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Immunology and Infection

मानव परिधीय रक्त सीडी 14 + मोनोसाइट्स से कार्यात्मक ओस्टियोक्लास्ट का भेदभाव

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/64698
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1School of Infection & Immunity, University of Glasgow
* These authors contributed equally

Summary

ओस्टियोक्लास्ट शरीर में प्रमुख हड्डी-पुनर्जीवित कोशिकाएं हैं। यह प्रोटोकॉल मानव परिधीय रक्त मोनोसाइट्स से ओस्टियोक्लास्ट के इन विट्रो भेदभाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग होमोस्टेसिस और रोगों में ओस्टियोक्लास्ट जीव विज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में किया जा सकता है।

Abstract

ओस्टियोक्लास्ट (ओसी) हड्डी-पुनर्जीवित कोशिकाएं हैं जो कंकाल के विकास और वयस्क हड्डी रीमॉडेलिंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। कई हड्डी विकार ओसी के बढ़ते भेदभाव और सक्रियण के कारण होते हैं, इसलिए इस पैथोबायोलॉजी का निषेध एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय सिद्धांत है। दो प्रमुख कारक माइलॉयड अग्रदूतों से ओसी के भेदभाव को चलाते हैं: मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक कप्पा-बी लिगैंड (रैंकएल) के रिसेप्टर एक्टिवेटर। मानव परिसंचारी सीडी 14 + मोनोसाइट्स को लंबे समय से इन विट्रो में ओसी में अंतर करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, एक्सपोजर समय और रैंकएल की एकाग्रता भेदभाव दक्षता को प्रभावित करती है। दरअसल, विट्रो में मानव ओसी की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, लेकिन वे अक्सर एक खराब और लंबी भेदभाव प्रक्रिया में परिणाम देते हैं। इसमें, समय पर तरीके से कार्यात्मक रूप से सक्रिय परिपक्व मानव ओसी उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। सीडी 14+ मोनोसाइट्स मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से समृद्ध होते हैं और रैंक को विनियमित करने के लिए एम-सीएसएफ के साथ प्राइम किए जाते हैं। रैंकएल के बाद के संपर्क में आने से खुराक और समय-निर्भर तरीके से ओसी उत्पन्न होते हैं। ओसीएस की पहचान टार्टरेट एसिड-प्रतिरोधी फॉस्फेट (टीआरएपी) और प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ धुंधला करके की जाती है। कार्यात्मक रूप से सक्रिय ओसी की पहचान करने के लिए नाभिक और एफ-एक्टिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, OSCAR + CD14− परिपक्व OCs को फ्लो साइटोमेट्री सेल सॉर्टिंग के माध्यम से और अधिक समृद्ध किया जाता है, और OC कार्यक्षमता खनिज (या डेंटिन / हड्डी) पुनर्जीवन परख और एक्टिन रिंग गठन द्वारा निर्धारित की जाती है। अंत में, एक ज्ञात ओसी अवरोधक, रोटेनोन, परिपक्व ओसी पर उपयोग किया जाता है, यह दर्शाता है कि एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन एक्टिन रिंग अखंडता और ओसी फ़ंक्शन के लिए आवश्यक है। अंत में, इस काम में उच्च संख्या में ओसी को अलग करने के लिए एक मजबूत परख स्थापित की गई है, जो एक्टिन रिंग स्टेनिंग और एटीपी परख के साथ संयोजन में ओसी फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने और नए चिकित्सीय यौगिकों की जांच करने के लिए एक उपयोगी इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है जो भेदभाव प्रक्रिया को संशोधित कर सकते हैं।

Introduction

ओस्टियोक्लास्ट (ओसी) हेमटोपोइएटिक वंश की बहुराष्ट्रीय विशाल कोशिकाएं हैं जिनमें हड्डी को पुनर्जीवित करने की अनूठी क्षमता होती है। वे कंकाल 1,2 के विकास और निरंतर रीमॉडेलिंग के लिए जिम्मेदार हैं। विकास के कंकाल चरणों में, ओसी और ऊतक-निवासी मैक्रोफेज एरिथ्रो-माइलॉयड पूर्वजों से प्राप्त होते हैं और हड्डी के आला और अंग ऊतकों को उपनिवेशित करते हैं। शारीरिक स्थितियों में, एरिथ्रो-माइलॉयड पूर्वजों को सामान्य हड्डी के विकास और दांत विस्फोट के लिए आवश्यक होता है, जबकि अस्थि आला में परिसंचारी रक्त मोनोसाइट्स का प्रवाह ओसी, हड्डी द्रव्यमान और अस्थि मज्जा गुहा3 के प्रसवोत्तर रखरखाव प्रदान करता है। पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत, मोनोसाइट्स को सक्रिय सूजन की साइटों पर भर्ती किया जाता है और पैथोलॉजिकल हड्डी विनाश में योगदान कर सकता है 4,5.

गठिया के कई रूपों वाले रोगी संयुक्त सूजन का अनुभव करते हैं, जिससे ओसी6 के कारण प्रगतिशील संयुक्त विनाश होता है। उदाहरण के लिए, रुमेटीइड गठिया (आरए) में, अतिसक्रिय ओसी पैथोलॉजिकल हड्डी के क्षरण और संयुक्त विनाश7,8 के लिए जिम्मेदार हैं, और वर्तमान उपचार अक्सर हड्डी की क्षति में सुधार या रोक नहीं देते हैं 9,10,11. आरए रोगियों12,13,14 में जनसंख्या वितरण और ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनेटिक हस्ताक्षर दोनों के संदर्भ में मोनोसाइट्स को प्रसारित करने में परिवर्तन की सूचना दी गई है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि भड़काऊ उत्तेजना के लिए परिवर्तित मोनोसाइट प्रतिक्रियाएं सक्रिय रोग15,16,17 के साथ आरए रोगियों में ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को प्रभावित करती हैं।

ओसी का भेदभाव एक जटिल मल्टीस्टेप प्रक्रिया है जिसमें ओसी अग्रदूतों में भेदभाव के लिए माइलॉयड अग्रदूत कोशिकाओं की प्रतिबद्धता शामिल है। ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के दौरान, ओसी सेल-सेल संलयन, अपूर्ण साइटोकिनेसिस और एक परमाणु रीसाइक्लिंग प्रक्रिया के माध्यम से विशाल और बहुउद्देशीय हो जाते हैं जिसे विखंडन और संलयन 18,19,20 के रूप में वर्णित किया गया है। विट्रो में ओसी को अलग करने की क्षमता ने हड्डी जीव विज्ञान की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की अनुमति दीहै। मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक कप्पा-बी लिगैंड (रैंकएल) के रिसेप्टर एक्टिवेटर के संपर्क में आने पर ओसी अग्रदूतों से अलग होते हैं। उत्तरार्द्ध विट्रो और विवो में ओसी के सामान्य विकास और कार्य के लिए आवश्यक है, यहां तक किभड़काऊ स्थितियों 6,22,23 के तहत भी। रैंकएल ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोसाइट्स द्वारा प्रस्तुत किया जाता है, साथ ही सक्रिय टी कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट ्स द्वारा सूजन आरए सिनोवियम 2,24,25 में प्रस्तुत किया जाता है। ओसी भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, एम-सीएसएफ के संपर्क में आने वाले मोनोसाइट्स अपने कोशिका झिल्ली पर परमाणु कारक कप्पा-बी (रैंक) अभिव्यक्ति के रिसेप्टर एक्टिवेटर को विनियमित करते हैं और रैंकएल के साथ बाद की उत्तेजना के तहत, टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (टीआरएपी) -पॉजिटिव मोनोन्यूक्लियर प्री-ओसी और फिर मल्टीन्यूक्लियेटेड ओसी15,26 में अंतर करते हैं। ओसी कई एंजाइमों का उत्पादन करते हैं, उनमें से प्रमुख ट्रैप है, जो हड्डी27 के भीतर फॉस्फोप्रोटीन के क्षरण को सक्षम बनाता है। ओसी भेदभाव का एक नियामक और मार्कर ओसी-संबद्ध रिसेप्टर (ऑस्कर) है। यह ओसी वंश28 के लिए प्रतिबद्ध अग्रदूत कोशिकाओं में जल्दी से विनियमित होता है। परिपक्व विशाल काय बहुराष्ट्रीय ओसी एक बड़े सीलिंग ज़ोन को उत्पन्न करके कंकाल मैट्रिक्स को नीचा (पुनर्जीवित) कर सकते हैं, जो 21,29,30 की एक अशांत सीमा के आसपास एक एक्टिन रिंग से बना है। ओसी की हड्डी पुनर्जीवन क्षमता के लिए साइटोस्केलेटन पुनर्गठन और परिणामस्वरूप ध्रुवीकरण और एक जटिल झिल्ली के गठन की आवश्यकता होती है, जो तथाकथित उबड़-खाबड़ सीमा है। उबड़-खाबड़ सीमा एक एफ-एक्टिन-समृद्ध संरचना के एक बड़े गोलाकार बैंड से घिरी हुई है, जो एक्टिन रिंग या सीलिंग ज़ोन है। इन विट्रो और विवो दोनों में हड्डी को पुनर्जीवित करने के लिए ओसी के लिए एक्टिन रिंग अखंडता आवश्यक है, और दोषपूर्ण रफल्ड बॉर्डर गठन कम वैक्यूलर एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (वी-एटीपीस) अभिव्यक्ति 31,32,33 से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, ओसी माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध कोशिकाएं हैं, और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी)31,32,33 की अशांत सीमा पर स्थानीयकृत ओसी में माइटोकॉन्ड्रियल जैसी संरचनाओं के साथ जुड़ता है। रोटेनोन माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स आई के एक मजबूत अवरोधक के रूप में कार्य करता है और एटीपी उत्पादन को प्रभावित करता है। रोटेनोन को ओसी भेदभाव और फ़ंक्शन34 को बाधित करने के लिए भी दिखाया गया है।

