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Biochemistry

एक बंद अर्ध-स्वचालित वर्कफ़्लो का उपयोग करके नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल प्रसंस्करण

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64707
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2, 1
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

यहां, हम एक काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके बंद अर्ध-स्वचालित तरीके से बहु-स्तरीय फ्लास्क से अनुयायी कोशिकाओं की कटाई के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल को मौजूदा चरणों में कुछ संशोधनों के साथ अन्य सेल विस्तार प्लेटफार्मों से अनुयायी और निलंबन दोनों कोशिकाओं की कटाई के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) को वर्तमान में विभिन्न बीमारियों के लिए एक आशाजनक सेल-आधारित चिकित्सीय पद्धति के रूप में खोजा जा रहा है, जिसमें अगले कुछ वर्षों में नैदानिक उपयोग के लिए अधिक बाजार अनुमोदन की उम्मीद है। इस संक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए, पैमाने, लॉट-टू-लॉट प्रजनन क्षमता, लागत, नियामक अनुपालन और गुणवत्ता नियंत्रण की बाधाओं को संबोधित करना महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया को बंद करके और स्वचालित विनिर्माण प्लेटफार्मों को अपनाकर इन चुनौतियों का समाधान किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हमने काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके बहु-स्तरीय फ्लास्क से व्हार्टन जेली (डब्ल्यूजे)-व्युत्पन्न एचएमएससी (डब्ल्यूजे-एचएमएससी) को पारित करने और कटाई के लिए एक बंद और अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया विकसित की। डब्ल्यूजे-एचएमएससी को नियामक अनुरूप सीरम-मुक्त क्सीन-मुक्त (एसएफएम एक्सएफ) माध्यम का उपयोग करके विस्तारित किया गया था, और उन्होंने क्लासिक सीरम युक्त मीडिया में विस्तारित डब्ल्यूजे-एचएमएससी के लिए तुलनीय सेल प्रसार (जनसंख्या दोगुनी) और आकृति विज्ञान दिखाया। हमारे बंद अर्ध-स्वचालित कटाई प्रोटोकॉल ने उच्च सेल रिकवरी (~ 98%) और व्यवहार्यता (~ 99%) का प्रदर्शन किया। काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके धोए गए और केंद्रित कोशिकाओं ने डब्ल्यूजे-एचएमएससी सतह मार्कर अभिव्यक्ति, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू-एफ), त्रिवंश भेदभाव क्षमता और साइटोकिन स्राव प्रोफाइल को बनाए रखा। अध्ययन में विकसित अर्ध-स्वचालित सेल हार्वेस्टिंग प्रोटोकॉल को कम उत्पादन मात्रा के साथ मात्रा में कमी, धुलाई और कटाई करने के लिए विभिन्न सेल विस्तार प्लेटफार्मों से सीधे जुड़कर विभिन्न अनुयायी और निलंबन कोशिकाओं के छोटे से मध्यम पैमाने पर प्रसंस्करण के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।

Introduction

मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) ऊतक इंजीनियरिंग और सेल थेरेपी दोनों में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक महान उम्मीदवार हैं, उनकी चिकित्सीय क्षमता और विट्रो में बढ़ने के लिए उच्च आत्म-नवीकरण क्षमता को देखते हुए,जो कोशिकाओं के नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। ClinicalTrials.gov अनुसार, वर्तमान में विभिन्नरोग स्थितियों के लिए 1,000 से अधिक नैदानिक परीक्षण ों की जांच चल रही है। एचएमएससी का उपयोग करने में बढ़ती रुचि की पृष्ठभूमि को देखते हुए,निकट भविष्य में अधिक नैदानिक परीक्षण और बाजार अनुमोदन आसन्न हैं। हालांकि, एचएमएससी के विनिर्माण में बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता, उच्च जोखिम वाले कच्चे माल के उपयोग, कई खुली और मैनुअल प्रक्रियाओं के कारण संदूषण के बारे में चिंताओं के संदर्भ में कई अंतर्निहित चुनौतियां हैं, क्योंकि विनिर्माण में कई इकाई संचालन, उच्च श्रम लागत, स्केलिंग या स्केलिंग की लागत और नियामक बाधाएं 6,7,8,9,10 शामिल हैं। 11,12. ये मुद्दे वर्तमान और भविष्य के बाजार पहुंच के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बने हुए हैं।

बंद, मॉड्यूलर, स्वचालित विनिर्माण समाधानों का विकास और कम जोखिम वाले सहायक अभिकर्मकों का उपयोग इन चुनौतियों का समाधान करेगा। यह लगातार उत्पाद की गुणवत्ता सुनिश्चित करेगा, मानव त्रुटि के कारण बैच विफलताओं की संभावना को कम करेगा, श्रम लागत को कम करेगा, और प्रक्रिया मानकीकरण और नियामक अनुपालन में सुधार करेगा, जैसे कि डिजिटल बैच रिकॉर्ड रखने के संदर्भ में 8,12,13,14। कोशिकाओं की चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक खुराक प्राप्त करने में सक्षम होने के लिए, चाहे वह ऑटोलॉगस या एलोजेनिक हो, सुव्यवस्थित विनिर्माण जिसमें अपस्ट्रीम सेल विस्तार और बंद, स्वचालित तरीके से डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण शामिल है, महत्वपूर्ण है।

अपस्ट्रीम एचएमएससी विस्तार के लिए, वर्तमान में नियोजित दो सबसे आम विनिर्माण विधियां स्केल-आउट (2 डी मोनोलेयर) और स्केल-अप (3 डी माइक्रोकैरियर-आधारित निलंबन प्रणाली) 15,16,17,18 हैं। एचएमएससी विस्तार के लिए सबसे पारंपरिक और व्यापक रूप से अपनाई जाने वाली विधि कम उत्पादन लागत और सेटअपमें आसानी के कारण 2 डी मोनोलेयर-आधारित संस्कृति है।

एक कल्चर पोत के भीतर स्टैक किए गए फ्लैट सतह ट्रे से बने बहु-स्तरित फ्लास्क का उपयोग आमतौर पर एचएमएससी उत्पादन को बढ़ाने के लिए किया जाता है। ये सिस्टम आमतौर पर 1-परत से 40-परत संस्कृति जहाजों20 में आते हैं और जैव सुरक्षा अलमारियों के अंदर मैन्युअल रूप से नियंत्रित होते हैं। सेल पासिंग और कटाई के दौरान प्रसंस्करण चरणों में विस्तार मीडिया, पृथक्करण अभिकर्मक को मैन्युअल रूप से वितरित करना और डिकेनिंग करना और पूरे पोत को पाइपिंग या शारीरिक रूप से झुकाकर वॉश बफर शामिल है। इसके अलावा, कई इकाइयों को संभालना उनके सरासर आकार और वजन के कारण चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला है।

