figura 5B). No entanto, as bolsas 1 e 3 mostraram aumentos significativos no comprimento da bolsa entre os embriões selvagens não tratados e tratados com etanol, mas diminuições significativas no comprimento entre os mutantes Bmp não tratados e tratados com etanol (Figura 5C; ANOVA two-way; bolsa 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; bolsa 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). A bolsa 2 mostrou aumentos significativos no tamanho da bolsa entre os grupos selvagem e mutante Bmp não tratado e tratado com etanol, respectivamente (Figura 5C; ANOVA two-way; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).
Figura 1: Reação do gateway LR para construção do transgene. (A) Esquema da reação de clonagem do gateway LR modular de quatro partes. LR Clonase recombina os três vetores de entrada, p5E, pME e p3E, e o vetor de destino, pDest, em uma reação altamente específica para gerar um novo produto transgênico pronto para injeção embrionária. Para triagem de transgenes não fluorescentes, os vetores pDest podem conter marcadores transgênicos opcionais (cmlc2:EGFP, por exemplo). (B) Exemplo de colônias bacterianas obtidas a partir da transformação dos produtos de recombinação LR. As colônias claras continham um produto de recombinação LR correto >85% das vezes (cabeça de seta), enquanto as colônias opacas nunca continham um produto de recombinação correto (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise do DNA plasmidial e do RNAm da transposase . (A) Digestão diagnóstica das três colônias a partir da transformação dos produtos de recombinação LR. A única colônia opaca não continha nenhum plasmídeo para triação, enquanto as duas colônias claras continham uma única banda a 9.544 pb (sem corte vs. corte). (B) RNAm da transposase a 1.950 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configuração da injeção de embriões de peixe-zebra. (A) Um molde de injeção é colocado em agarose líquida diluída em EM (3% v/v). (B) Uma vez solidificado, o molde é removido da placa de agarose. (C) Os embriões estão dispostos nos moldes de injeção. (D,E) A mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol é pipetada na agulha de injeção, que é colocada no suporte da micropipeta no micromanipulador. (F) Um bolus de 3 nL é injetado no corpo celular do embrião no estágio de uma célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Triagem de zebrafish injetado com a construção transgênica. (A,A') Imagem confocal de um embrião fotografado a 24 hpf mostra a expressão em mosaico do transgene sox17:EGFPCAAX. (B,B') Expressão de marcadores transgênicos de cmlc2:EGFP no coração em desenvolvimento a 24 hpf. Vista lateral dos embriões, com anterior à esquerda e dorsal no topo. (C) Imagem confocal de um embrião gerado a partir de um peixe-zebra adulto portador de transgenes. Toda a endoderme está expressando EGFPCAAX. Vista lateral do embrião, com anterior à esquerda e ventral no topo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Medidas de bolsa em embriões selvagens e mutantes Bmp tratados com etanol. (A) Esquema mostrando a medida do comprimento total da endoderme e do comprimento das bolsas. (B) As medidas do comprimento total da endoderme anteroposterior não mostram diferença entre embriões selvagens e mutantes Bmp não tratados e tratados com etanol. (C) As medidas do comprimento dorso-ventral da bolsa indicam que as bolsas 1 e 3 mostram aumentos no comprimento da bolsa entre os embriões selvagens não tratados e tratados com etanol, mas diminuições no comprimento entre os mutantes Bmp não tratados e tratados com etanol (ANOVA two-way; bolsa 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; bolsa 3: F(1,54) = 12,70, p = 0,0008). A bolsa 2 mostra um aumento no comprimento entre os grupos selvagem selvagem e mutante Bmp não tratado e tratado com etanol (ANOVA two-way; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Não foram observadas diferenças no comprimento da bolsa entre as bolsas 4 e 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Componentes do Tol2Kit alojados no Lovely Lab. Cada vetor de entrada e destino disponível no Lovely Lab, suas descrições e seu laboratório de origem. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Cálculo da quantidade e concertação de cada vetor na reação de recombinação LR. A quantidade de cada vetor foi calculada a partir do tamanho (em pb) e da fmol necessária para cada componente: 10 fmol de cada vetor de entrada e 20 fmol do vetor de destino. A partir da concentração plasmidial, cada vetor é diluído em água estéril para adicionar 1 μL ou menos à reação LR. Água estéril é adicionada ao pool vetorial para igual a 4 μL, 1 μL de mistura de reação LR é adicionado à reação, e é incubado a 25°C durante a noite. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Os peixes-zebra são ideais para estudar o impacto da exposição ao etanol no desenvolvimento e estados de doença 7,8. Os peixes-zebra produzem um grande número de embriões translúcidos, fertilizados externamente e geneticamente tratáveis, o que permite a obtenção de imagens vivas de vários tecidos e tipos celulares marcados com transgenes simultaneamente em múltiplos contextos ambientais19,20. Esses pontos fortes, combinados com a forte conservação genética de desenvolvimento com humanos, fazem do peixe-zebra um poderoso sistema modelo para obter imagens do impacto do etanol 7,8. Aqui, descrevemos o protocolo para uma abordagem modular para gerar e injetar construções transgênicas e estabelecer linhagens de zebrafish transgênico para futuros estudos de etanol.
Muitas abordagens diferentes foram estabelecidas para gerar peixes-zebra transgênicos. No entanto, gerar construções transgênicas e linhas transgênicas pode ser assustador. Embora as técnicas tradicionais de subclonagem, clonagem de BAC ou abordagens baseadas em PCR, como a montagem de Gibson, permitam a geração de construções transgênicas, elas têm baixo rendimento e carecem de versatilidade em sua construção10. Além disso, essas estratégias precisam ser redesenhadas para cada construto transgênico criado. A subclonagem requer múltiplas digestãos e ligaduras, supondo que todos os locais de restrição necessários estejam presentes e sejam únicos. A clonagem de BAC requer o sequenciamento e teste de vários clones de BAC. Para a montagem da Gibson, novos primers de PCR devem ser projetados para cada construção transgênica. Além disso, a injeção de DNA não cortado ou linearizado leva a uma baixa transmissão germinativa21,22,23.
O Tol2Kit é um sistema modular que utiliza clonagem de gateway para gerar construções transgênicas completas ladeadas por repetições de Tol2 que, quando combinadas com o mRNA da transposase, aumentam sobremaneira a transgênese e a transmissão germinativa 10,11,24,25. Dezenas de vetores de entrada e destino estão disponíveis no laboratório Kwan e no Cole Lab10,11. Além disso, os laboratórios de peixes-zebra que usam o Tol2Kit geraram e selecionaram muito mais vetores de entrada e destino. Como exemplo da amplitude de vetores disponíveis, reunimos e utilizamos mais de 70 vetores (Tabela 1). Com todos esses recursos da comunidade, pode-se gerar rapidamente milhares de construções transgênicas diferentes simplesmente combinando os vetores de escolha em uma reação LR.
Reações LR ótimas requerem cálculos exatos do tamanho e concentração do plasmídeo. Os cálculos para cada vetor são feitos em valores de femtomol (fmol), de modo que cada reação não requer um alto volume de plasmídio para gerar uma construção transgênica. No entanto, essa pequena quantidade de plasmídeo torna as diluições e a pipetagem adequadas extremamente críticas para o sucesso da reação10. Fatores adicionais que podem afetar a reação LR são o tamanho das inserções nos diferentes vetores de entrada. Por exemplo, o elemento p5E-sox17 usado neste estudo é superior a 4 kb, o que, se combinado com elementos pME e p3E igualmente grandes, resultará em um vetor transgênico muito grande. Um grande plasmídeo em bactérias pode ser difícil de cultivar, diminuindo assim o número de colônias geradas a partir da transformação bacteriana. Isso também resultará em crescimento mais lento e diminuição dos níveis plasmidiais quando isolado10. É importante ressaltar que ter células bacterianas altamente competentes, bem como aumentar a incubação das células bacterianas durante a transformação do plasmídeo de recombinação, são fundamentais para gerar colônias suficientes para capturar a formação adequada de transgenes. Além disso, o uso da enzima correta da reação LR (listada na Tabela de Materiais) também desempenha um papel importante no sucesso da reação LR.
