Summary
本プロトコルは、乳頭 を介した ウイルスベクターの乳管内注射を記載し、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に送達する。
Abstract
マウス乳腺は、上皮細胞が並ぶ管樹で構成され、各乳首の先端に1つの開口部があります。上皮細胞は乳腺機能に大きな役割を果たしており、ほとんどの乳腺腫瘍の起源です。目的の遺伝子をマウス乳腺上皮細胞に導入することは、上皮細胞における遺伝子機能を評価し、マウス乳腺腫瘍モデルを作成する上で重要なステップです。この目標は、目的の遺伝子を運ぶウイルスベクターをマウス乳管樹に管内注射することによって達成できます。注入されたウイルスはその後乳腺上皮細胞に感染し、目的の遺伝子を持ち込みます。ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノウイルス関連ウイルス(AAV)であり得る。この研究は、ウイルスベクターのマウス乳管内注射を通じて、目的の遺伝子が乳腺上皮細胞にどのように送達されるかを示しています。 GFP を保有するレンチウイルスは送達された遺伝子の安定した発現を示すために使用され、 Erbb2 (HER2 / Neu)を運ぶレトロウイルスは癌遺伝子誘発性の非定型過形成病変および乳腺腫瘍を示すために使用されます。
Introduction
乳腺の上皮細胞は、これらの腺の機能に大きな役割を果たしており、乳がんの起源の主要な細胞です。乳腺生物学および腫瘍形成の研究は、しばしばこれらの細胞への目的の遺伝子の送達を必要とする。各マウス乳腺は、乳頭の先端に単一の開口部を有する上皮細胞によって裏打ちされた管樹を含む。この構造により、乳腺上皮細胞はウイルスベクターに容易にアクセスでき、乳管内注射 を介して 乳管樹の内腔に送達することができます1。
乳管内注射の技術は、もともとヤギ、ウサギ、ラットなどのはるかに大きな動物に使用されていました1。マウスのようなはるかに小さな動物の場合、管内注射には多くの繊細なツールとオペレーターのより多くの練習が必要です。マウスの乳管内注射には2つのアプローチがあります。1つは乳首注射1です。もう1つは、外科的曝露後の#3または#4乳腺の一次管の直接注射です1。最初の手法は非侵襲的で、オペレーターが十分に訓練されると高速であるため、この手法がより一般的に使用され、この記事で詳しく説明します。
目的の遺伝子がマイクロインジェクション2,3,4によって受精卵の段階で導入される広く使用されている従来のトランスジェニックマウスモデルと比較して、管内ウイルス注入法による遺伝子送達には、以下を含む多くの利点があります。(2)目的の遺伝子によって課せられる乳腺の正常な発達に対する潜在的な障害を回避します。(3)出生後任意の時期に目的の遺伝子を導入する;(4)目的の遺伝子を2つ以上容易に同時導入できる;(5)感染した癌遺伝子を運ぶ細胞は正常細胞に囲まれているため、自然の腫瘍形成プロセスをよりよく模倣します。(6)TVA(腫瘍ウイルスA、鳥類細胞表面タンパク質およびレトロウイルスRCASベクターの受容体)技術5と組み合わせて、目的の遺伝子を特定の細胞集団に導入して、腫瘍形成の細胞起源を研究し、乳腺における細胞系譜追跡アッセイを実施することができる6、7、8、9.