इसके बाद, बहु-स्तरीय फ्लास्क से कटाई के बाद, मीडिया एक्सचेंज के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन, सेल वॉश और वॉल्यूम में कमी पूरे सेल विनिर्माण वर्कफ़्लो21 में आवश्यक कदम हैं। पारंपरिक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूजेशन एक ज्यादातर खुली और मैनुअल प्रक्रिया है जिसमें कई कदम शामिल होते हैं, जैसे कि सेल निलंबन को बायोसेफ्टी कैबिनेट के अंदर कैप्ड ट्यूब या बोतलों में स्थानांतरित करना, कोशिकाओं को घुमाना, सुपरनैटेंट को मैन्युअल रूप से घुमाना, बफर के साथ सेल रिसस्पेंशन, और बार-बार सेल धोना। यह नाटकीय रूप से कैप्स के खुलने और बंद होने के कारण संदूषण के जोखिम और मैनुअल एस्पिरेशन / पाइपिंगप्रक्रिया के दौरान सेल पेलेट को खोने की संभावना दोनों को बढ़ाता है। एचएमएससी जैसे अनुयायी-आधारित कोशिकाओं के लिए बहु-स्तरीय संस्कृति प्रणालियों को संभालने के संदर्भ में, ऑपरेटर को सेंट्रीफ्यूज और जैव सुरक्षा कैबिनेट के बीच बार-बार बंद करने और एक ही समय में एक भारी इकाई को संभालने की श्रमसाध्य प्रक्रिया से गुजरना होगा। ये मैनुअल कदम श्रमसाध्य हैं, मानव त्रुटियों और संदूषण के संदर्भ में जोखिम पैदा करते हैं, और इसे क्लास बी के स्वच्छ कमरे के वातावरण में आयोजित किया जाना है,जो महंगा है। इसके अलावा, पारंपरिक मैनुअल सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया स्केलेबल नहीं है और सेलुलर कतरनी और तनाव का कारण बन सकती है; इस प्रकार, सेल रिकवरी, व्यवहार्यता और अवशिष्ट अशुद्धियों की वॉश-आउट दक्षता को अधिकतम करना अन्यप्रमुख चुनौतियां हैं। सेल थेरेपी के वाणिज्यिक सीजीएमपी स्केल विनिर्माण के लिए संदूषण के जोखिम को कम करने, लगातार उत्पाद की गुणवत्ता सुनिश्चित करने, श्रम और उत्पादन लागत को कम करने और प्रक्रिया विश्वसनीयता24,25 बढ़ाने के लिए बंद, मॉड्यूलर स्वचालन समाधान की आवश्यकता होती है। बहु-स्तरित फ्लास्क को बाँझ गैस विनिमय की सुविधा के लिए बंदरगाहों में से एक में बाँझ 0.2 μm फ़िल्टर होने से एक बंद प्रणाली के रूप में संभाला जा सकता है और एक दूसरा पोर्ट कनेक्टर या ट्यूब-वेल्डेड के माध्यम से सीधे सेल कटाई के लिए एक स्वचालित सेल प्रोसेसिंग उपकरण से जुड़ा होता है। हमने सेल, जीन या ऊतक-आधारित उत्पादों के निर्माण के लिए एक अभिनव बंद काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूज का मूल्यांकन करके डब्ल्यूजे-एचएमएससी पासिंग और कटाई के अधिकांश चरणों को बंद करने और स्वचालित करने की दिशा में काम किया। इस काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूज में विभिन्न प्रकार के सेल प्रोसेसिंग अनुप्रयोगों को करने की लचीलापन भी है, जैसे कि आकार के आधार पर सेल पृथक्करण, मध्यम / बफर एक्सचेंज, एकाग्रता, और विभिन्न प्रकार केसेल प्रकारों 8,26,27,28 के लिए कटाई। उपकरण एक बंद एकल-उपयोग किट का उपयोग करता है जिसे बैग स्थानांतरित करने के लिए ट्यूब वेल्डिंग या सड़न रोकनेवाला कनेक्टर का उपयोग करके बाँझ-जोड़ा जा सकता है या सीधे पसंद के किसी भी विस्तार मंच से जोड़ा जा सकता है।

इस अध्ययन में, हमने एकल-उपयोग काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन किट और बहु-स्तरित फ्लास्क के बीच बंद बाँझ कनेक्शन की अनुमति देने के लिए एक कस्टम ट्यूबिंग असेंबली तैयार की। हमने एक ही रन के भीतर पूरी तरह से बंद और अर्ध-स्वचालित तरीके से बहु-स्तरीय फ्लास्क से डब्ल्यूजे-एमएससी को एंजाइमेटिक रूप से अलग करने, धोने और कटाई करने के लिए एक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। कटाई किए गए डब्ल्यूजे-एचएमएससी को शुद्धता (सतह मार्कर विश्लेषण) और शक्ति (सीएफयू-एफ, ट्राइवंशीय भेदभाव और साइटोकिन स्राव प्रोफाइल) की विशेषता थी ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंतिम उत्पाद लॉट रिलीज के लिए महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (सीक्यूए) को पूरा करता है।

Protocol

1. संस्कृति मीडिया की तैयारी और संस्कृति जहाजों को कोटिंग

  1. मीडिया की तैयारी
    1. क्लासिक सीरम युक्त माध्यम की संरचना: क्लासिक सीरम युक्त माध्यम को अल्फाएमईएम (445 एमएल), भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (50 एमएल), और 100 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 एमएल) को मिलाकर क्लासिक सीरम युक्त माध्यम तैयार करें।
    2. पूरा SFM XF माध्यम तैयार करें।
      1. एसएफएम एक्सएफ बेसल माध्यम (500 एमएल) में एसएफएम एक्सएफ पूरक (100 एक्स) के 5 एमएल और 100 एक्स एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन ( सामग्री की तालिकादेखें) के 5 एमएल जोड़कर 500 एमएल की बोतल बनाएं।
      2. बैग के उपयुक्त पोर्ट पर 50 एमएल सिरिंज को जोड़कर एसएफएम एक्सएफ बेसल मीडियम बैग (2 एल) में कस्टम एमएससी एसएफएम एक्सएफ पूरक (100एक्स) के 20 एमएल और 100 एक्स एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन (सामग्री की तालिकादेखें) के 20 एमएल जोड़कर 2 एल मीडिया बैग बनाएं।
        नोट: संस्कृति में उपयोग करने से पहले, पूर्ण एसएफ एक्सएफ माध्यम में विकास कारक या साइटोकिन्स (माध्यम के साथ आपूर्ति नहीं की गई) जोड़ें: पीडीजीएफ-बीबी (20 एनजी / एमएल), एफजीएफ बेसिक (4 एनजी / एमएल), और टीजीएफ (0.5 एनजी / एमएल)।
  2. सीरम-मुक्त मीडिया के साथ उपयोग के लिए विट्रोनेक्टिन के साथ सेल कल्चर वाहिकाओं को कोटिंग
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर विट्रोनेक्टिन (वीटीएन-एन; 0.9 मिलीग्राम / एमएल) के स्टॉक को पिघलाएं।
    2. पिघले हुए वीटीएन-एन को 5 μg / mL की कार्यशील एकाग्रता तक पतला करने के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम (DPBS) के बिना बाँझ डलबेकको के बफर खारा का उपयोग करें।
      नोट: उपयोग से तुरंत पहले वीटीएन-एन को पतला करें, और पतला विट्रोनेक्टिन समाधान स्टोर न करें।
    3. संबंधित कल्चर पोत में पतला वीटीएन-एन समाधान के 1 एमएल / 10 सेमी2 जोड़ें; अंतिम एकाग्रता 0.5 μg / सेमी2 है। उदाहरण के लिए, टी -75 फ्लास्क (75 सेमी2) में पतला वीटीएन-एन समाधान के 7.5 एमएल जोड़ें; टी -175 फ्लास्क (175 सेमी2) में पतला वीटीएन-एन समाधान के 17.5 एमएल जोड़ें; एक मानक चार-परत बहु-स्तरीय फ्लास्क (2,528 सेमी2) में पतला वीटीएन-एन समाधान के 250 एमएल जोड़ें; और 10-परत बहु-स्तरित फ्लास्क (6,320 सेमी2) में पतला वीटीएन-एन समाधान के 630 एमएल जोड़ें।
    4. बाँझ परिस्थितियों में, कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए वाहिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: लेपित संस्कृति पोत 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है। इसे सूखने से रोकने के लिए प्रयोगशाला फिल्म के साथ कल्चर पोत लपेटें। उपयोग करने से पहले, संस्कृति पोत को कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पूर्व-गर्म करें।
    5. लेपित पोत की सतह को सूखने से रोकने के लिए वीटीएन-एन समाधान को एस्पिरेट करें, छोड़ दें, और तुरंत पर्याप्त मात्रा में कल्चर माध्यम जोड़ें।
      नोट: वीटीएन-एन को हटाने के बाद कल्चर पोत को कुल्ला करना आवश्यक नहीं है।

