Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.
Abstract
בלוטות החלב של העכבר מורכבות מעצים צינוריים, המרופדים בתאי אפיתל ויש להם פתח אחד בקצה כל פטמה. תאי האפיתל ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטת החלב והם המקור לרוב גידולי החלב. החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל של חלב עכברים היא צעד קריטי בהערכת תפקוד גנים בתאי אפיתל ויצירת מודלים של גידולי חלב עכבריים. מטרה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי הנושא את הגנים של עניין לתוך עץ החלב עכבר. הנגיף המוזרק מדביק לאחר מכן תאי אפיתל חלב, ומביא את הגנים המעניינים. הווקטור הנגיפי יכול להיות לנטיויראלי, רטרו-ויראלי, אדנוביראלי או אדנו-וירוס הקשור לנגיפים (AAV). מחקר זה מדגים כיצד גן מעניין מועבר לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה אינטרדוקטלית של וקטור נגיפי של עכבר. לנטיוירוס הנושא GFP משמש להצגת ביטוי יציב של גן מועבר, ורטרו-וירוס הנושא Erbb2 (HER2/Neu) משמש להדגמת נגעים היפרפלסטיים לא טיפוסיים הנגרמים על ידי אונקוגנים וגידולי חלב.
Introduction
תאי אפיתל של בלוטות החלב ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטות אלה והם תא המקור העיקרי של סרטן השד. מחקרים על ביולוגיה של בלוטת החלב וגידולים לעתים קרובות זקוקים להעברת גנים בעלי עניין לתאים אלה. כל בלוטת חלב של עכבר מורכבת מעץ צינורי מרופד בתאי אפיתל עם פתח יחיד בקצה הפטמה. מבנה זה הופך את תאי אפיתל החלב לנגישים בקלות לווקטורים נגיפיים, אשר יכולים להיות מועברים לתוך לומן של עץ דוקטלי באמצעות הזרקה intraductal1.
הטכניקה של הזרקה intraductal חלב שימש במקור עבור בעלי חיים גדולים בהרבה כגון עזים, ארנבות, חולדות1. עבור חיה קטנה בהרבה כמו עכברים, הזרקה אינטרדוקטלית דורשת כלים עדינים רבים ושיטות עבודה רבות יותר של המפעילים. ישנן שתי גישות להזרקת עכבר intraductal. האחת היא זריקה1. עוד אחד הוא הזרקה ישירה של הצינור הראשוני של #3 או #4 בלוטת החלב לאחר חשיפה כירורגית1. מכיוון שהראשון אינו פולשני ומהיר יותר ברגע שהמפעיל הוכשר היטב, טכניקה זו נפוצה יותר ותתואר בפירוט במאמר זה.
בהשוואה למודלים הנפוצים של עכברים טרנסגניים מסורתיים, שבהם הגן המעניין מוצג בשלב של ביציות מופרות באמצעות מיקרו-הזרקה 2,3,4, להעברת גנים בשיטת הזרקת הנגיף התוך צינורי יש יתרונות רבים, כולל: (1) הוא מונע את התהליך הגוזל זמן של יצירת קו עכבר מהונדס עבור כל גן מעניין; (2) הוא מונע פגיעה פוטנציאלית בהתפתחות תקינה של בלוטות החלב המוטלת על ידי הגן המעניין; (3) הוא מציג את הגן המעניין בכל עת רצויה לאחר הלידה; (4) הוא יכול בקלות להכניס במשותף יותר מגן אחד של עניין; (5) הוא מחקה טוב יותר את התהליך הגידולי הטבעי משום שהתאים הנגועים ולכן נושאי האונקוגן מוקפים בתאים נורמליים; ו-(6) בשילוב עם טכנולוגיית TVA (וירוס הגידול A, חלבון פני השטח של תאי העופות והקולטן לווקטור RCAS רטרו-וירוס)5, ניתן להחדיר את הגן המעניין לאוכלוסיית תאים ספציפית כדי לחקור את מקור התא של גידולים ולבצע בדיקות מעקב אחר שושלת תאים בבלוטות החלב 6,7,8, 9.
כל וקטור הנגזר רטרווירוס10, lentivirus 11,12, adenovirus13, ווירוס הקשור אדנווירוס (AAV)14 עשוי לשמש להעברה intraductal של חומרים גנטיים. רטרו-וירוס ווקטורים של לנטי-וירוס משתלבים בגנום המארח לצמיתות; לכן, הם מציגים גנים של עניין יציב לתוך תאי אפיתל החלב. בעוד שלנטיוירוס יכול להשתלב בגנום של כל תא שהוא פוגש15, האינטגרציה הגנומית היעילה של רטרו-וירוס זקוקה להתרבות תאי המטרה16. וקטורי אדנו-ויראלי ו-AAV אינם משתלבים בגנום של תאים נגועים, ולכן מבטאים רק באופן ארעי את הגן המעניין17,18. תכונה זו יכולה להוות יתרון כאשר הגן המעניין צריך לבוא לידי ביטוי לפרק זמן קצר בלבד, כגון Cre, למחיקת גן מדכא גידול פלוקס.