यह प्रोटोकॉल मानव परिधीय रक्त नमूनों से इन विट्रो ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस की एक कुशल और अनुकूलित विधि का वर्णन करता है। मानव परिधीय रक्त में, सीडी 14 + मोनोसाइट्स ओसी 15,35,36 का मुख्य स्रोत हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक्सपोजर के कैनेटीक्स और एम-सीएसएफ और रैंकएल की सांद्रता को इष्टतम ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के लिए समायोजित किया गया है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को पहले घनत्व ढाल द्वारा पूरे रक्त में मौजूद एरिथ्रोसाइट्स और ग्रैनुलोसाइट्स से अलग किया जाता है; फिर उन्हें चुंबकीय मोतियों द्वारा सकारात्मक चयन का उपयोग करके सीडी 14 + मोनोसाइट्स के लिए समृद्ध किया जाता है। पृथक सीडी 14+ मोनोसाइट्स को फिर एम-सीएसएफ के साथ रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। यह मोनोसाइट्स को रैंक15,26 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए प्रेरित करता है। रैंकएल का बाद का जोड़ ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस और मल्टीन्यूक्लियेशन को समय-निर्भर तरीके से प्रेरित करता है। सक्रिय-पुनर्जीवित ओसी कोशिका झिल्ली30,32 के किनारे पर एफ-एक्टिन रिंग्स का विशिष्ट वितरण दिखाते हैं और ट्रैप के लिए धुंधला हो जाते हैं। परिपक्व ओसी का विश्लेषण ट्रैप + मल्टीन्यूक्लियेटेड (तीन से अधिक नाभिक) कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करके किया जाता है। परिपक्व ओसी की कार्यात्मक क्षमता का मूल्यांकन उनके पुनरुत्थान, एक्टिन रिंग अखंडता और एटीपी उत्पादन द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, विभेदित सीडी 14 − ऑस्कर + ओसी को समृद्ध किया जा सकता है और खनिज (या डेंटिन) पुनरुत्थान और एफ-एक्टिन संगठन के माध्यम से ओसी कार्यक्षमता पर कुछ यौगिकों के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस काम में, एक ज्ञात ओसी अवरोधक, रोटेनोन, का उपयोग एक यौगिक के उदाहरण के रूप में किया जाता है जो ओसी की कार्यक्षमता को प्रभावित करता है। रोटेनोन के तहत कम ओसी पुनर्जीवन गतिविधि कम एटीपी उत्पादन और एक्टिन रिंग विखंडन से जुड़ी है। अंत में, यह प्रोटोकॉल एक मजबूत परख स्थापित करता है जिसका उपयोग इन विट्रो में ओसी भेदभाव और कार्य के कई जैविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक संदर्भ विधि के रूप में किया जा सकता है।

इस पद्धति का उपयोग (1) स्वास्थ्य और रोगों में ओसी में अंतर करने के लिए मोनोसाइट्स को प्रसारित करने की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही (2) ओसी भेदभाव और कार्य पर चिकित्सीय उम्मीदवारों का प्रभाव। यह मजबूत ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस प्रोटोकॉल अग्रदूत कोशिकाओं से ओसी भेदभाव और परिपक्व ओसी के कार्य दोनों पर हड्डी-लक्षित उपचारों की प्रभावकारिता और तंत्र के निर्धारण को सक्षम बनाता है।

Protocol

स्कॉटिश नेशनल ब्लड ट्रांसफ्यूजन सर्विस (एडिनबर्ग) से प्राप्त बफी कोट और एनएचएस ब्लड एंड ट्रांसप्लांट (न्यूकैसल) से प्राप्त ल्यूकोसाइट शंकु ग्लासगो विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं को पूरी तरह से सहमत एनएचएस रक्त दाताओं से पूरी तरह से अनाम (गैर-पहचान योग्य) रूप में प्रदान किए जाते हैं। बफी कोट और ल्यूकोसाइट शंकु रक्त घटक स्कॉटलैंड या इंग्लैंड में एनएचएस रक्त दाता केंद्र में दिए गए एनएचएस मानक रक्त दान से उत्पादित होते हैं। रक्त दाता स्वीकृत चिकित्सा अनुसंधान अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक एनएचएस नैदानिक अभ्यास में उपयोग नहीं किए जाने वाले अधिशेष रक्त के लिए रक्त दान के समय सूचित सहमति देता है। एनएचएस रिसर्च एथिक्स कमेटी से नैतिक अनुमोदन और इन रक्त दान का उपयोग करने के लिए हस्ताक्षरित दाता सहमति फॉर्म एनएचएस रक्त दान सेवा द्वारा आयोजित किए जाते हैं। अनुमोदित चिकित्सा अनुसंधान अध्ययनों में इन सहमति वाले रक्त दान तक पहुंचने और उपयोग करने के लिए अनुमोदन राष्ट्रीय रक्त आधान सेवा (स्कॉटलैंड) और एनएचएस रक्त और परिवहन (इंग्लैंड) के मानक आंतरिक अनुप्रयोग और समीक्षा प्रक्रिया का उपयोग करके मांगा गया था और प्राप्त किया गया था। अनुमोदित चिकित्सा अनुसंधान अध्ययनों के लिए रक्त घटकों का उपयोग करने के लिए आगे एनएचएस आरईसी अनुमोदन या ग्लासगो विश्वविद्यालय नैतिक समिति की मंजूरी की आवश्यकता नहीं थी।

1. शुरू करने से पहले सामान्य नोट्स

  1. सावधानी के साथ खून से सभी काम आगे बढ़ाएं। विभिन्न संक्रामक एजेंटों के संभावित खतरों पर विचार करें जो नमूनों में मौजूद हो सकते हैं।
  2. दस्ताने और लैब कोट पहनते समय बाँझ परिस्थितियों में जैव सुरक्षा प्रयोगशाला में सभी काम सावधानी से करें।
  3. स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुसार जैव सुरक्षा निपटान करें।
  4. स्थानीय प्राधिकरण नियमों के अनुसार नमूना संग्रह से पहले उचित सहमति और नैतिक अनुमोदन प्राप्त करें।
  5. आम तौर पर, 1 एमएल ताजा रक्त 1 मिलियन पीबीसी का उत्पादन करेगा, और सीडी 14 + मोनोसाइट्स पीबीएमसी के लगभग 10% -30% के लिए जिम्मेदार हैं। इसकी तुलना में, ल्यूकोसाइट शंकु के 10 एमएल में 5 x 10 8-15 x 108 PBMCs हो सकते हैं। पीबीएमसी अलगाव पर अधिक जानकारी के लिए, पिछले प्रोटोकॉल37 को देखें।

2. पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का अलगाव।

  1. लिथियम हेपरिन संग्रह ट्यूबों में स्वस्थ दाताओं से ताजा रक्त की आवश्यक मात्रा एकत्र करें।
    नोट: उपयुक्त एंटीकोआगुलंट्स के साथ अन्य संग्रह ट्यूबों का भी उपयोग किया जा सकता है (जैसे, सोडियम हेपरिन ट्यूब)। उच्च सेल गिनती के लिए, ल्यूकोसाइट शंकु या बफी कोट का उपयोग किया जा सकता है।
  2. पीबीएमसी को अलग करने के लिए, रक्त को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे ताजा रक्त या ल्यूकोसाइट शंकु / बफी कोट के लिए क्रमशः 1: 1 या 1: 3 अनुपात में बाँझ 1 x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ पतला करें।
  3. धीरे-धीरे व्युत्क्रम द्वारा कोशिकाओं को कई बार मिलाएं।
  4. 3 एमएल घनत्व ढाल माध्यम वाले 15 एमएल ट्यूब तैयार करें। घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर धीरे-धीरे पतला रक्त के 8-10 एमएल परत करें, और बिना ब्रेक के कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: मिश्रण को रोकने के लिए घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर रक्त को सावधानीपूर्वक लागू करें। मिश्रण के परिणामस्वरूप पीबीएमसी का नुकसान हो सकता है।
  5. पाश्चर पिपेट के साथ शीर्ष परत (प्लाज्मा युक्त) को ध्यान से छोड़ दें, पीबीएमसी (सफेद, अंगूठी जैसी संरचना) युक्त इंटरफेज ़ परत के नीचे इकट्ठा करें, और इस परत को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 50 एमएल तक बाँझ 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को निलंबित करें, और पूर्ण ब्रेक के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके अवशिष्ट घनत्व ढाल माध्यम को धो लें।
  7. अवशिष्ट प्लेटलेट्स को हटाने के लिए, बिना ब्रेक के आरटी पर 10 मिनट के लिए 200 x g पर एक अतिरिक्त धीमी स्पिन के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।
  8. वैकल्पिक: लाल रक्त कोशिकाओं के कैरीओवर को हटाने के लिए, आसुत जल में लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (10x, सामग्री की तालिका) 1: 10 को पतला करें, और गोली पर पतला बफर का 3 मिलीलीटर लागू करें। मिलाएं, और ३ मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। गोली को 1x PBS के 50 मिलीलीटर तक धोएं, और पूर्ण ब्रेक के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. 1x PBS के 20 mL में पृथक और शुद्ध PBMCs को पुन: निलंबित करें और उन्हें हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके या अन्य मानक विधियों का पालन करके गिनें।
    नोट: सेल कमजोर पड़ने और सेल गिनती विधियों को सेल घनत्व और गणना डिवाइस के आधार पर तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।