2. डब्ल्यूजे-एचएमएससी विस्तार।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में क्रायोवियल रखकर डब्ल्यूजे-एचएमएससी (पी 2) को तेजी से पिघलाना; शीशी को धीरे-धीरे घुमाएं जब तक कि सामग्री डीफ्रॉस्ट न होने लगे।
  2. पिघलने पर, डब्ल्यूजे-एचएमएससी को टी -175 फ्लास्क (वीटीएन-एन कोटिंग के बिना) में 5,000 कोशिकाओं / सेमी 2 पर बीज दें, और सेल विस्तार के लिए 5% सीओ2 के ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर क्लासिक सीरम युक्त माध्यम में इनक्यूबेट करें। दो मार्ग (पी 4) के बाद, विस्तारित कोशिकाओं को वांछित क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में एक कामकाजी सेल बैंक (डब्ल्यूसीबी) के रूप में बैंक करें।
  3. कुल सेल गिनती, सेल व्यवहार्यता और सेल आकार29 निर्धारित करने के लिए व्यवहार्यता और सेल गणना विधि का पालन करते हुए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल गिनती करें।
  4. पी 4 से, डब्ल्यूजे-एचएमएससी को टी -75 फ्लास्क में 5,000 कोशिकाओं / सेमी2 पर क्लासिक सीरम युक्त माध्यम या एसएफएम एक्सएफ माध्यम में कल्चर करें (एसएफएम एक्सएफ माध्यम के साथ वीटीएन-एन-लेपित फ्लास्क का उपयोग करें)।
  5. दोनों कल्चर मीडिया में कोशिकाओं को कुल तीन मार्ग (12 दिनों) के लिए बनाए रखें, और संस्कृति की शुरुआत (सेल सीडिंग के दिन) में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या से प्रत्येक मार्ग की संस्कृति के अंत में गिने गए व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके प्रत्येक मार्ग पर सेल विस्तार (गुना वृद्धि) को मापें।

3. सीड ट्रेन स्केल-आउट विस्तार

  1. टी -175 फ्लास्क में डब्ल्यूजे-एचएमएससी विस्तार
    1. क्रायोवियल को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर पी 4 पर डब्ल्यूजे-एचएमएससी को तेजी से पिघलाएं; शीशी को धीरे-धीरे घुमाएं जब तक कि घोल डीफ्रॉस्ट न होने लगे।
    2. वीटीएन-एन-लेपित टी -175 फ्लास्क में 5,000 कोशिकाओं / सेमी2 को बीज दें। कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में बढ़ने दें।
    3. इष्टतम प्रदर्शन और सेल विकास के लिए हर 2-3 दिनों में खर्च किए गए कल्चर माध्यम को ताजा तैयार किए गए पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम से बदलें।
  2. बहुस्तरीय फ्लास्क को संभालना (चित्रा 1 ए, बी)।
    1. सभी सड़न रोकनेवाला कनेक्शन एक बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए।
    2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर बहु-स्तरीय फ्लास्क को अनपैक करें।
    3. काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके द्रव हस्तांतरण के दौरान दबाव जारी करने की अनुमति देने के लिए पूर्व-निष्फल वायु फ़िल्टर (0.2 μm) को एक पोर्ट से कनेक्ट करें।
    4. कस्टम टयूबिंग सेट से बहुस्तरीय फ्लास्क कनेक्टर को दूसरे पोर्ट में फिट करें (चित्रा 1 बी)।
    5. कस्टम ट्यूबिंग की पीवीसी लाइन को 2 एल पीवीसी ट्रांसफर बैग में वेल्ड करें जिसमें पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम हो।
      नोट: गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा बहुस्तरीय प्रणाली में जोड़ने से पहले मध्यम बैग को पूरी तरह से मिलाएं। सुनिश्चित करें कि पीवीसी ट्रांसफर बैग बहु-स्तरीय फ्लास्क से अधिक लटका हुआ है।
    6. बहु-स्तरीय फ्लास्क को इसकी लंबी तरफ रखें, शीर्ष पर एयर फिल्टर के साथ (चित्रा 1 बी)।
    7. बहुस्तरीय फ्लास्क को भरना शुरू करने के लिए पीवीसी टयूबिंग पर क्लैंप खोलें। सुनिश्चित करें कि भरने के दौरान माध्यम ट्रे के बीच समतल है।
    8. एक बार जब माध्यम सभी ट्रे में पूरी तरह से समतल हो जाता है, तो पोर्ट के साथ बहु-स्तरीय फ्लास्क को अपनी छोटी तरफ घुमाएं।
    9. पीवीसी लाइन पर क्लैंप बंद करें, और एमपीसी ब्लू क्लोजर कैप के साथ ट्यूबिंग कनेक्शन को बदलकर ट्रांसफर बैग को हटा दें।
      नोट: एयर फिल्टर को न हटाएं, क्योंकि यह सेल विस्तार के दौरान गैस विनिमय की अनुमति देता है।
    10. बहुस्तरीय फ्लास्क को इनक्यूबेशन स्थिति में घुमाएं।
      नोट: फ़िल्टर और टयूबिंग कनेक्शन ऊपर की ओर होना चाहिए।
    11. बहु-स्तरीय फ्लास्क को एस्पिरेटर बोतल से जोड़कर खाली करें; इसे एस्पिरेटर बोतल के ऊपर रखें, और तरल बाहर बह जाएगा।
      नोट: गुरुत्वाकर्षण द्वारा खर्च किए गए माध्यम को पूरी तरह से बाहर निकालने के लिए बहु-स्तरीय फ्लास्क को अपनी तरफ झुकाएं। वैकल्पिक रूप से, खर्च किए गए माध्यम को कस्टम ट्यूबिंग असेंबली का उपयोग करके अपशिष्ट बोतल में डाला जा सकता है।
    12. ताजा माध्यम को फिर से भरने के लिए चरण 3.2.5-3.2.11 दोहराएं।
  3. बहुस्तरीय फ्लास्क में डब्ल्यूजे-एचएमएससी की उपसंस्कृति (टी -175 > 4-परत > 10-परत)।
    1. उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर प्री-वार्म सेल पृथक्करण अभिकर्मक (ट्राइपीएलई) और पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम।
    2. टी -175 फ्लास्क से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और फेंक दें।
    3. सेल मोनोलेयर को पहले से गर्म डीपीबीएस के साथ धोएं, एस्पिरेट करें, और छोड़ दें।
    4. प्रत्येक फ्लास्क में ट्राइपले जोड़ें, सेल मोनोलेयर का पूरा कवरेज सुनिश्चित करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. निलंबन को एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. आरटी पर 5 मिनट के लिए ट्यूब को 100-200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, एस्पिरेट करें और डीपीबीएस को छोड़ दें, और सावधान रहें कि सेल गोली को परेशान न करें।
    7. सेल गिनती के लिए पूर्व-गर्म पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम की न्यूनतम मात्रा (10 एमएल) में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
    8. ऊपर अनुभाग 2 में उल्लिखित लगभग 800 एमएल पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम के साथ एक वीटीएन-एन-लेपित चार-परत संस्कृति पोत भरें। 5,000 कोशिकाएँ/सेमी2 (यानी, 1.26 x 107 व्यवहार्य कोशिकाएँ/फ्लास्क) जोड़ें। समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए सेल सस्पेंशन को धीरे से घुमाएं।
    9. एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    10. इष्टतम सेल विकास के लिए हर 2-3 दिनों में खर्च किए गए कल्चर माध्यम को ताजा, पूर्व-गर्म पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम से बदलें जब तक कि कोशिकाएं 60% -80% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाती हैं या 10-परत बहु-स्तरित फ्लास्क में उप-सुसंस्कृत होने के लिए तैयार नहीं होती हैं।
    11. एक वीटीएन-एन-लेपित 10-परत बहु-स्तरीय फ्लास्क को लगभग 2 एल पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम से भरें, जैसा कि अनुभाग 2 में बताया गया है। 5,000 कोशिकाएँ/सेमी2 (यानी, 3.1 x 107 कक्ष/फ्लास्क) जोड़ें। समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए सेल सस्पेंशन को धीरे से घुमाएं।
    12. एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    13. इष्टतम सेल विकास के लिए हर 2-3 दिनों में खर्च किए गए कल्चर माध्यम को ताजा, पूर्व-गर्म पूर्ण एसएफएम एक्सएफ माध्यम से बदलें जब तक कि कोशिकाएं 60% -80% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाती हैं या कटाई के लिए तैयार नहीं होती हैं।