Além da geração de uma construção transgênica e transformações bacterianas, a injeção de embriões e a integração do genoma também podem ser difíceis. A geração de mRNA transposase de alta qualidade aumenta consideravelmente a frequência de integração genômica10. Os capilares tracionados precisam ser feitos pouco antes da injeção dos embriões, pois agulhas mais velhas podem perder a ação capilar (ou seja, o fluido injetável não se move para a ponta da agulha) (Figura 3E). Tanto quebrar a ponta da agulha para injetar apenas ~3 nL de líquido e injetar o corpo celular exigem prática. Nosso protocolo de treinamento envolve injetar o corpo celular apenas com corante injetor vermelho fenol até quebrar a agulha e injetar os embriões são dominados. A injeção do corpo celular aumenta drasticamente a taxa de integração do genoma10. Combinando tudo isso, temos uma média de 75% ou mais de inserção do genoma e expressão em mosaico, mas isso pode variar de construção para construção.
Como a inserção genômica pode ser aleatória, cada embrião que apresenta expressão em mosaico é uma inserção transgênica única e requer triagem contínua. Essa triagem contínua é necessária para mostrar que o local de integração não é prejudicial ao desenvolvimento do embrião, que ocorre transmissão germinativa e que a expressão do transgene não é atenuada ou potencialmente silenciada. Uma vez que uma linhagem transgênica tenha sido estabelecida, ela pode ser prontamente usada para análises múltiplas em estudos de etanol. Para essas construções transgênicas não fluorescentes, os marcadores transgênicos comumente usados incluem cmlc2:GFP e αcrystallin:RFP, que marcam o coração e a retina, respectivamente, e permitem a triagem transgênica contínua. Além de marcadores transgênicos para triagem, esses dois transgenes podem ser usados para estudar diretamente o impacto do etanol no desenvolvimento do coração e da retina.
Usando o protocolo descrito acima, geramos uma linhagem de zebrafish transgênico sox17:EGFPCAAX que teve transmissão germinativa estável de uma construção EGFP marcada com membrana endoderme-específica. Usando esta linha, pudemos medir o impacto do etanol na formação de bolsas endodérmicas em embriões mutantes Bmp sensíveis ao etanol. Mostramos que os tamanhos das bolsas 1-3, mas não das bolsas 4 e 5, nem o comprimento total da endoderme, foram impactados nos mutantes Bmp tratados com etanol (Fig. 5). Este trabalho piloto sugere que a interação Bmp-etanol interrompe a formação da endoderme, em particular os comportamentos celulares subjacentes à formação da bolsa. Este trabalho exemplifica a utilidade da geração de linhagens de zebrafish transgênicos para estudos de etanol. Como resultado, a criação de novas linhagens transgênicas aumentará muito nossa compreensão dos processos celulares sensíveis ao etanol e dos eventos teciduais no TEAF.
Em última análise, o peixe-zebra transgênico, e o peixe-zebra em geral, provaram ser incrivelmente poderosos no estudo do TEAF 7,8. O Tol2Kit é um kit de ferramentas extremamente versátil que permite aos pesquisadores gerar rapidamente várias construções transgênicas prontas para injetar em peixes-zebra. O design modular e a facilidade de gerar novos vetores de entrada resultam em extrema flexibilidade na geração de construções transgênicas sem ter que redesenhar nenhum componente. No geral, este kit de ferramentas irá melhorar muito a pesquisa de peixe-zebra e a pesquisa em geral destinada a melhorar a compreensão do FASD.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por uma bolsa do National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B.
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
- The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