3. पीबीएमसी से सीडी 14+ मोनोसाइट्स का संवर्धन

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार मानव सीडी 14 + चयन किट के साथ पीबीएमसी से सीडी 14 + मोनोसाइट्स को अलग करें।
    नोट: शास्त्रीय सीडी 14 + सीडी 16 - मोनोसाइट्स ओसी अग्रदूत35 का मुख्य स्रोत हैं; वैकल्पिक शुद्धिकरण विधियों पर विचार किया जा सकता है।
  2. 1 x 107 PBMCs को एक उपयुक्त पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब (यानी, जो चयन किट चुंबक फिट बैठता है) में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को पेलेट करें।
  3. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, सेल पृथक्करण बफर (पीबीएस, 2% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 1 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड [ईडीटीए]) में सेल गोली को 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पुन: निलंबित करें, और 10 मिनट के लिए ढक्कन के साथ प्रति 100 μL एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: कोशिकाओं को 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित किया जाता है; तदनुसार वॉल्यूम समायोजित करें।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, चुंबकीय नैनोपार्टिकल मोतियों के 10 μL प्रति 100 μL जोड़ें, और ढक्कन के साथ 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: 10 μL / mL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल और चुंबकीय मोतियों की मात्रा समायोजित करें।
  5. सेल पृथक्करण बफर के साथ मात्रा को 2.5 एमएल तक बढ़ाएं, ट्यूब को चुंबक (ढक्कन के बिना) में रखें, और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जब ट्यूब अभी भी चुंबक में है, तो व्युत्क्रम द्वारा एक निरंतर चाल से नकारात्मक कोशिका आबादी को छोड़ दें।
    नोट: यदि >2 x 108 PBMCs और एक बड़े चुंबक का उपयोग कर रहे हैं, तो निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सेल पृथक्करण बफर के साथ 5 mL या 10 mL तक शीर्ष करें।
  6. चुंबक से ट्यूब को हटा दें, और चुंबकीय मोतियों से जुड़े समृद्ध सीडी 14 + मोनोसाइट्स को सेल पृथक्करण बफर के 2.5 एमएल में पुन: निलंबित करके धो लें। पहले की तरह चुंबक के अंदर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, नकारात्मक अंश को त्याग दें, और एक और बार दोहराएं।
  7. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सभी एकत्रित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और अल्फा न्यूनतम आवश्यक माध्यम (α-MEM) के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें; सामग्री की तालिका) 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्ण α-एमईएम), और 10% एफबीएस के साथ पूरक।
    नोट: फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से एक पोस्ट-संवर्धन शुद्धता जांच की सिफारिश की जाती है, और ≥96% शुद्धता की उम्मीद की जानी चाहिए। अतिरिक्त धोने के कदम (चरण 3.6) शुद्धता बढ़ा सकते हैं।

4. विट्रो में ओसी भेदभाव।

  1. एक हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके समृद्ध सीडी 14+ मोनोसाइट्स की गणना करें।
  2. 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को पेलेट करें, और 10% एफबीएस के साथ पूरक पूर्ण α-एमईएम में 1 x10 6 सेल / एमएल पर पुन: निलंबित करें।
  3. ओसी को अलग करने के लिए, सेल निलंबन में 25 एनजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर एम-सीएसएफ जोड़ें।
    नोट: सेल निलंबन के 1 एमएल के लिए, 100 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता से M-CSF के 0.25 μL जोड़ें।
  4. सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से समरूप बनाने के लिए पाइपिंग करके मिलाएं और प्लेट 100 μL / अच्छी तरह से एक फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में 1 x 105 सेल / वेल के अंतिम सेल घनत्व में मिलाएं।
  5. कल्चर सिस्टम में मध्यम वाष्पीकरण और किनारे के प्रभाव को रोकने के लिए प्लेटेड कोशिकाओं के आसपास के कुओं में बाँझ आसुत जल के 200 μL / कुएं जोड़ें।
  6. कोशिकाओं को रात भर से, लगभग 18-20 घंटे के लिए, 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, पी 200 पिपेट का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा मध्यम (50 μL / well) के आधे हिस्से को सावधानीपूर्वक हटा दें, कुएं के तल को छूने से बचें, और 25 ng / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए 10% FBS, 25 ng / mL M-CSF और 50 ng / mL RANKL युक्त ताजा गर्म पूर्ण α-MEM के साथ प्रतिस्थापित करें।
    नोट: 1 एमएल मध्यम के लिए, 100 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता से M-CSF के 0.25 μL और RANKL के 0.5 μL जोड़ें।
  8. हर 3 दिनों में मीडिया बदलें और 7-14 दिनों के लिए कोशिकाओं को ओसी में अलग करें (चित्रा 1)।
    नोट: पूरे संस्कृति में एम-सीएसएफ और रैंकएल सांद्रता को सुसंगत रखें।

Figure 1
चित्रा 1: ओसी भेदभाव वर्कफ़्लो। पीबीएमसी से सीडी 14+ मोनोसाइट अलगाव का योजनाबद्ध अवलोकन और 7-14 दिनों के लिए एम-सीएसएफ और रैंकएल की उपस्थिति में परिपक्व ओसी में भेदभाव। आरटी = कमरे का तापमान। BioRender.com के साथ बनाई गई छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. ओस्टियोक्लास्ट के लिए ट्रैप धुंधला

  1. माध्यम को सावधानीपूर्वक हटा दें, पहले से तैयार किए गए फिक्सेटिव समाधान के 100 μL / अच्छी तरह से विभेदित अनुयायी OCs को ठीक करें, और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अनुयायी कोशिकाओं को खरोंचने से बचने के लिए कुओं के तल को न छुएं।
    नोट: फिक्सेटिव समाधान निम्नानुसार तैयार किया गया है: 12.5 एमएल साइट्रेट समाधान (ट्रैप स्टेनिंग किट में शामिल), एसीटोन का 32.5 एमएल, और 37% फॉर्मलाडेहाइड का 5 एमएल।
  2. 300 μL बाँझ आसुत जल के साथ कुओं को तीन बार धोएं। धोने के बाद सूखने वाली प्लेटों को टैप करें।
  3. निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) के अनुसार एक धुंधला समाधान तैयार करें; फास्ट गार्नेट समाधान बनाने के लिए फास्ट गार्नेट के 5 μL और सोडियम नाइट्राइट के 5 μL जोड़ें; 900 μL बाँझ आसुत जल, 10 μL नेफ्थोल, 40 μL एसीटेट घोल, 50 μL टार्टरेट घोल और 10 μL फास्ट गार्नेट घोल मिलाकर 1 मिलीलीटर धुंधला घोल तैयार करें।
  4. ताजा तैयार धुंधला घोल का 100 μL/अच्छी तरह डालें, और प्लेट को 20 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, व्युत्क्रमण द्वारा धुंधला घोल हटा दें, और प्लेट को 300 μL/अच्छी तरह से आसुत जल से तीन बार धो लें।
  6. पेपर तौलिए पर प्लेटों को टैप करके अतिरिक्त पानी निकालें। प्लेटों को खुला छोड़ दें और रात भर हवा में सूखने के लिए प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    नोट: सूखी प्लेटों को 6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। कभी-कभी, अवशिष्ट बफर मोल्ड के विकास को बढ़ावा दे सकते हैं, जो माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई देता है; इसे किसी भी समय प्रभावित कुओं को आसुत जल से धोकर और उन्हें फिर से हवा में सूखने देकर हटाया जा सकता है।
  7. पूरे कुएं की सतह को पकड़ने के लिए टाइल विकल्प के साथ एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 10x या 20x पर चित्र लें।
  8. सेल काउंटर प्लगइन के साथ एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तीन से अधिक नाभिक के साथ ट्रैप + बैंगनी दाग वाली कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाने वाले ओसी को मैन्युअल रूप से गिनें।
    नोट: प्रति कुएं ट्रैप + ओसी की संख्या दाता पर निर्भर है और लगभग 1,000 ओसी / कुएं के औसत के साथ ~ 200-1,600 ओसी / इसके अलावा, डेटा का विश्लेषण करने के लिए, ओसी संख्याओं को तीन अलग-अलग कुओं (तकनीकी प्रतिकृति) में निर्धारित किया जाना चाहिए, और औसत की गणना प्रत्येक स्थिति के लिए और प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए की जानी चाहिए।