4. बंद काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके बंद अर्ध-स्वचालित डब्ल्यूजे-एचएमएससी पृथक्करण और कटाई।

  1. सिंगल-यूज़ काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन किट असेंबली
    1. एकल-उपयोग किट को ट्यूब वेल्डिंग के माध्यम से एकल-उपयोग पीवीसी ट्रांसफर बैग के साथ कनेक्ट करें, जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया कॉन्फ़िगरेशन है।
      नोट: एकल-उपयोग किट की डिफ़ॉल्ट प्रवाह दर 30-165 एमएल /
    2. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर कस्टम ट्यूबिंग असेंबली में 10-परत बहु-स्तरित फ्लास्क संलग्न करें जिसमें कॉन्फ्लुएंट डब्ल्यूजे-एचएमएससी शामिल हैं।
    3. कस्टम ट्यूबिंग असेंबली के साथ संलग्न 10-लेयर कल्चर पोत को एक बेंच पर स्थानांतरित करें, और एकल-उपयोग किट की लाइन ई (आईडी पीवीसी में 3/32) पर वेल्ड करें, जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
    4. उच्च प्रवाह एकल-उपयोग किट के लाइन जी में एक बाँझ नमूना पोर्ट को वेल्ड करना सुनिश्चित करें।
    5. इसके बाद, हार्वेस्ट लाइन एच को 50 एमएल सिरिंज के साथ फिट किए गए बाँझ ल्यूर से कनेक्ट करें।
      नोट: उपरोक्त सभी चरणों में, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक किट बैग में तरल पदार्थ को सुरक्षित करने के लिए मैनुअल क्लैंप बंद हैं।
  2. उपकरण चलाने की स्थापना करना
    1. उपकरण के पीछे टॉगल स्विच को चालू करके उपकरण " ऑन" को पावर दें।
    2. प्रदान किए गए यूएसबी-सी केबल (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके उपकरण पर लैपटॉप को यूएसबी-सी पोर्ट से कनेक्ट करें।
    3. डेस्कटॉप या प्रारंभ मेनू से काउंटरफ़्लो सेंट्रीफ्यूज ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) सॉफ़्टवेयर चलाएँ।
    4. साइन इन करने के बाद, मुख्य स्वागत पृष्ठ पर प्रोटोकॉल चुनें बटन पर क्लिक करके प्रोटोकॉल लोड करें।
      नोट: काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन हार्वेस्टिंग प्रोटोकॉल (तालिका 1) प्रोटोकॉल बिल्डर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बनाया गया था और स्थानीय रूप से संग्रहीत किया गया था।
    5. उपकरण पर नीले अनलॉक बटन को दबाएं, और कांच का दरवाजा खोलें।
    6. इकट्ठे एकल-उपयोग किट को काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम पर लोड करें।
    7. हैंगर हुक पर निलंबित बैग को इस क्रम में लटकाकर शुरू करें जो उन्हें बबल सेंसर स्ट्रिप्स पर ट्यूब पोर्ट के साथ सबसे अच्छी तरह से पंक्तिबद्ध करता है, जिसमें 10-स्तरित बहु-स्तरित फ्लास्क को एक कोण पर रखा जाता है, जैसा कि चित्र 1 बी में दिखाया गया है।
    8. किट को दो किट स्थान बटन के साथ पंक्तिबद्ध करें, पंप ट्यूबिंग को पेरिस्टालिक पंप के चारों ओर फैलाएं, और सफेद बल्ब के आकार के कनेक्टर को जगह में दबाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि दबाव सेंसर पर टयूबिंग सही ढंग से ट्यूबिंग ट्रैक में रखा गया है।
    9. काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूज चैंबर वाहक के चांदी के लीवर को उठाकर सेंट्रीफ्यूज चैंबर को संलग्न करें और लीवर को उसकी सीधी स्थिति में वापस करके इसे सुरक्षित करें।
    10. किट पर प्रत्येक पोर्ट से टयूबिंग को बबल सेंसर स्ट्रिप्स के साथ पटरियों में दबाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि बैग उलझे हुए नहीं हैं ताकि प्रोटोकॉल प्रक्रिया का आसानी से पालन किया जा सके।
    11. दरवाजे की कुंडी पर नीचे दबाकर दरवाजा बंद करें।
      नोट: पंप क्लैंप आर्म बंद हो जाएगा, सेंट्रीफ्यूज चैंबर स्पिन हो जाएगा, और वाल्व बंद हो जाएंगे। दरवाजा बंद किए बिना, सिस्टम प्रोटोकॉल को शुरू करने और चलाने में सक्षम नहीं होगा।
    12. जीयूआई पर प्रारंभ करें बटन दबाएं। एक चेकलिस्ट दिखाई देगी; पहले चार आइटम उपकरण जांच हैं, और अंतिम दो आइटम उपयोगकर्ता जांच हैं (सुनिश्चित करें कि बैग और कनेक्शन किट छवि से मेल खाते हैं, और सुनिश्चित करें कि मैनुअल क्लैंप खुले हैं)।
      नोट: उपकरण जांच के लिए, नीले चेक मार्क के बजाय लाल एक्स दिखाए जाते हैं यदि कुछ सही नहीं है।
    13. प्रोटोकॉल इनपुट स्क्रीन दिखाने के लिए पुष्टि दबाएँ ।
    14. डेटा प्रविष्टि (हार्वेस्ट वॉल्यूम) संवाद बॉक्स मान 45 mL के रूप में सेट करें, और पुष्टि करें दबाएँ.