レトロウイルス10、レンチウイルス11、12、アデノウイルス13、およびアデノウイルス関連ウイルス(AAV)14に由来する任意のベクターを、遺伝物質の管内送達に使用できます。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムに永久に組み込まれます。これにより、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に安定して導入します。レンチウイルスは遭遇する任意の細胞のゲノムに組み込むことができるが15、レトロウイルスの効率的なゲノム統合には標的細胞の増殖が必要である16。アデノウイルスおよびAAVベクターは感染細胞のゲノムに組み込まれないため、目的の遺伝子を一時的に発現するだけです17,18。この特徴は、フロックス腫瘍抑制遺伝子を欠失させるために、Creなどの目的の遺伝子を短時間だけ発現させる必要がある場合に有利となり得る。
レンチウイルス、アデノウイルス、およびAAVは、遭遇するマウス細胞に感染します。しかし、管腔上皮は基底膜によって間質からさらに分離されている下にある基底層から大部分が絶縁されているため、管内注射は感染を主に乳がんの起源の初代細胞である管腔上皮細胞に限定します。この管腔上皮層内には、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞のいくつかのグループを含む、異なる細胞サブタイプもあります。管腔細胞集団内の特定の細胞サブセットに感染するために、TVA技術が使用され得、これを用いて、トリ白血病ウイルス由来RCASベクター5、10または偽型レンチウイルスベクター11が、幹細胞6または特定の前駆細胞6においてのみ活性であるプロモーターなどの細胞型特異的プロモーターの制御下でTVA導入遺伝子を有するマウスにおいてTVAを発現する細胞に選択的に感染する、7または肺胞細胞8またはWnt経路活性細胞9。
このプロトコルは、ウイルスベクターの管内注射を通じて乳腺上皮細胞に目的の遺伝子を導入する技術を提示します。次に、導入された遺伝子の発現および結果として生じる過形成病変および腫瘍の検出が実証される。
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Protocol
マウスを用いた全ての手順は、施設動物管理使用委員会が承認した動物プロトコルに準拠して実施した。本研究では、9〜12週齢のFVB / NまたはMMTV-tva 雌マウスを使用しました。マウスは、商業的または自作的に入手した( 材料表参照)。Lenti-EGFP (FUCGW)およびRCAS-Erbb2(Neu) ウイルスを使用した。ウイルス調製および力価決定は、以前に公表された報告10、12に従って行った。
1.シリンジの準備
- 33Gの金属製ハブニードル( 材料の表を参照)を長さ約1cmにカットします。オートクレーブ処理後、針と50 μLシリンジを70%アルコールで保管します。
- アルコールから注射器と針を取り出します。残りのアルコールを注射器と針から押し出します。オートクレーブ滅菌された吸収性ベンチパッド上で空気乾燥するためにシリンジを分解します。
- 乾燥後にシリンジを組み立てます。
2.ウイルスの準備
- 必要に応じて1つまたは複数のウイルスストックチューブを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上でウイルスを解凍します。
注:感染する細胞の数によっては、この時点で1x PBSを使用してウイルスを目的の力価に希釈する必要がある場合があります。 - ピペットチップをブロモフェノールブルー粉末に1cmの深さまで浸して、ブロモフェノールブルーを追加します( 材料の表を参照)。次に、付着した微量のブロモフェノールブルーをウイルス懸濁液に入れます。
注:本研究では、ウイルスストックは通常チューブあたり200 μLであるため、最終的な色素濃度は約0.2%(0.2 μg / 100 μL)です。ブロモフェノールブルーは、1250 Wの高出力で45秒間マイクロ波放射で滅菌する必要があります(材料の表を参照)。手順全体を無菌環境で運ぶようにしてください。 - ブロモフェノールブルーを10回上下にピペッティングしてウイルス溶液と混合します。
- ウイルスを氷の上に置き、氷のバケツをビバリウムに持って行きます。
3.動物の準備
- 2 μL / gの麻酔薬(37.6 mg / mLケタミン、1.92 mg / mLキシラジン、および0.38 mg / mLアセプロマジン、 材料の表を参照)の腹腔内注射により、雌マウスを麻酔します。.つま先のつまみで麻酔の深さを確認します。麻酔下での乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。
注意: マウスは、十分な麻酔下でつま先のつまみに反応しない必要があります。イソフルランはまた、マウスを麻酔するために使用され得る。 - マウスを暖かいパッドの上に仰臥位にし、粘着テープを使用して四肢すべてをベンチに取り付けます。
- 注射する乳首を1つ(または複数)特定します(本研究では4番が好ましい)。ハサミを使って周囲の髪をトリミングして露出させます。
- 70%アルコールとヨードフォア綿棒を乳首領域に3ラウンドで塗布し、乳首をきれいにして露出させます。