6. हड्डी पुनर्जीवन परख

  1. कैल्शियम फॉस्फेट के साथ लेपित 96-वेल ओस्टियो-परख प्लेटों पर ताजा समृद्ध सीडी 14+ मोनोसाइट्स को 1 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्लेट करें, और 7-14 दिनों के लिए ओसी को अलग करें, जैसा कि चरण 4.1-4.8 में दर्शाया गया है, और हर 3 दिनों में माध्यम को बदलें।
    नोट: ओस्टियो-परख प्लेटों के स्थान पर डेंटिन / हाथीदांत या गोजातीय कॉर्टिकल हड्डी स्लाइस का उपयोग किया जा सकता है। यदि हां, तो अधिक जटिल सब्सट्रेट को पुनर्जीवित करने के कारण संस्कृति का कुल समय 14-21 दिनों तक बढ़ाया जाना चाहिए।
  2. अंत समय बिंदु पर, माध्यम को सावधानीपूर्वक हटा दें, कुएं के तल को छूने से बचें, और 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के साथ कोशिकाओं को लाइज़ करें। आसुत जल से कुओं को तीन बार धोएं।
  3. एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सूखी प्लेटों को स्कैन करें, और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पुनरुत्थान गड्ढों की अधिग्रहित छवियों का विश्लेषण /

7. एक्टिन रिंग फ्लोरोसेंट धुंधला

  1. 1 x 105 कोशिकाओं / कुएं के सेल घनत्व पर 18-वेल कक्ष स्लाइड में पृथक सीडी 14 + मोनोसाइट्स की प्लेट 100 μL / एम-सीएसएफ और रैंकएल की उपस्थिति में ओसी को अलग करें जैसा कि पहले वर्णित है (चरण 4.1-4.8), जिसमें हर 3 दिनों में माध्यम बदलना शामिल है।
  2. अंत समय बिंदु पर, धीरे से माध्यम को हटा दें, और प्रत्येक को 200 μL / अच्छी तरह से पूर्व-गर्म PBS, pH 7.4 के साथ दो बार धो लें। किसी भी कदम के बीच में कुओं को सूखने न दें।
  3. पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान के 100 μL / वेल के साथ नमूने को ठीक करें, और कोमल झटकों के साथ कक्षीय शेकर पर आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: मेथनॉल निर्धारण प्रक्रिया के दौरान एक्टिन को बाधित कर सकता है। इसलिए, किसी भी मेथनॉल युक्त फिक्सेटिव से बचना सबसे अच्छा है। पसंदीदा फिक्सेटिव मेथनॉल-मुक्त फॉर्मलाडेहाइड है। प्रोटोकॉल के इस चरण में उपयोग किए जाने वाले ऑर्बिटल शेकर को 10 में से 3 की पावर सेटिंग पर सेट किया गया था।
  4. पीबीएस के 200 μL/कुएं से दो बार धोएं, PBS में पतला 0.1% ट्राइटन X-100 घोल के 100 μL/वेल के साथ कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें, और कोमल झटकों के साथ ऑर्बिटल शेकर पर RT पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. पीबीएस के 200 μL/well के साथ दो बार धोएं। गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को अवरुद्ध करने और सिग्नल को बढ़ाने के लिए, 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) / पीबीएस समाधान के साथ बने ब्लॉकिंग समाधान के 100 μL / कुएं जोड़ें। कोमल झटकों के साथ एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें, और 2% बीएसए / पीबीएस समाधान में पतला फ्लोरोसेंटली संयुग्मित फेलोइडिन समाधान के 100 μL / अच्छी तरह से जोड़ें। आरटी पर 20 मिनट के लिए कोमल झटकों के साथ कक्षीय शेकर पर इनक्यूबेट करें और प्रकाश से सुरक्षित रहें।
    नोट: निर्माता की सिफारिशों के अनुसार फेलोइडिन डाई की एकाग्रता को समायोजित करें।
  7. पीबीएस के 200 μL/कुएं से दो बार धोएं, 300 nM DAPI युक्त PBS के घोल के 100 μL/कुएं के साथ नाभिक को दाग दें, और 10-15 मिनट के लिए RT पर एक कक्षीय शेकर पर कोमल झटकों के साथ और प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    नोट: डीएपीआई को 14.3 एमएम (5 मिलीग्राम / एमएल) डीएपीआई स्टॉक समाधान बनाने के लिए आसुत जल में पतला किया जाता है। स्टॉक समाधान को 300 μM की अंतिम एकाग्रता तक पतला किया जाता है। अंत में, 300 μM DAPI समाधान को पीबीएस में एक और बार 300 एनएम की अंतिम एकाग्रता तक पतला किया जाता है।
  8. 10-15 मिनट के बाद, DAPI समाधान निकालें, और इसे 100 μL / अच्छी तरह से PBS के साथ बदलें।
    नोट: चुने गए कक्ष स्लाइड के आधार पर, या तो पीबीएस की उचित मात्रा (18-वेल चैंबर स्लाइड के लिए 100 μL / well) के साथ स्टोर करें, या स्लाइड को कवरलिप्स और एक उपयुक्त माउंटिंग माध्यम के साथ माउंट करें। चैंबर स्लाइड को फ्रिज में 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। 18-वेल चैंबर स्लाइड के लिए, धोने के लिए 50-100 μL धुंधला वॉल्यूम और 200-300 μL का उपयोग करें। तदनुसार अन्य कक्ष स्लाइड आकारों के लिए स्केल अप करें। वाष्पीकरण से बचने के लिए, इनक्यूबेशन समय के दौरान एक कवर कंटेनर के अंदर कवरलिप्स रखें। ऑर्बिटल शेकर के उपयोग की सिफारिश की जाती है लेकिन आवश्यक नहीं है।
  9. उपयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और 4x से 40x के बीच आवर्धन का उपयोग करके धुंधलापन की कल्पना करें।

8. फ्लो साइटोमेट्री सॉर्टिंग के माध्यम से परिपक्व ओसी और ओसी अग्रदूतों का संवर्धन

  1. ताजा समृद्ध सीडी 14 + मोनोसाइट्स को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित करें, और उन्हें एम-सीएसएफ और रैंकएल की उपस्थिति में परिपक्व ओसी में उसी तरह से अलग करें जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 4.1-4.8)।
    नोट: 96-वेल प्लेट से बड़े प्लेट आकार तक स्केल करते समय, तालिका 1 का पालन करें; इन मात्राओं की गणना 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल समाधान से शुरू होती है और सेल-सेल संलयन के लिए एक इष्टतम घनत्व प्रदान करती है।
  2. दिन 7 पर, कुओं को एक बार गर्म पीबीएस से धो लें, और 50 μL से 1 एमएल (उपयोग की गई प्लेट आकार द्वारा निर्धारित मात्रा) जोड़ें। 20 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, प्लेटों को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांचें कि क्या कोशिकाएं अलग हो गई हैं। इसके अलावा, सभी तरफ प्लेटों को टैप करके और उन्हें ऊपर और नीचे पाइप करके कोशिकाओं को अलग करें।
  4. सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। कुओं को गर्म पीबीएस (कोई सीए 2+, कोई एमजी2 +) के साथ धो लें, और उन्हें सेल निलंबन के साथ मिलाएं। चरण 8.2-8.3 को एक या दो बार दोहराएं जब तक कि अधिकांश कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
    नोट: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए सतह धुंधला होने से पहले अनुशंसित विधि Accutase, बहुत बड़े ओसी को अलग नहीं करता है। रिकवरी दर ~ 50% -70% है।
  5. 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, पीबीएस के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा कोशिकाओं की गणना करें।
  6. 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, 1 x 105 कोशिकाओं के अनुरूप 100 μL को हटा दें, और उन कोशिकाओं को एक नई पॉलीप्रोपाइलीन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेल सॉर्टिंग बफर के 200 μL जोड़ें, और इसे बिना दाग वाले नियंत्रण के रूप में बर्फ पर अलग रखें।
  7. मृत डाई के साथ शेष कोशिकाओं को आरटी पर 10 मिनट के लिए 1:750 पर पतला किया जाता है और प्रकाश से संरक्षित किया जाता है।
    नोट: उच्च पृष्ठभूमि धुंधला होने से बचने के लिए एफबीएस की अनुपस्थिति में जीवित / मृत धुंधलापन किया जाना चाहिए।
  8. 15 एमएल संग्रह ट्यूब को गर्म सेल सॉर्टिंग बफर (1x PBS, नो Ca 2+, no Mg2+, 1% FBS, और 5 mM EDTA) के साथ जीवित / मृत सना हुआ सेल सस्पेंशन युक्त टॉप अप करें, और कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: सेल क्लंप को रोकने के लिए सॉर्टिंग बफर में ईडीटीए की उच्च सांद्रता और एफबीएस की कम सांद्रता की सिफारिश की जाती है।
  9. 1 x 105 कोशिकाओं के अनुरूप मात्रा निकालें, और उन्हें ऑस्कर आइसोटाइप नियंत्रण के लिए एक नई पॉलीप्रोपाइलीन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें। धुंधला और सेल सॉर्टिंग के लिए शेष सभी कोशिकाओं को दूसरे पॉलीप्रोपाइलीन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: पॉलीप्रोपाइलीन परीक्षण ट्यूबों का उपयोग छंटाई के लिए किया जाता है क्योंकि कोशिकाओं को पॉलीस्टाइनिन ट्यूबों की तुलना में इन ट्यूबों का पालन करने की संभावना कम होती है।
  10. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 400 x g पर घुमाएं, और व्युत्क्रम द्वारा अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  11. तालिका 2 के बाद तैयार किए गए एंटीबॉडी मास्टर मिक्स समाधान में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। ऑस्कर एंटीबॉडी के स्थान पर सीडी 14 एंटीबॉडी और ऑस्कर आइसोटाइप नियंत्रण के साथ ऑस्कर आइसोटाइप कंट्रोल ट्यूब को दाग दें।
  12. 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  13. 30 मिनट के बाद, सेल सॉर्टिंग बफर के पांच वॉल्यूम जोड़कर कोशिकाओं को धो लें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  14. कोल्ड सेल सॉर्टिंग बफर के 300-1,000 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और 100μM नोजल के साथ फिट फ्लो साइटोमेट्री सॉर्टिंग मशीन का उपयोग करके कोशिकाओं का अधिग्रहण करें।
    नोट: ओसी बहुत चिपचिपी कोशिकाएं हैं, इसलिए छंटाई से पहले उन्हें बाँझ 70 μm झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करना महत्वपूर्ण है।
  15. OCs और पूर्व-OCs को CD14-OSCAR+ के रूप में गेट करें। ऑस्कर आइसोटाइप कंट्रोल ट्यूब के आधार पर ऑस्कर + गेट सेट करें।
  16. पॉलीप्रोपाइलीन परीक्षण ट्यूबों में क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करें जिसमें 8 डिग्री सेल्सियस पर 20% एफबीएस के साथ पूरक पूर्ण α-एमईएम होता है।
  17. छंटाई के बाद, आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को पेलेट करें, कोशिकाओं की गिनती करें, और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए फिर से निलंबित करें।
    नोट: आमतौर पर, ~ 1 x 105 क्रमबद्ध प्री-ओसी / ओसी प्राप्त करने के लिए, ~ 10 x 106 कोशिकाओं से शुरू होता है जो दिन 0 पर चढ़ाया जाता है। कम वसूली दर एक्यूटेस के साथ अलगाव के दौरान सेल हानि से प्रभावित होती है और धुंधला और छंटाई के लिए प्रसंस्करण से प्रभावित होती है। बाँझ बफर और अभिकर्मकों का उपयोग करके पूरी प्रक्रिया को पूरा करने और बाँझ परिस्थितियों में काम करने की सिफारिश की जाती है।

9. माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि के लिए एटीपी परख।

  1. एम-सीएसएफ और रैंकएल की उपस्थिति में समृद्ध सीडी 14 + मोनोसाइट्स को 96-वेल प्लेट में उसी तरह से इनक्यूबेट करें जैसा कि पहले वर्णित है (चरण 4.1-4.8)। नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए तीन प्रतियों में चार अतिरिक्त शर्तों को प्लेट करें।
  2. निर्माता के मैनुअल के अनुसार ल्यूमिनेसेंस एटीपी डिटेक्शन परख किट के साथ एटीपी परख का संचालन करें। संक्षेप में, एटीपी समाधान तैयार करने के लिए, लियोफिलाइज्ड सब्सट्रेट में सब्सट्रेट बफर समाधान के 10 एमएल जोड़ें, और इसे 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दें।
    नोट: इंट्रासेल्युलर एटीपी उत्पादन को मापने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। यहां, हमने ल्यूमिनेसेंस द्वारा एटीपी उत्पादन का पता लगाने का उपयोग किया है।
  3. इनक्यूबेशन के दौरान, नियंत्रण को सीधे नियंत्रण कुओं में निम्नानुसार तैयार करें और जोड़ें: 10 मिमी और 100 मिमी पर 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज (2 डीजी), 1 μM पर ऑलिगोमाइसिन, और 1 μM ऑलिगोमाइसिन के साथ संयोजन में 100 mM 2DG। 5%CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: 2 डीजी ग्लाइकोलाइसिस को अवरुद्ध करता है, जबकि ऑलिगोमाइसिन ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का अवरोधक है। इन दो अवरोधकों के संयोजन से ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के माध्यम से एटीपी उत्पादन का पूर्ण नुकसान होता है, इस प्रकार इसका अर्थ है कि वे एटीपी परख के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। 10 mM और 100 mM 2DG नियंत्रणों के लिए, क्रमशः 0.5 μL और 5 μL 2M 2DG स्टॉक समाधान प्रति 100 μL कल्चर अच्छी तरह से जोड़ें। 1 μM oligomycin के लिए, 5 mM स्टॉक समाधान 1:100 को मध्यम में पतला करें, और समर्पित नियंत्रण कुओं में 2 μL / अंतिम नियंत्रण के लिए, 2DG के 5 μL और प्रति अच्छी तरह से पतला ऑलिगोमाइसिन समाधान के 2 μL जोड़ें।
  4. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में एटीपी समाधान के 50 μL जोड़ें, और प्रकाश से सुरक्षित 5-10 मिनट के लिए 700 आरपीएम पर शेकर पर आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  5. एटीपी परख के लिए विशिष्ट 96-अच्छी तरह से सफेद-नीचे प्लेट में सतह पर तैरनेवाला के 100 μL स्थानांतरित करें, और एक ल्यूमिनेसेंस रीडर का उपयोग करके प्लेट को पढ़ें।

Representative Results

सीडी 14+ मोनोसाइट्स से ओसी उत्पादन।
इस विधि का उद्देश्य मानव परिधीय रक्त सीडी 14+ मोनोसाइट्स से बड़ी संख्या में ओसी को आसानी से अलग करना है, आमतौर पर 1 सप्ताह में। सबसे पहले, सीडी 14+ मोनोसाइट्स को पीबीएमसी से समृद्ध किया गया था और रैंक को ऊपर उठाने के लिए रात भर एम-सीएसएफ के साथ प्राइम किया गया था, जैसा कि पहले15 बताया गया था। मोनोसाइट प्राइमिंग के बाद, ओसी भेदभाव और परिपक्वता के लिए रैंकएल की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, 25 एनजी / एमएल, 25 एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल, और 100 एनजी / एमएल की रैंकएल सांद्रता का उपयोग किया गया था। रैंकएल के अतिरिक्त ने खुराक-निर्भर तरीके से बड़े ट्रैप-पॉजिटिव मल्टीन्यूक्लियेटेड ओसी की बढ़ती संख्या का उत्पादन किया, और इसका मूल्यांकन ट्रैप स्टेनिंग का उपयोग करके किया गया था। परिपक्व ओसी को कई नाभिकों के साथ ट्रैप-पॉजिटिव कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जाता है (आमतौर पर तीन से अधिक; चित्रा 2 ए, बी और पूरक चित्र 1)। इसके अलावा, मोनोसाइट्स से ओसी भेदभाव के कैनेटीक्स की जांच 2-14 दिन की संस्कृति अवधि में ट्रैप स्टेनिंग और लाइट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की गई थी। इस उदाहरण में, 50 एनजी / एमएल रैंकएल की मध्यवर्ती एकाग्रता का उपयोग करके ओसी भेदभाव को यह आकलन करने के लिए चुना गया था कि संस्कृति में ओसी कितनी तेजी से विभेदित हैं। इन संस्कृति स्थितियों में, 5 वें दिन से बहुराष्ट्रीय ओसी दिखाई दे रहे थे, और इष्टतम भेदभाव दिन 7 (चित्रा 2 सी) पर पहुंच गया था। प्लास्टिक पर 10 दिनों से अधिक संस्कृतियों के लंबे समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप असामान्य रूप से विशाल फ्यूज्ड कोशिकाएं हुईं। इस प्रोटोकॉल में, दिन 6-8 आमतौर पर ओसी पीढ़ी के इष्टतम समापन बिंदु के रूप में उपयोग किए जाते हैं। ओसी को निर्धारित किया जा सकता है या डाउनस्ट्रीम परख के लिए उपयोग किया जा सकता है।

विभेदित ओसी का कार्यात्मक मूल्यांकन।
उत्पन्न ओसी की कार्यात्मक गतिविधि को निर्धारित करने के लिए, हमने खनिज युक्त सतह पर ओसी को अलग करके उनकी पुनरुत्थान गतिविधि की जांच की। चूंकि बड़े ओसी केवल 7 दिन की संस्कृति अवधि के बाद उत्पन्न होते हैं, और खनिज सब्सट्रेट को पुनर्जीवित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए, संस्कृतियों को 10 वें दिन तक बनाए रखा गया था। गोल छेद, या पुनरुत्थान गड्ढों का गठन, केवल कोशिकाओं वाले कुओं की खनिज युक्त सतहों पर देखा गया था, जिन्हें एम-सीएसएफ और रैंकएल दोनों के साथ इलाज किया गया था (चित्रा 3)। इस प्रकार, विघटित खनिज युक्त सतह (पुनरुत्थान गड्ढे) का प्रतिशत ओसी पुनरुत्थान क्षमता निर्धारित करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, प्लास्टिक और ग्लास चैंबर स्लाइड दोनों पर दिन 7 तक इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ओसी ने एक अच्छी तरह से संगठित एक्टिन रिंग संरचना प्रदर्शित की जिसे इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग (पूरक चित्रा 2) द्वारा देखा जा सकता है।