      नोट: यदि उपयोगकर्ता-निर्मित प्रोटोकॉल में कोई चर डेटा इनपुट सेट किया गया है, तो प्रोटोकॉल इनपुट स्क्रीन को संकेत दिया जाएगा। इस प्रोटोकॉल में फसल की मात्रा को एक चर के रूप में सेट किया गया है, और उपयोगकर्ता अंतिम सेल घनत्व आवश्यकताओं के आधार पर विभिन्न संस्करणों का परीक्षण करना चुन सकता है। न्यूनतम फसल की मात्रा जो सिस्टम अनुमति देता है वह 5 एमएल है। सिस्टम प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए अधिकतम चार डेटा चर सेट करने की अनुमति देता है।
  3. प्रोटोकॉल चलाना
    1. जीयूआई पर पहल पर क्लिक करें, और प्रोटोकॉल रन शुरू करने के लिए उपकरण पर हरे रंग का स्टार्ट बटन दबाएं ( तालिका 1 देखें)।
      नोट: सिस्टम एक बफर के साथ सिस्टम में हवा को बदलकर प्राइमिंग अनुक्रम से शुरू होने वाले प्रोटोकॉल के अनुसार चरणों को शुरू करेगा।
    2. एक बार प्राइमिंग पूरी हो जाने के बाद (तालिका 1, चरण 8) सुनिश्चित करें कि खर्च किए गए माध्यम को पूरी तरह से अपशिष्ट बैग में पंप किया गया है।
      नोट: एक बार 10-परत बहु-स्तरीय फ्लास्क खाली होने के बाद, सिस्टम जीयूआई में उपयोगकर्ता को यह पुष्टि करने के लिए संकेत देगा कि पोत खाली है या नहीं। यदि पोत खाली है तो उपकरण पर "स्किप" बटन दबाएं; यदि नहीं, तो पोत से किसी भी अवशिष्ट तरल पदार्थ को निकालना जारी रखने के लिए हरे रंग के "प्ले / पॉज़" बटन दबाएं।
    3. विराम चरण 15, 19, और 22 (तालिका 1) में बहु-स्तरित फ्लास्क को उठाना और सभी ट्रे में बफर को समान रूप से वितरित करने के लिए हिलाना सुनिश्चित करें। एक बार पूरा होने के बाद, अगले चरणों के लिए 10-परत बहु-स्तरित फ्लास्क को अपनी मूल ड्रॉ स्थिति में वापस रखें।
      नोट: केवल तालिका 1 में चरण 19 के लिए, हिलाने के बाद, बहुस्तरीय फ्लास्क को सपाट रखना सुनिश्चित करें, और कोशिकाओं को अलग करने के लिए आरटी पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. चरण 20 और चरण 23 (तालिका 1) में, सुनिश्चित करें कि ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं को पूरी तरह से मध्यवर्ती बैग में स्थानांतरित किया जाता है।
    5. चरण 25 (तालिका 1) में मध्यवर्ती बैग को मैन्युअल रूप से अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. चरण 26 (तालिका 1) में, नमूना पोर्ट के माध्यम से नमूना लेने के लिए 2 एमएल लुएर सिरिंज का उपयोग करें।
      नोट: सटीक सेल गणना के लिए कम से कम तीन बार नमूना लेने की सिफारिश की जाती है।
    7. चरण 29 और चरण 30 (तालिका 1) में, द्रवित सेल बेड के स्थिर गठन की जांच करें; यह द्रवित सेल बेड के समान होना चाहिए जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है।
      नोट: यदि स्थिर द्रवीकृत सेल बेड चित्रा 1 सी में दिखाए गए के समान नहीं बनता है, तो सेल लोडिंग और धोने के चरणों के दौरान कक्ष में एक स्थिर द्रवीकृत सेल बेड (उच्च सेल रिकवरी) प्राप्त करने के लिए प्रवाह दर (जी / एफ) के लिए जी-बल के अनुपात को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। जी / एफ अनुपात कोशिकाओं के आकार और माध्यम के घनत्व पर निर्भर करता है। उच्च घनत्व वाले नमूने/वॉश बफर के लिए एक उच्च जी/एफ अनुपात की आवश्यकता होती है, जबकि कम घनत्व वाले नमूने/वॉश बफर के लिए कम जी/एफ अनुपात का उपयोग किया जा सकता है।
    8. रन रैंप टू स्टॉप स्टेप ( तालिका 1 में चरण 35) पर पूरा हो गया है, और काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम पर सभी चुटकी मान स्वचालित रूप से बंद हो जाएंगे।
      नोट: अंत में, सुनिश्चित करें कि दरवाजा खोलने से पहले प्रत्येक किट बैग में तरल पदार्थ को सुरक्षित करने के लिए मैनुअल क्लैंप बंद हैं।
    9. प्रोटोकॉल रन पूरा होने के बाद, उपकरण पर नीले अनलॉक बटन को दबाएं, और ग्लास दरवाजा खोलें। कटे हुए कंसंट्रेट के साथ सिंगल-यूज़ किट को उपकरण से बाहर निकालें।
    10. हाथ से ले जाने वाली ट्यूब सीलर का उपयोग करके फसल लाइन को सड़न रोकनेवाला रूप से सील करें। सेल गिनती और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में केंद्रित सेल फसल से भरे सील सिरिंज को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
    11. लीवर का उपयोग करके कक्ष को फिर से अलग करें, बल्ब कनेक्टर को इसकी फिटिंग से बाहर निकालें और किट को सावधानी पूर्वक दूर उठाएं, और एक बायोहेज़र्ड बैग में निपटान करें।
    12. इथेनॉल वाइप्स का उपयोग करके उपकरण को साफ करें, और दरवाजा बंद करना सुनिश्चित करें।
    13. उपकरण के पीछे स्विच बंद करने से पहले जीयूआई एप्लिकेशन को बंद करें।
      नोट: सेल हार्वेस्टिंग प्रोटोकॉल जैविक तीन प्रतियों (एन = 3) में परीक्षण किया गया था।

5. महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (सीक्यूए) मूल्यांकन।

  1. सेल पहचान सतह मार्कर (सीडी 73, सीडी 90, और सीडी 105) और गैर-स्ट्रोमल मार्कर (सीडी 34 और सीडी 45)।
    1. प्रवाह साइटोमेट्री बफर (1% बीएसए या 2% एफबीएस के साथ डीपीबीएस) की उचित मात्रा जोड़कर कटाई किए गए डब्ल्यूजे-एचएमएससी सेल निलंबन को 1 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
    2. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब या 96-वेल प्लेट में सेल सस्पेंशन के 100 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन के प्रति 100 μL में न्यूनतम 0.1 x 106 कोशिकाएं मौजूद हैं।
    3. एंटीबॉडी विक्रेता द्वारा अनुशंसित उचित कमजोर पड़ने पर नमूने में फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें।
    4. अंधेरे में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, 3 मिनट के लिए 380 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नमूने धोने के लिए फ्लो साइटोमेट्री बफर के 100 μL जोड़ें।
    6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, गोली को पीछे छोड़ दें।
    7. फ्लो साइटोमेट्री बफर के 200 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण30 के अधीन हों।
  2. कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां फाइब्रोब्लास्टिक परख (सीएफयू-एफ)।
    1. सेल निलंबन को पूर्ण संस्कृति माध्यम के 1,000 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
    2. प्लेट ~ 500 कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से 6-वेल ऊतक संस्कृति प्लेट में पूर्ण संस्कृति माध्यम में।
    3. 5% ह्यूमिडिफाइड सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10-14 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें, पीबीएस से धो लें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए मेथनॉल में 0.5% क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग दें।
    4. प्रत्येक कुएं में कॉलोनियों की गणना करें।
    5. सीएफयू-एफ दक्षता की गणना करें: कॉलोनी गठन की प्रतिशत दक्षता प्राप्त करने के लिए मूल सीडिंग संख्या द्वारा गठित कॉलोनियों की संख्या को विभाजित करें, और इसे प्रतिशत के रूप में व्यक्त करें।
  3. त्रिवंशीय विभेदन क्षमता
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 12-वेल प्लेटों में ओस्टियोजेनेसिस और एडिपोजेनेसिस भेदभाव माध्यम में बीज 5 x 103 कोशिकाएं / सेमी2 । चोंड्रोजेनेसिस के लिए, 1.6 x 107 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल तैयार करें, और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, 96-वेल प्लेटों के कुओं के केंद्रों में सेल समाधान की 5 μL बूंदों को सीडिंग करके माइक्रो मास कल्चर उत्पन्न करें।
    2. भेदभाव के दौरान, हर 3-4 दिनों में पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें।
    3. 14 दिनों के बाद (एडिपोजेनेसिस के लिए) या 21 दिनों (ओस्टियोजेनेसिस और चोंड्रोजेनेसिस के लिए), निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार वंश-विशिष्ट जैविक दाग का उपयोग करके भेदभाव के लिए संस्कृतियों की निगरानी करें। एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए, संस्कृतियों को 0.5% तेल लाल ओ समाधान के साथ दाग दें। ओस्टियोजेनेसिस के लिए, 2% अलीजारिन रेड एस समाधान का उपयोग करके धुंधला प्रदर्शन करें। चोंड्रोजेनिक भेदभाव के लिए, माइक्रो मास छर्रों को 1% एल्सियन ब्लू के साथ दाग दें।
  4. साइटोकिन स्राव प्रोफाइल।
    1. क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से या काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके पिघलाएं, और एसएफएम एक्सएफ मीडिया के साथ टी -175 फ्लास्क में 5,000 कोशिकाओं / सेमी2 को बीज दें।
    2. 4 दिनों के बाद, खर्च किए गए संस्कृति माध्यम को इकट्ठा करें, और विश्लेषण तक इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. मल्टीप्लेक्स रीडर पर साइटोकिन अभिव्यक्ति प्रोफाइल 19-प्लेक्स पैनल किट का उपयोग करके साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें।
    4. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार मल्टीप्लेक्स इम्यूनोएसे का प्रदर्शन करें।

Representative Results

डब्ल्यूजे-एचएमएससी मास्टर सेल बैंक (एमसीबी) के पिघलने के बाद क्लासिक सीरम युक्त माध्यम में लगातार तीन मार्गों (पी 1-पी 4) के लिए बनाए रखा गया था ताकि प्रयोगों के लिए पर्याप्त कार्यशील सेल बैंक (डब्ल्यूसीबी) का उत्पादन किया जा सके। पी 4 डब्ल्यूसीबी को टी -175 फ्लास्क में तीन और मार्ग (पी 4-पी 7) के लिए सीरम युक्त माध्यम और एसएफएम एक्सएफ माध्यम दोनों में पिघलाया और विस्तारित किया गया था। एसएफएम एक्सएफ माध्यम में विस्तारित होने पर डब्ल्यूजे-एमएससी अच्छी तरह से अनुकूलित हुए और सीरम युक्त माध्यम (चित्रा 2 ए) के समान स्थिर प्रसार बनाए रखने में सक्षम थे। हालांकि, एसएफएम एक्सएफ माध्यम में विस्तारित कोशिकाओं ने थोड़ा लंबा फाइब्रोब्लास्ट जैसी स्पिंडल के आकार की आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, जिसके परिणामस्वरूप सीरम युक्त माध्यम में ~ 15 μm की तुलना में ~ 17 μm के औसत का थोड़ा बड़ा सेल आकार (चित्रा 2 बी) था। तीन मार्गों में दोनों मध्यम स्थितियों में, डब्ल्यूजे-एचएमएससी लगातार ~ 2.3 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2 के अपने अधिकतम सेल घनत्व और ~ 34 घंटे के जनसंख्या दोहरीकरण समय तक पहुंच गए (चित्रा 2 सी, डी)।

एक बंद प्रणाली में बड़े पैमाने पर डब्ल्यूजे-एचएमएससी विस्तार के लिए, हमने पहले 4-लेयर फ्लास्क में और बाद में, 10-लेयर मल्टी-लेयर्ड फ्लास्क में डब्ल्यूजे-एचएमएससी का सीड ट्रेन विस्तार किया। 4 दिनों की संस्कृति के बाद लगभग 80% -90% प्रवाह पर, हमने क्रमशः 4-परत और 10-परत ढेर के लिए 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 और 2.3 x 10 8 ± 0.2 x 108 कोशिकाओं का उत्पादन किया। टी -175 फ्लास्क की तुलना में 3.6 x 10 4-3.8 x 104 कोशिकाओं / सेमी2 का उच्च सेल घनत्व पहुंच गया था, जिसका अर्थ है कि स्टैक ने सात गुना तक बेहतर सेल विस्तार की अनुमति दी।

इसके अलावा, 10-लेयर कल्चर जहाजों में विस्तारित डब्ल्यूजे-एचएमएससी को सीधे काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके काटा गया था। एकल-उपयोग किट के बाँझ कनेक्शन को उपकरण के पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करके 165 एमएल / मिनट की अधिकतम प्रवाह दर पर प्रत्यक्ष द्रव हस्तांतरण के लिए स्थापित करना आसान था। अर्ध-स्वचालित सेल कटाई प्रक्रिया को पहले एंजाइमेटिक पृथक्करण का उपयोग करके कोशिकाओं की कटाई करके, मात्रा में कमी और ध्यान केंद्रित करने के लिए कोशिकाओं को काउंटरफ्लो चैंबर में लोड करके और फिर वॉश बफर से धोकर हासिल किया गया था, जो काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन चैंबर की मात्रा का लगभग 3 गुना था। इसके अलावा, धोए गए कोशिकाओं को तब केंद्रित किया गया और प्रोटोकॉल में वांछित फसल की मात्रा पूर्व निर्धारित करने के लिए काटा गया। अर्ध-स्वचालित सेल प्रसंस्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रसंस्करण चरणों को मैन्युअल हार्वेस्टिंग वर्कफ़्लो का अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। हमने 10 गुना मात्रा में कमी हासिल की, जिसके परिणामस्वरूप सेल सांद्रता का उत्पादन 5.3 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के रूप में हुआ। प्रोटोकॉल सभी तीन स्वतंत्र रन (चित्रा 3 ए-सी) के लिए लगातार ~ 98% पर उच्च सेल रिकवरी और ~ 99% पर उच्च सेल व्यवहार्यता प्राप्त करने में सक्षम था।