4.ウイルスの管内注射
注意: 拡大lamp 乳首の開口部を視覚化するために使用できます。
- 拡大鏡ランプの下に小さな中央管開口部が見えるまで、滅菌マイクロダイセクションスプリングはさみを使用して乳首の遠位先端を横断します( 材料の表を参照)。
- 10 μLのウイルス/ブロモフェノールブルー混合物をシリンジに入れます。
注:このデモンストレーションでは、Lenti-EGFP (FUCGW)とRCAS-Erbb2(Neu) を使用しています。 - 拡大鏡ランプを使用して、針を乳首の開口部に慎重に挿入します。針の向きは、主管に合わせて内側から外側にわずかに調整されます。
- 10 μLのウイルス全体をダクトツリーに注入します。
注:注射が成功すると、皮膚の下のダクトが青くなるはずです。局所的な色の変化の抵抗または外観は、注射の失敗を示します。 - マウスが完全にウェイクアップするまで(~30-60分)、45°Cに設定されたスライドウォーマーにマウスを置きます。
5. 蛍光実体顕微鏡による感染細胞の検出
- GFPまたは他の蛍光遺伝子を搭載したウイルスを注射してから3〜5日後、4 uL / gの麻酔薬(37.6 mg / mLケタミン、1.92 mg / mLキシラジン、および0.38 mg / mLアセプロマジン)を過剰投与してマウスを安楽死させます。
- 胸腔を開きます。はさみを使用して、腹側の中央線に沿って、および上肢と下肢に沿って皮膚を切ります。皮膚を持ち上げて乳腺を露出させます。
- 鉗子とはさみを使用して、注射した乳腺を皮膚から取り除きます。また、コントロールとして注射されていない腺を取り除きます。
- 乳腺をスライドガラスの上に置き、腺を元の形に広げます。
- 蛍光実体顕微鏡で腺を観察し、画像化します。
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Representative Results
代表的なデータは、管内注射の成功、ウイルス感染の成功、および乳腺腫瘍形成に対する送達された遺伝子の影響を示すためにここに提示されています。注入されるウイルスの量は、各実験の目的に合わせて調整する必要があります。乳管樹がどれほど広範囲に感染するかを説明するには、GFPなどの画像化可能な遺伝子を運ぶ大量のウイルスを使用する必要があります。一方、自然な自発的な腫瘍形成を模倣するには、癌遺伝子を保有する少量のウイルスを使用して、少数の細胞のみが感染し、前癌病変、最終的には浸潤癌に進化するようにする必要がありますそうでなければ完全に正常な乳腺の分野で。
膵管内注射の成功は、乳腺を露出させ、青い管の木を観察することですぐに確認できます(図1)。Lenti-EGFP(FUCGW)ウイルス(~106 IU)12を注射してから2〜5日後に、乳腺上皮細胞感染をホールマウント調製物とそれに続く蛍光実体顕微鏡下で観察することによって評価することができます(図2)。あるいは、ウイルスによって産生される蛍光タンパク質または細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のために6、7、19、感染腺および非感染腺を(陰性対照として)収集し、単一細胞懸濁液に処理して、ウイルス感染の速度を推定することができます(図3).ウイルス感染を検査/定量化する別の方法は、4%パラホルムアルデヒド(またはホルマリン)を使用して感染および非感染コントロール腺を固定し、それらをパラフィン包埋ブロックに加工し、得られた切片をウイルス産生遺伝子産物およびHAやFLAG20,21などのエピトープタグで染色することです。
ウイルスに感染した細胞が増殖して前癌病変を形成し、次に腫瘍を形成するかどうかは、送達される癌遺伝子の効力と注入されるウイルスの量に依存します。PyMTや活性化RASなどの強力な癌遺伝子の場合、数日で早期病変が形成され、数週間で腫瘍が出現します10(Buら、未発表の観察結果)。活性化されたERBB2は数週間で前癌病変を引き起こし、数ヶ月で腫瘍を引き起こします10、22、23(図4)、活性化されたPIK3CAは約5か月の潜伏期間の中央値で腫瘍につながります24。一方、Wnt1はかなりゆっくりと腫瘍を引き起こします:感染したマウスの約20%だけが20ヶ月後に腫瘍を発症しました21。
図1:正常に注入された乳管樹。 画像は、9週齢のFVB / N雌マウスの4番乳腺の管内注射の直後にキャプチャされました。矢印は4番の乳首の位置を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光実体顕微鏡による感染細胞の検出。 (A)注射されていない対側腺を対照として使用する。(B)蛍光実体顕微鏡で撮影した画像は、感染した乳管樹を示しています。10週齢のFVB/Nマウスの3番乳腺にLenti-EGFP(FUCGW)ウイルス(~106 IU)を管内注射した。 注射した乳腺は注射の5日後に採取した。スケールバー:1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:レンチウイルスによって産生されたEGFPのフローサイトメトリー分析による感染細胞の定量。フィコエリスリン(PE)チャネルを使用して、自己蛍光シグナルを明らかにしました。反対側の未注射乳腺を陰性対照として用いた。