परिपक्व ओसी फ़ंक्शन पर एक अवरोधक का प्रभाव
उपर्युक्त संवर्धन स्थितियों का उपयोग ज्ञात ओसी अवरोधक, रोटेनोन34 की उपस्थिति में इन विट्रो उत्पन्न ओसी की कार्यात्मक क्षमता निर्धारित करने के लिए किया गया था। ओसी को 6-8 दिनों के लिए विभेदित किया गया था, और सीडी 14-ऑस्कर + ओसी और ओसी अग्रदूतों को फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 4) के माध्यम से समृद्ध किया गया था। समृद्ध कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए प्रो-ओस्टियोक्लास्टोजेनिक माध्यम (25 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ और रैंकएल) में खनिज-लेपित 96-वेल प्लेट पर 50,000 कोशिकाओं / प्रति कुएं पर चढ़ाया गया था। रोटेनोन (चित्रा 5 ए, बी) खुराक-निर्भर के साथ उपचार ने अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में खनिज युक्त सतह के पुनरुत्थान को रोक दिया, जोपिछले अध्ययनों के अनुरूप है। इसके अतिरिक्त, एटीपी उत्पादन और एक्टिन रिंग गठन के माध्यम से ओसी कार्यक्षमता का मूल्यांकन किया गया था। ओसी पुनरुत्थान का रोटेनोन-निर्भर निषेध एटीपी उत्पादन के निषेध से जुड़ा था (चित्रा 5 सी)। पुनर्जीवित ओसी अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं जो साइटोस्केलेटल संगठन को बढ़ावा देकर उनकी पुनरुत्थान क्षमता को नियंत्रित करती हैं। एलेक्सा फ्लुर 647 संयुग्मित फैलोइडिन का उपयोग परिपक्व ओसी के एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटन को रोटेनोन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत करने के लिए किया गया था। रोटेनोन ने परिपक्व ओसी (चित्रा 5 डी) के रैंकएल-व्युत्पन्न एक्टिन रिंग के विखंडन का कारण बना।

Figure 2
चित्रा 2: सीडी 14+ मोनोसाइट अग्रदूतों से ओसी कुशलतापूर्वक अंतर करते हैं। सीडी 14+ मोनोसाइट्स को चुंबकीय रूप से समृद्ध किया गया था, 96-वेल प्लेटों में 1 x 105 कोशिकाओं / कुएं पर चढ़ाया गया था, और 25 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ के साथ रात भर इनक्यूबेट किया गया था। (ए) एम-सीएसएफ-प्राइमेड मोनोसाइट्स को रैंकएल (1 एनजी / एमएल, 25 एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल, और 100 एनजी / एमएल) की बढ़ती सांद्रता के साथ उत्तेजित किया गया था, जिसे 7 वें दिन ट्रैप के लिए तय किया गया था, और दाग दिया गया था। छवियों का अधिग्रहण किया गया था, और ट्रैप + बहुराष्ट्रीय कोशिकाओं (एमएनसी) की गणना की गई थी। ट्रैप धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां पूरक चित्र 1 में दिखाई गई हैं। त्रुटि पट्टियाँ SD (n = 3) ± माध्य दिखाती हैं. डेटा का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा और होल्म-सिडक के युग्मित डेटा के लिए कई तुलना परीक्षण के साथ किया गया था; * P ≤ 0.05 और ** P ≤ 0.005. (बी) 96-वेल प्लेट के ट्रैप-दाग वाले कुएं की प्रतिनिधि छवि 7 वें दिन एम-सीएसएफ-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की तुलना में 25 एनजी / एमएल रैंक-एल के तहत ओसी / अच्छी तरह से अपेक्षित और उनकी आकृति विज्ञान की विशिष्ट मात्रा को दर्शाती है। स्केल बार: 1000 μm. (C) 50 ng / mL RANKL के तहत OC गठन की प्रतिनिधि छवियों का मूल्यांकन दिन 2 से दिन 14 तक ट्रैप स्टेनिंग के माध्यम से किया जाता है। ओसी 5 वें दिन से दिखाई दे रहे हैं। 10 दिनों के बाद विशाल असामान्य रूप से फ्यूज्ड ओसी मौजूद होते हैं। स्केल सलाखों: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीडी 14+ मोनोसाइट्स से विभेदित रेसोर्प्टिव ओसी ।पीबीएमसी से अलग सीडी 14 + कोशिकाओं को खनिज परख सतह (ओस्टियो-परख) प्लेटों पर 25 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ (एम) और रैंकएल (आर) की उपस्थिति में 10 दिनों के लिए ओसी में विभेदित किया गया था। (ए) 10 वें दिन पुनरुत्थान का विश्लेषण करने के लिए 10 गुना आवर्धन पर लिए गए प्रतिनिधि पुनर्निर्मित कुओं की छवियां (भूरे रंग में खनिज सब्सट्रेट; सफेद में पुनरुत्थान गड्ढे)। स्केल बार: 1000 μm. (B) पुनर्जीवित क्षेत्र के प्रतिशत का परिमाणीकरण। पुनरुत्थान डेटा का विश्लेषण विलकॉक्सन युग्मित विश्लेषण के साथ किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ SD (n = 7) ± माध्य दिखाती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीडी 14-ऑस्कर + ओसी का फ्लो साइटोमेट्री संवर्धन। सीडी 14 + मोनोसाइट्स को पीबीएमसी से समृद्ध किया गया था, और ओसी को पहले वर्णित के रूप में विभेदित किया गया था। अनुयायी ओसी संस्कृतियों को एक्यूटेस से अलग किया गया था और फ्लो साइटोमेट्री के लिए दाग दिया गया था। (A-C) दिन 8 पर ओसी को सीडी 14 और ऑस्कर अभिव्यक्ति के आधार पर क्रमबद्ध किया गया था। (ए) प्रतिनिधि छंटाई गेटिंग रणनीति। कोशिकाओं को एकल के रूप में गेट किया गया था, मृत धुंधलापन के लिए नकारात्मक, और सीडी 14 + ऑस्कर + (लाल) और सीडी 14 − ऑस्कर + (नीला) उपसमुच्चय क्रमबद्ध किया गया था। (बी) प्रतिनिधि प्लॉट जो रैंकएल-व्युत्पन्न ओसी (सियान) के अतिव्यापी ओएससीएआर धुंधलापन को दर्शाते हैं और एम-सीएसएफ-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (नारंगी) को नियंत्रित करते हैं। लाल रंग में रैंकएल-व्युत्पन्न ओसी का ऑस्कर आइसोटाइप-सना हुआ नियंत्रण है। (ग) क्रमबद्ध आबादी को प्लास्टिक पर चढ़ाया गया और प्रो-ओसी माध्यम (25 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ और 50 एनजी/एमएल रैंकएल) में 2 घंटे तक पालन करने की अनुमति दी गई, इसके बाद ट्रैप स्टेनिंग और विज़ुअलाइज़ेशन किया गया। प्रतिनिधि छवियां सीडी 14+ उप-समूह (लाल) में ट्रैप + कोशिकाओं की कमी दिखाती हैं और सीडी 14 - उप-समूह (नीला) में मोनो- और मल्टीन्यूक्लियेटेड ट्रैप + प्री-ओसी और ओसी की कमी दिखाती हैं। स्केल सलाखों: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: परिपक्व ओसी के कार्य का आकलन करने के लिए परख। परिपक्व OCs के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए, PBMCs से पृथक CD14+ कोशिकाओं को या तो अकेले M-CSF (M) के साथ संवर्धित किया गया या 7 दिनों के लिए RANKL (R) के साथ जोड़ा गया, OCs को फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से समृद्ध किया गया, और OCs को फिर 24 घंटे के लिए अवरोधक रोटेनोन के साथ इलाज किया गया।) और 3 दिनों के लिए रोटेनोन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक खनिज परख सतह पर सुसंस्कृत किया गया था, जिसके बाद कोशिकाओं को पुनर्जीवित क्षेत्र (सफेद में पुनरुत्थान गड्ढे) को प्रकट करने के लिए 10x पर ब्लीच और छवि बनाई गई थी। (ए) कुओं की प्रतिनिधि पुनर्निर्मित छवियां। स्केल बार: 1000 μm. (B) पुनर्जीवित क्षेत्र के प्रतिशत का परिमाणीकरण। (बी) में डेटा का विश्लेषण डन के कई तुलना परीक्षण (एन = 7) के साथ एक-तरफा एनोवा के साथ किया गया था; * P ≤ 0.05 और ** P ≤ 0.01. ±(C) अविभाजित और दिन 7 विभेदित परिपक्व OCs की कुल इंट्रासेल्युलर एटीपी सामग्री को RANKL के साथ विभेदित किया जाता है और वाहन या रोटेनोन (10 एनएम और 30 एनएम) के साथ इलाज किया जाता है। यहां, 2डीजी और ऑलिगोमाइसिन का उपयोग परख के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था और सेल लाइसिस और एटीपी परिमाणीकरण से 30 मिनट पहले जोड़ा गया था। त्रुटि पट्टियाँ SD (n = 4) ± माध्य दिखाती हैं. डेटा का विश्लेषण युग्मित डेटा के लिए एक-तरफ़ा एनोवा और डंनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ किया गया था। ** पी ≤ 0.01. (डी) एक्टिन रिंग गठन (लाल) और नाभिक (नीले) के लिए सना हुआ परिपक्व ओसी की एक प्रतिनिधि 20 x छवि, अवरोधक के साथ एक्टिन रिंग के नुकसान को दर्शाती है। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्लेट प्रारूप 96 अच्छी तरह से प्लेट 48 अच्छी तरह से प्लेट 24 अच्छी तरह से प्लेट 12 अच्छी तरह से प्लेट 6 अच्छी तरह से प्लेट
आयतन 100 μL 225–250 μL 450–500 μL 0.8–1 एमएल 1.8–2 एमएल