हमने मैनुअल सेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके सेल फसल की महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए व्यापक सेल लक्षण वर्णन परीक्षण किया। डब्ल्यूजे-एचएमएससी की पहचान का परीक्षण करने के लिए, सेल सतह मार्करों का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, दोनों विधियों का उपयोग करके काटे गए डब्ल्यूजे-एचएमएससी ने आईएससीटी नियमों, सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 की सकारात्मक अभिव्यक्ति के साथ-साथ सीडी 34 और सीडी 45 की नकारात्मक अभिव्यक्ति के अनुसार विशिष्ट सतह मार्कर प्रोफाइल प्रदर्शित किए। इसके बाद, डब्ल्यूजे-एचएमएससी की क्लोनोजेनिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, सीएफयू-एफ परख की गई। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन से काटी गई कोशिकाओं ने मैनुअल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटी गई कोशिकाओं की तुलना में एक समान सीएफयू-एफ क्षमता प्रदर्शित की (क्रमशः 21% ± 1% बनाम 20% ± 1%)। इसके अलावा, जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है, पोस्ट-काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन-कटाई कोशिकाओं ने मैनुअल सेंट्रीफ्यूजेशन विधि में कोशिकाओं के समान एडिपोसाइट्स, ओस्टियोब्लास्ट और चोंड्रोसाइट्स में अंतर करने की क्षमता को बरकरार रखा। अंत में, हमने मल्टीप्लेक्स इम्यूनोएसे का उपयोग करके कोशिकाओं के 18 अलग-अलग साइटोकिन स्राव प्रोफाइल की जांच की। जैसा कि चित्रा 4 डी में दिखाया गया है, पोस्ट-काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके धोए गए और केंद्रित कोशिकाओं ने साइटोकिन स्राव प्रोफाइल को बनाए रखा, और प्रोफाइल कोशिकाओं को धोने / केंद्रित करने से पहले लिए गए नमूने के बराबर थे (प्री-काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन)।

कुल मिलाकर, हमने एसएफएम एक्सएफ कल्चर सिस्टम में कुशल एचएमएससी विस्तार का प्रदर्शन किया है, और बंद, स्वचालित काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके धोए गए और केंद्रित कोशिकाओं ने उच्च सेल रिकवरी और व्यवहार्यता पोस्ट-वॉश प्राप्त की और उनके फेनोटाइप और कार्यक्षमता को बनाए रख सके। इस अध्ययन में विकसित बंद अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया अंतिम डब्ल्यूजे-एमएससी रिकवरी के संदर्भ में उत्पाद की गुणवत्ता स्थिरता प्रदान कर सकती है, जैसा कि तीन स्वतंत्र रन से स्पष्ट है।

Figure 1
चित्र 1: उच्च-प्रवाह एकल-उपयोग किट विन्यास और एचएमएससी की फसल, धुलाई और एकाग्रता के लिए असेंबली। (बी) कस्टम ट्यूबिंग असेंबली के साथ उच्च-प्रवाह एकल-उपयोग किट से जुड़ा 10-परत बहु-स्तरीय फ्लास्क। (सी) काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सॉफ्टवेयर के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस में सक्षम कैमरा फ़ंक्शन के माध्यम से काउंटरफ्लो चैंबर में गठित स्थिर द्रवीकृत सेल बेड का विज़ुअलाइज़ेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीरम युक्त माध्यम और एसएफएम एक्सएफ माध्यम में सेल आकृति विज्ञान और एचएमएससी के विस्तार की तुलना। (ए) क्लासिक सीरम माध्यम और एसएफएम एक्सएफ माध्यम में एचएमएससी की प्रतिनिधि कोशिका आकृति विज्ञान। एसएफएम एक्सएफ-विस्तारित कोशिकाओं ने एक लंबी, स्पिंडल के आकार की, विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, जबकि सीरम युक्त माध्यम में विकसित कोशिकाओं ने अधिक चपटा आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया। (बी) सीरम युक्त माध्यम और एसएफएम एक्सएफ माध्यम के बीच औसत एमएससी आकार, एक स्वचालित सेल काउंटर (एन = 3) द्वारा मापा जाता है। यह देखने के लिए स्पष्ट है कि एसएफएम एक्सएफ-विस्तारित कोशिकाएं आम तौर पर विभिन्न मार्गों में सीरम-विस्तारित कोशिकाओं से बड़ी थीं। प्रति संस्कृति सतह क्षेत्र में कोशिकाओं के संदर्भ में विभिन्न मार्गों (एन = 3) (सी) में कुल सेल उपज और (डी) जनसंख्या दोहरीकरण स्तर। विभिन्न मार्गों में एसएफएम एक्सएफ माध्यम और सीरम युक्त माध्यम के बीच सेल उपज के समान स्तर प्राप्त किए गए थे। डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके संसाधित कोशिकाओं का लक्षण वर्णन । (ए) धोने और एकाग्रता से पहले और बाद में कुल व्यवहार्य कोशिकाएं। (ख) प्रतिप्रवाह सेंट्रीफ्यूजेशन प्रसंस्करण के बाद 10 गुणा मात्रा में कमी हासिल की गई थी। (सी) कोशिकाओं की कुल वसूली और व्यवहार्यता। डेटा को धोने और एकाग्रता रन के तीन जैविक प्रतिकृतियों (एन = 3) पर औसत किया जाता है। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं का विश्लेषण । (ए) फ्लो साइटोमेट्री से प्रतिनिधि डेटा। (बी) कुल सीएफयू दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। (सी) त्रिवंशीय भेदभाव की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां। (डी) साइटोकिन अभिव्यक्ति विश्लेषण काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम (एन = 3) पर कोशिकाओं को संसाधित करने से पहले और बाद में परिणाम देता है। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: प्रारंभिक प्राइमिंग चरणों सहित काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम पर ट्रिप्सिनाइजेशन, वाशिंग और एकाग्रता प्रोटोकॉल द्वारा एचएमएससी फसल का अनुक्रम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