12週齢のFVB/N雌マウスから注入した乳腺をLenti-EGFP(~106 IU/腺)の管内注射の2.5日後に採取し、単一細胞懸濁液に加工した。 次いで、単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析し、GFP陽性細胞を検出した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:早期病変および腫瘍におけるウイルス発現癌遺伝子産物の免疫組織化学的確認。 (A)MMTV-tvaマウスへのRCAS-Neu(HA)106IUの管内注射の14日後に、早期病変を含む#4乳腺を採取しました。免疫組織化学染色を用いてHAタグを検出した。(B)MMTV-tvaマウスの#4腺に104IUのRCAS-Neu(HA)を管内注射してから1年後に腫瘍を採取しました。注射時のマウス年齢:12週間。スケールバー:20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、マウス乳腺上皮細胞に遺伝子を導入するためのウイルス管内注射技術を示し、散発性乳癌をモデル化する。通常、少なくとも5週以上のマウスは、乳腺が発達した後に発癌過程が始まるように注射される。その上、5週齢未満のマウスの乳頭開口部は、注射するには小さすぎることがよくあります。一方、非常に古いマウスの乳首は時々退化しており、切断では管開口部が明らかにならないことがあります。また、一部のトランスジェニックまたはノックアウト腫瘍モデルの乳首は、生殖細胞系列の遺伝子変異によって引き起こされる異常な乳腺の発達のために注射が困難な場合があることに注意することも重要です。
ウイルスの取り扱いに標準的な個人用保護具(PPE)の使用を練習することに加えて、実験者の手に偶発的な針刺しがつかないように注意する必要があります。鳥白血病ウイルスがヒトに感染するという証拠はありませんが、げっ歯類の癌モデリングに使用されるレンチウイルスはヒトにも感染する可能性があります。偶発的な感染からのこの保護は、ウイルスが強力な癌遺伝子25を持っている場合に特に重要です。
目的の複数の遺伝子を上皮細胞に送達する必要がある場合、それらは、個々の遺伝子を運ぶ異なるベクターの混合物によって、または試験されるすべての遺伝子を運ぶように設計されたベクターによって送達することができる。前者の方法は以前に生成されたウイルスを利用することができますが、重感染は感染した集団のごく一部でのみ発生します。一方、後者のアプローチでは、多くの場合、新しいウイルスを構築する必要がありますが、共感染は保証されています。
遺伝子改変マウスモデル(GEMM)と比較して、管内注射技術は、目的の遺伝子を乳腺上皮細胞に送達するためのより優れた時空間柔軟性を提供します。この柔軟性は、ほとんどの乳がんが成人期に遺伝的変化に苦しむ体細胞に由来するため、患者の腫瘍形成をよりよく模倣することを促進します5。時空間制御は、乳房腫瘍形成に対する細胞サブタイプの寄与の研究にも役立ちます6、7、9、26、27、28。
管内注射技術は、主にウイルスベクターを有する人工プロモーターによって駆動される外因性遺伝子を送達するために使用されてきた。癌遺伝子がこのように送達されると、その転写は自然に変異した内因性癌原遺伝子の転写とは異なります。そして、この違いはその後、癌の形成、進行、および治療への反応に影響を与える可能性があります。この懸念を克服するために、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集成分を担持するベクターを使用して、目的の内因性遺伝子を編集することができる29,30。私たちは最近、この戦略を改善し、非常に柔軟で効率的なものにしました(Bu et al.、未発表の結果)。この遺伝子編集の進歩により、管内注射技術は癌モデリングのためのさらに強力なツールになります。
結論として、ウイルスベクターの管内注射は、ヒト乳がんの形成を厳密に模倣した乳がんのマウスモデルを生成するための強力な技術です。この技術とTVAテクノロジーおよびCRISPR編集を組み合わせることで、乳がんの形成を理解する上でこの用途の広い方法がさらに可能性を解き放ちます。これらのモデルは、乳がん予防における新しい戦略をテストするための貴重なリソースも提供します。
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Disclosures
両方の著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この原稿に対する有益なコメントをくださったゲイリー・チャムネス博士に感謝します。この研究は、国防総省(DOD)のCDMRP BC191649(YL)およびBC191646(YL)、ならびに国立衛生研究所(NIH)CA271498(YL)の支援を受けました。著者らは、SPORE P50CA186784がサポートするブレストセンター病理学コア施設、およびジョエルM.セダーストロムの支援を受けてCPRIT-RP180672、NIH CA125123、およびRR024574によってサポートされているサイトメトリーおよびセルソーティングコアに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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