तालिका 1: विभिन्न प्लेट प्रारूपों के लिए सेल निलंबन की मात्रा। वॉल्यूम की गणना 1 x 106 सेल / एमएल समाधान से शुरू होती है और सेल-सेल संलयन के लिए एक इष्टतम घनत्व प्रदान करती है।

फ्लोरोफोरे, क्लोन वॉल्यूम (μL) प्रति 106 कोशिकाएँ
CD14 पीई / साइनिन 7, एचसीडी 14 5 μL
ऑस्कर एफआईटीसी, आरईए 494 10 μL
सेल सॉर्टिंग बफर 80 μL

तालिका 2: एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण समाधान।

पूरक चित्र 1: रैंकएल खुराक प्रतिक्रिया का ट्रैप धुंधला। सीडी 14+ मोनोसाइट्स को चुंबकीय रूप से समृद्ध किया गया था, 96-वेल प्लेटों में 1 x 105 कोशिकाओं / कुएं पर चढ़ाया गया था, और 25 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ के साथ रात भर इनक्यूबेट किया गया था, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। ट्रैप स्टेनिंग की प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है कि एमसीएसएफ-प्राइमेड मोनोसाइट्स रैंकएल (1 एनजी / एमएल, 25 एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल, और 100 एनजी / एमएल) की बढ़ती सांद्रता के साथ उत्तेजित होते हैं, जो 7 वें दिन ट्रैप के लिए तय और दागदार होते हैं। स्केल सलाखों: 400 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: पूरी तरह से विभेदित ओसी में अभिनय रिंग धुंधला। (ए) टीसी प्लास्टिक पर विभेदित ओसी का 10 गुना आवर्धन और एएफ 647 फेलोइडिन (लाल रंग में) के साथ दाग दिया गया। स्केल बार: 400 μm. (B) OCs का एक 40x आवर्धन ग्लास चैंबर स्लाइड पर विभेदित होता है और AF488 फैलोइडिन (पीले रंग में) से सना होता है। नाभिक DAPI से सना हुआ है, जिसे (A) में नीले रंग में और (B) में सियान में दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: ओसी भेदभाव दक्षता पर विभिन्न एफबीएस बैचों का प्रभाव। ओसी को 7 दिनों के लिए 25 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ और 50 एनजी / एमएल रैंकएल (एमआर) की उपस्थिति में सीडी 14 + मोनोसाइट्स से विभेदित किया गया था। नियंत्रण कुओं में केवल एम-सीएसएफ (एम) था। (ए) प्रतिनिधि 10x आवर्धन (स्केल बार: 400 μm) और (बी) एफबीएस के दो अलग-अलग बैचों में एक दाता से अलग ट्रैप-सना हुआ ओसी का परिमाणीकरण। त्रुटि पट्टियाँ तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के औसत ± एसडी दिखाती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इन विट्रो में बड़ी संख्या में कार्यात्मक ओसी की आसान संस्कृति और अलगाव हड्डी जीव विज्ञान और ओसी-मध्यस्थता रोगों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। शास्त्रीय रूप से, ओसी ओस्टियोब्लास्ट या स्ट्रोमल कोशिकाओं और प्लीहा या अस्थि मज्जा38,39 से हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृतियों में उत्पन्न हुए थे। ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस की समझ में एक महत्वपूर्ण सफलता ओसी गठन, भेदभाव और अस्तित्वके प्रमुख नियामक के रूप में रैंकएल की पहचान थी। रैंकएल-निर्भर संस्कृति प्रणालियों के प्रारंभिक प्रोटोकॉल ने ओसी उत्पादन 21,41,42 के लिए पीबीएमसी का उपयोग किया। हालांकि, ये मिश्रित संस्कृतियां लंबी हैं और कई भ्रामक कारक पेश करती हैं जो ओसी भेदभाव और कार्य पर प्रत्यक्ष प्रभाव ों का परीक्षण करने की क्षमता को सीमित करती हैं। यह प्रोटोकॉल मानव परिधीय सीडी 14 + मोनोसाइट्स से ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस के एक कुशल और विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल का वर्णन करता है जिसमें इष्टतम ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस 7 दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2), जो कुछ अन्य प्रोटोकॉल43,44,45,46 की तुलना में काफी तेज है।. इस प्रोटोकॉल की मुख्य विशिष्ट विशेषताएं हैं (1) शुद्ध सीडी 14 + मोनोसाइट्स का उपयोग, (2) रैंकएल के संपर्क में आने से पहले एम-सीएसएफ के साथ मोनोसाइट्स की प्राइमिंग, (3) संस्कृति की लंबाई (<7 दिन), और (4) ओसी गठन (ट्रैप स्टेनिंग) और इनहिबिटर के साथ फ़ंक्शन (पुनरुत्थान, एटीपी उत्पादन, एक्टिन रिंग पुनर्गठन) के निषेध का विश्वसनीय पता लगाना।

कार्यप्रणाली के अनुकूलन के दौरान, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं की पहचान की गई थी। यह देखा गया है कि ओसी का इन विट्रो भेदभाव काफी हद तक सीडी 14+ मोनोसाइट्स के सीडिंग घनत्व पर निर्भर है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को उच्च घनत्व (96-वेल प्लेट के 1 x 105 कोशिकाओं / कुएं में, 100 μL माध्यम में) पर बीज दिया जाता है, क्योंकि कोशिकाओं के लिए एक-दूसरे के साथ बातचीत करने में सक्षम होना और फ्यूज होने और परिपक्व ओसी बनने के लिए आवश्यक है। इसी तरह, बहुत अधिक घनत्व पर कोशिकाओं को सीडिंग करना मध्यम सीमाओं और आवश्यक स्थान की कमी के कारण उनके भेदभाव और विकास को सीमित करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ अधिकतम सफलता प्राप्त करने के लिए, घनत्व ढाल पृथक्करण को ध्यान से करना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सीडी 14 + कोशिकाओं की समृद्ध आबादी यथासंभव शुद्ध है। उदाहरण के लिए, अपर्याप्त धोने के चरणों के परिणामस्वरूप प्लेटलेट्स को हटाने की कमी होती है, जिसके परिणामस्वरूप ओसी भेदभाव47,48 को रोकता है। इसी तरह, अकेले एम-सीएसएफ के साथ उत्तेजित पृथक सीडी 14 + तैयारी में मामूली टी सेल संदूषण की उपस्थिति के परिणामस्वरूप ओसी भेदभाव हो सकता है, संभवतः टी कोशिकाओंद्वारा रैंकएल स्राव के माध्यम से। इसलिए, प्रत्येक प्रयोग के लिए एम-सीएसएफ नियंत्रण को शामिल करना महत्वपूर्ण है। नमूने की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए एक नियमित शुद्धता जांच, विशेष रूप से एक नई आइसोलेशन किट का उपयोग करते समय, की भी सिफारिश की जाती है।

इष्टतम ओसी संख्या (सीमा: ~ 200-1,600 ओसी / वेल) न्यूक्लियोसाइड और एल-ग्लूटामाइन से समृद्ध α-एमईएम माध्यम का उपयोग करके प्राप्त की जाती है। डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) और रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम सहित अन्य पारंपरिक संस्कृति मीडिया, ओसी उपज को प्रभावित करते हैं। एफबीएस का स्रोत ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को भी प्रभावित कर सकता है। एफबीएस के विभिन्न बैचों से रैंक-एल-व्युत्पन्न ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस कम हो सकता है, साथ ही एम-सीएसएफ नियंत्रणों में ट्रैप + बहुराष्ट्रीय कोशिकाओं की कम संख्या की उपस्थिति हो सकती है (पूरक चित्रा 3)। इसलिए, लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि उपयोग से पहले नए एफबीएस बैचों का परीक्षण करें और भेदभाव प्रक्रिया में भिन्नता को कम करने के लिए प्रयोगों के दौरान एक ही बैच के साथ जारी रखें। इसके अतिरिक्त, दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता, अंत समय बिंदु पर प्राप्त विभेदित ओसी की कुल संख्या के संदर्भ में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय एक सीमा का गठन करती है, उदाहरण के लिए, रोगियों के लिए स्वस्थ दाताओं की तुलना करने के लिए। इन मामलों में, बिल्कुल एक ही स्थिति और मध्यम, एफबीएस और अन्य अभिकर्मकों के समान लॉट का उपयोग करना अनिवार्य है।