इस काम में, हमने एक काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन उपकरण का उपयोग करके एचएमएससी पृथक्करण को बंद करने और अर्ध-स्वचालित करने और बेंच पर धोने और फसल करने की क्षमता दिखाई है। पूरे वर्कफ़्लो में महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि टयूबिंग काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम प्रोटोकॉल बिल्डर में परिभाषित पूर्व निर्धारित प्रोटोकॉल के अनुसार जुड़े हुए हैं। सेटअप और ऑपरेशन सरल हैं, और किट असेंबली से सेल फसल तक 10-लेयर फ्लास्क से लगभग 2 एल कल्चर को संसाधित करने में लगभग 60 मिनट का समय लगा। इस वर्कफ़्लो में सीमित चरणों में से एक बहु-स्तरित फ्लास्क से काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन उपकरण से जुड़े ट्रांसफर बैग में द्रव हस्तांतरण है। उच्च-प्रवाह एकल-उपयोग किट को केवल 165 एमएल / मिनट की अधिकतम प्रवाह दर पर चलाया जा सकता है, और यह प्रसंस्करण के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, उदाहरण के लिए, 40-परत फ्लास्क। द्रव हस्तांतरण की प्रक्रिया को तेज करने के लिए, बाहरी उच्च-प्रवाह दर पंपों का उपयोग ट्रिप्सिनाइज्ड सामग्री को पहले एक ट्रांसफर बैग में स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है, इसके बाद काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करके ट्रांसफर बैग से कोशिकाओं को धोने / ध्यान केंद्रित करने और कटाई करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को 4-परत से 10-परत बहु-स्तरित फ्लास्क तक पासिंग कोशिकाओं के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम को पिघले हुए एचएमएससी को धोने और बीज ट्रेन शुरू करने के लिए बहु-स्तरीय फ्लास्क में सीधी फसल और मध्यम सूत्रीकरण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन चैंबर में द्रवीकृत बिस्तर बनाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या लगभग 30 मिलियन कोशिकाएं हैं, और प्रति बैच प्रक्रिया के लिए अधिकतम अनुशंसित मात्रा 20 एल है।

वर्तमान में, जैव सुरक्षा कैबिनेट में बहु-स्तरीय फ्लास्क के लिए कस्टम ट्यूबिंग असेंबली का लगाव और घटकों के कुछ हिस्सों का ऑटोक्लेविंग सीजीएमपी सेटिंग में वांछनीय नहीं है। एक विकल्प के रूप में, एक कस्टम गामा-स्टरलाइज्ड टयूबिंग असेंबली को आपूर्तिकर्ताओं को आउटसोर्स किया जा सकता है। बहु-स्तरीय फ्लास्क प्रदान करने वाले आपूर्तिकर्ता वांछित टयूबिंग असेंबली के साथ फ्लास्क को पूर्व-फिट करने का विकल्प भी प्रदान करते हैं, जिसमें 0.2 μm फ़िल्टर और पूरे संगठन का गामा-नसबंदी शामिल है। यह सुनिश्चित करेगा कि बहुस्तरीय फ्लास्क और संलग्न टयूबिंग वास्तव में बंद हैं, जिसका अर्थ है कि प्रक्रिया को क्लास सी साफ कमरे की सेटिंग में बेंच पर पूरा किया जा सकता है।

काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम का उपयोग करने वाली यह प्रक्रिया एक बहु-स्तरीय पोत में अनुयायी-आधारित सुसंस्कृत कोशिकाओं तक सीमित नहीं है और इसे गतिशील (हलचल-टैंक या तरंग बायोरिएक्टर) और स्थिर (गैस-पारगम्य) निलंबन-आधारित सेल विस्तार प्लेटफार्मों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से, 3 डी माइक्रोकैरियर संस्कृतियों में विस्तारित एचएमएससी के लिए, प्रोटोकॉल को माइक्रोकैरियर से अलग एचएमएससी को फसल, धोने और तैयार करने के लिए काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन सिस्टम पर अनुकूलित किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, बेहतर प्रक्रिया मजबूती और विश्वसनीयता के साथ ट्रांसलेशनल सेलुलर थेरेपी विकसित करने में बढ़ती रुचि ने बंद, स्वचालित सेल प्रोसेसिंग प्लेटफार्मों के विकास को जन्म दिया है। ये प्रणालियां अनिवार्य हैं, क्योंकि वे हैंडलिंग चरणों की संख्या को कम करते हैं, बाँझ कनेक्शन द्वारा संभावित संदूषण को रोकते हैं, और श्रम को कम करके और स्वच्छ कमरेकी जगह के प्रभावी उपयोग को बढ़ाकर विनिर्माण लागत को कम करते हैं। इसके अनुरूप, कई सेल थेरेपी उत्पाद डेवलपर्स जो अपने उपचारों का अनुवाद करने के लिए नियामक अनुमोदन की मांग कर रहे हैं, प्रक्रिया को बंद करने और प्रक्रिया विकास चरण14,31,32 के रूप में पूर्ण स्वचालन या अर्ध-स्वचालन को लागू करने के महत्व से अवगत हैं।

नियामक-अनुकूल एसएफएम एक्सएफ माध्यम के उपयोग के साथ, और 21 सीएफआर जीएमपी भाग 11 और अंतर्राष्ट्रीय गुणवत्ता दिशानिर्देशों के अनुरूप सहायक अभिकर्मकों के साथ, यह अर्ध-स्वचालित प्रक्रिया नैदानिक विनिर्माण के लिए आसानी से उपयुक्त होगी। हमने बंद प्रक्रिया की प्रजनन क्षमता और डब्ल्यूजे-एमएससी की गुणवत्ता के रखरखाव को दिखाया है। बहु-स्तरीय फ्लास्क में अनुयायी-आधारित कोशिकाओं के संवर्धन की दक्षता और सुरक्षा में सुधार से न केवल एचएमएससी थेरेपी क्षेत्र को बल्कि सेल लाइन बैंकिंग और अनुयायी वायरस उत्पादन में कंपनियों को भी लाभ होगा।

Disclosures

पी.जे., ए.बी., आर.एल., और जे.एन. थर्मो फिशर साइंटिफिक के कर्मचारी हैं। ए.एल. और एस.ओ. के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ए*स्टार, सिंगापुर से इंडस्ट्री अलाइनमेंट फंड प्री-पोजिशनिंग (आईएएफ-पीपी) फंडिंग (एच18/01/ए0/021 और एच18/एएच/ए0/001) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L PVC transfer bag TerumoBCT BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5 Merck 101647
Alizarin-Red Staining Solution Merck TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody Biolegend 344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System Thermo Fisher Scientific A47679 Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet Sigma-aldrich C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific A1285601 no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) Thermo Fisher Scientific A27940
CTS TrypLE Select Enzyme Thermo Fisher Scientific A1285901
Custom tubing assembly Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) N/A Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter) Pall KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12662029 Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic Thermo Fisher Scientific PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323203
FITC anti-human CD45 Antibody Biolegend 304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400109
Hi-Flow Single Use Kit Thermo Fisher Scientific A46575 Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems  Thermo Fisher Scientific 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000 Chemometec NC-3000
Oil red O staining solution Merck 102419
PDGF-BB Thermo Fisher Scientific PHG0045
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody Biolegend 343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays Thermo Fisher Scientific Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A 
Sample port Thermo Fisher Scientific A50111 Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation Thermo Fisher Scientific A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) Thermo Fisher Scientific ME20236L1 Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10072-01
T175 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 159910
T75 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 156472
TGFβ1 Thermo Fisher Scientific PHG9204
WJ MSCs  PromoCell (#C12971; Germany) Human mesenchymal stem cells
αMEM media Thermo Fisher Scientific 12571063 With nucleosides

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References

  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24 (2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320 (2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101 (2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).

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