इष्टतम ओसी भेदभाव और परिपक्वता के लिए एक और आवश्यक कदम रैंकएल जोड़ से पहले एम-सीएसएफ के साथ मोनोसाइट्स को भड़काना है। रैंकएल से 18-24 घंटे पहले एम-सीएसएफ के लिए कोशिकाओं के संपर्क में आने से मोनोसाइट्स को रैंकअभिव्यक्ति 15,26 को विनियमित करने में मदद मिलती है। इस समय रैंकएल को जोड़ने से खुराक-निर्भर तरीके से इष्टतम ओसी भेदभाव सुनिश्चित होता है। ओसी भेदभाव की डिग्री दाता से दाता में भिन्न होती है; हालांकि, 25 एनजी / एमएल रैंकएल आमतौर पर अधिकांश दाताओं में ओसी की उच्च संख्या को अलग करने के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, यौगिकों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए परख में 25 एनजी / एमएल रैंकएल का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि यह परीक्षण यौगिकों के बढ़ाने और निरोधात्मक प्रभाव दोनों के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करता है। अन्य संस्कृति प्रणालियों ने रैंकएल जोड़ने से पहले इनक्यूबेशन समय पहले एम-सीएसएफ का उपयोग किया है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस50 के लिए लंबे समय तक संवर्धन समय होता है। इसके अलावा, प्राइमेड मोनोसाइट्स को रात भर इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ने से उन्हें प्लेट से जुड़ने की अनुमति मिलती है, हालांकि पूरी तरह से अनुयायी अवस्था में नहीं। इसलिए, जब रैंकएल को पहली बार पेश किया जाता है, तो प्राइमेड मोनोसाइट्स की टुकड़ी और हानि को रोकने के लिए माध्यम को पूरी तरह से बदलने के बजाय बहुत सावधानी से बदलना चाहिए। मध्यम कमी से बचने और कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए माध्यम को हर 3-4 दिनों में ताज़ा करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस परख में उपयोग की जाने वाली कम मात्रा (96-वेल प्लेट में 100 μL / well) के कारण, खाली कुओं का एक फ्रेम होना अत्यंत महत्वपूर्ण है जो परख कुओं के चारों ओर एक जलीय घोल (यानी, बाँझ आसुत एच2ओ या पीबीएस) से भरे होते हैं। यह मध्यम वाष्पीकरण और किनारे के प्रभाव को रोकता है।

अंत में, चयापचय परख (जैसे, एटीपी परख) के लिए, यह जरूरी है कि कोशिकाएं प्रतिकृति के बीच विशाल मानक विचलन से बचने के लिए व्यवहार्य हों (चित्रा 5)। कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता कोशिकाओं को छांटने और क्रमबद्ध ओसी के आगे संवर्धन के लिए भी महत्वपूर्ण है (चित्रा 4)। हालांकि, इस विधि की कई सीमाएं हैं। पूरी तरह से परिपक्व ओसी बहुत अनुयायी हैं और प्लेटों से अलग करना मुश्किल है। बड़े ओसी को अलग करना अक्सर असंभव होता है, जिससे कम सेल उपज हो सकती है। इसलिए, कोशिकाओं को छंटाई के बाद और आवश्यक एकाग्रता पर चढ़ाना शुरू करने से पहले गिना जाना चाहिए। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए डाउनस्ट्रीम सतह धुंधला होने में झिल्ली परिवर्तन को रोकने के लिए ओसी को अलग करने के लिए एक गैर-एंजाइमेटिक विधि (एक्यूटेज) का उपयोग किया जाता है। सेल स्क्रैपर्स (नरम या कठोर अंत दोनों के साथ) के उपयोग का भी परीक्षण किया गया था और उच्च कोशिका मृत्यु का कारण बना। ईडीटीए समाधानों का उपयोग करके एंजाइमेटिक डिटेचमेंट का उपयोग अलग ओसी की उच्च उपज के लिए किया जा सकता है जब डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए झिल्ली अखंडता की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, ओसी को एक साथ जुड़ने से रोकने के लिए, सेल डिटेचमेंट के बाद सभी बफर में ईडीटीए की उच्च सांद्रता का उपयोग, साथ ही फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण से पहले उचित फ़िल्टरिंग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ओसी संस्कृतियां परिपक्व ओसी, ओसी अग्रदूतों और मैक्रोफेज से युक्त कोशिकाओं की एक विषम आबादी हैं। मैक्रोफेज को आसानी से ओसी से अलग किया जा सकता है, हालांकि मोनोन्यूक्लियर प्री-ओसी और मल्टीन्यूक्लियर ओसी दोनों ऑस्कर व्यक्त करते हैं और वर्तमान विधि के साथ अलग नहीं किए जा सकते हैं (चित्रा 4)। दरअसल, यह उत्तरार्द्ध मुद्दा इस पद्धति की मुख्य सीमा का गठन करता है। इसके अलावा, ओएससीएआर की कम अभिव्यक्ति एम-सीएसएफ संस्कृतियों (चित्रा 4 बी) में भी मौजूद है और मैक्रोफेज को इंगित कर सकती है जो ओसी वंश प्रतिबद्धता के लिए प्रमुख हैं। एफएमओ धुंधला संकेत के आधार पर ऑस्कर + कोशिकाओं के लिए गेट सेट करना महत्वपूर्ण है, जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स को प्रसारित करने से सक्रिय और कार्यात्मक रूप से परिपक्व ओसी के कुशल उत्पादन के लिए एक अनुकूलित और मजबूत विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल की ताकत कम समय अवधि में ओसी उत्पन्न करने और उच्च संख्या में विभेदित ओसी उत्पन्न करने की क्षमता है। यह विधि ओसी भेदभाव और कार्य को अंतर्निहित बुनियादी तंत्र की जांच के लिए रास्ता खोलती है।

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक इस काम में उनके समर्थन और सहायता के लिए स्कूल ऑफ इंफेक्शन एंड इम्युनिटी के भीतर फ्लो कोर सुविधा और ग्लासगो इमेजिंग सुविधा (जीआईएफ) को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide 18 well chamber slides ibidi 81816
8-well glass chamber slides  Ibidi  80807 
96-well TC plate  Corning  3596 
96-well osteo assay stripwell plate   Corning  3989 
Acetate solution Sigma Aldrich 386-3 from kit Cat No. 387A-1KT
Acetone  VWR  20066.330 
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit  SIGMA-ALDRICH  387A-1KT 
Alexa Fluor 488 Phalloidin Theremo Fisher - Invitrogen  A12379  AF488   
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher - Invitrogen A22287 AF647
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose  Fisher Scientific  11321867  2DG, 98% 
Alpha minimum essential medium  gibco  22571-020 
ATPlite 1step  PerkinElmer  6016731  Luminiscence ATP detection assay system 
BD FACSAria III cell sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich  A9418-100G 
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom  Greiner bio-one  655083  White-bottom plates 
Citrate solution Sigma Aldrich 91-5 from kit Cat No. 387A-1KT
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes Fisher Scientific 352054
Corning osteo assay surface multiple well plate Sigma-Aldrich  CLS3989
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell Corning CLS3989-2EA
DAPI  Theremo Fisher   D3571 
EasySep human CD14 positive selection kit  STEMCELL Technologies  17858 
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) StemCell Technologies  20110
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 Theremo Fisher - Invitrogen  65-0865-14
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  E7889-100ML 
EVOS FL auto imaging system Thermo Fisher A32678
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap Fisher Scientific 10314791
Falcon tubes 15 mL Corning  430790 
Falcon tubes 50 mL  Corning   430828 
Fast Garnet GBC base solution Sigma Aldrich 387-2 from kit Cat No. 387A-1KT
Fetal bovine serum  gibco  10500-064  FBS
Ficoll-Paque Plus  cytiva  17144003 
Formaldehyde  Sigma-Aldrich  F-8775 
Human sRANK ligand  PEPROTECH  310-01-100UG  Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)
ImageJ Image analysis software Image J version 2.9.0
L-glutamine  gibco  25030-024 
Lithium heparin tubes (9 mL)  VACUETTE  455084 
Macrophage colony-stimulating factor  PEPROTECH  300-25-100UG   M-CSF
Napthol AS-BI phosphoric acid solution Sigma Aldrich 387-1 from kit Cat No. 387A-1KT
Neubauer hemacytometer counting chamber  Camlab SKU 1127885
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes  Sigma-Aldrich  Q4876-5MG 
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit Miltenyi Biotec 130-107-661 and 130-107-617 Clone REA494
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody Biolegend 325618 Clone HCD14 
Penicilin/streptomycin  SIGMA  P0781 
PHERAstar machine and software BMG LABTECH
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)  gibco  14190-094 
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity Miltenyi Biotec 130-113-443
Sodium hypochlorite solution   Sigma-Aldrich  425044-1L 
Sodium nitrite solution Sigma Aldrich 91-4 from kit Cat No. 387A-1KT
Tartrate solution Sigma Aldrich 387-3 from kit Cat No. 387A-1KT
Triton X-100  Sigma-Aldrich  9002-93-1 
Trypan blue  Sigma-Aldrich  T8154-100ML 

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 191 मोनोसाइट्स ओस्टियोक्लास्ट पुनरुत्थान ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस।
मानव परिधीय रक्त सीडी 14 <sup>+</sup> मोनोसाइट्स से कार्यात्मक ओस्टियोक्लास्ट का भेदभाव
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Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. … More

Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes. J. Vis. Exp. (191), e64698, doi:10.3791/64698 (2023).

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