Lentivirus, adenovirus, ו- AAV מדביקים כל תאי עכבר שהם נתקלים בהם. אך מכיוון שהאפיתל הלומינלי מבודד במידה רבה מהשכבה הבסיסית הבסיסית, המופרדת עוד יותר מהסטרומה על ידי קרום המרתף, הזרקה אינטרדוקטלית מגבילה את הזיהום בעיקר לתאי אפיתל לומינליים, התא העיקרי של מוצא סרטן השד. בתוך שכבת אפיתל לומינלית זו, ישנם גם תת-סוגים שונים של תאים, כולל תאי גזע, תאי אב וכמה קבוצות של תאים ממוינים. כדי להדביק תת-קבוצות תאים ספציפיות באוכלוסיית התאים הלומינליים, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TVA, שבה וקטורים RCAS5,10 שמקורם בנגיף לויקוזיס העופות או וקטורים לנטי-ויראליים פסאודו-טיפיים11 מדביקים באופן סלקטיבי את התאים המבטאים TVA בעכברים הנושאים טרנסגן TVA תחת שליטתו של מקדם ספציפי לסוג התא, כגון מקדם הפעיל רק בתאי גזע 6 או אבות מסוימים 6, 7 או תאים מכתשית8 או תאים פעילים במסלול Wnt9.
פרוטוקול זה מציג את הטכניקה של החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי. לאחר מכן מודגם זיהוי הביטוי של הגנים שהוכנסו והנגעים ההיפרפלסטיים והגידולים המתקבלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים באמצעות עכברים בוצעו בהתאם לפרוטוקול בעל חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בנקבות FVB/N או MMTV-tva בנות 9-12 שבועות. העכברים הושגו באופן מסחרי או בייצור עצמי (ראו טבלת חומרים). נעשה שימוש בנגיפים Lenti-EGFP (FUCGW) ו-RCAS-Erbb2 (Neu). הכנת הנגיף וקביעת הטיטר בוצעו בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר10,12.
1. הכנת מזרק
- חתכו את מחטי רכזת המתכת 33 G (ראו טבלת חומרים) לאורך של כ-1 ס"מ. לאחסן את המחטים ואת מזרק 50 μL ב 70% אלכוהול לאחר autoclaving.
- מוציאים מזרקים ומחטים מהאלכוהול. הוציאו את שארית האלכוהול מהמזרק והמחט. יש לפרק את המזרק לייבוש באוויר על כרית ספסל סופגת אוטוקלאבית.
- מרכיבים את המזרק לאחר הייבוש.
2. הכנת וירוסים
- הוציאו צינורית ויראלית אחת או יותר לפי הצורך מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והפשירו את הנגיף על קרח.
הערה: בהתאם למספר התאים שיש להדביק, ייתכן שיהיה צורך לדלל את הנגיף לטיטרים מיועדים באמצעות PBS 1x בשלב זה. - הוסיפו ברומופנול כחול על ידי טבילת קצה פיפטה לעומק של 1 ס"מ באבקת ברומופנול כחולה (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, הביאו את כמות העקבות המצורפת של ברומופנול כחול לתרחיף הנגיף.
הערה: במחקר הנוכחי, המלאי הנגיפי הוא בדרך כלל 200 מיקרוליטר לכל צינור, כך שריכוז הצבע הסופי הוא כ -0.2% (0.2 מיקרוגרם / 100 מיקרוליטר). ברומופנול כחול צריך להיות מעוקר עם קרינת מיקרוגל במשך 45 שניות בהספק גבוה של 1250 W (ראה טבלת חומרים). הקפד לבצע את כל ההליך בסביבה סטרילית. - מערבבים את כחול הברומופנול עם תמיסת הנגיף על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
- מניחים את הנגיף על קרח ומביאים את דלי הקרח לוויבריום.
3. הכנת בעלי חיים
- הרדימו עכברה נקבה על ידי הזרקה תוך צפקית של 2 μL/g של חומר הרדמה (37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין, ראו טבלת חומרים). בדוק את עומק ההרדמה עם צביטת בוהן. יש למרוח משחה על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
הערה: העכבר חייב להיות לא מגיב לצביטה בבוהן תחת הרדמה טובה. ניתן להשתמש באיזופלורן גם כדי להרדים את העכברים. - הניחו את העכבר במצב שכיבה על כרית חמה וחברו את כל ארבעת הגפיים לספסל באמצעות סרט הדבקה.
- זהה פטמה אחת (או יותר) להזרקה (מספר 4 מועדף למחקר הנוכחי). חשוף אותו על ידי גזיזת השיער שמסביב באמצעות זוג מספריים.
- יש למרוח 70% אלכוהול ומקלוני יודופור על אזור הפטמה בשלושה סיבובים כדי לנקות ולחשוף את הפטמה.
4. הזרקה intraductal של וירוס
הערה: ניתן להשתמש במנורה מגדלת כדי לסייע בהדמיה של פתח הפטמה.
- חצו את הקצה הדיסטלי של פטמה באמצעות זוג מספריים קפיציים סטריליים של מיקרודיסקציה, עד שניתן לראות פתח צינור מרכזי קטן מתחת למנורת זכוכית מגדלת (ראו טבלת חומרים).
- יש להעמיס 10 מיקרוליטר של תערובת וירוס/ברומופנול כחול לתוך המזרק.
הערה: Lenti-EGFP (FUCGW) ו- RCAS-Erbb2 (Neu) משמשים בהדגמה זו. - הכנס בזהירות את המחט לפתח הפטמה בעזרת מנורת הזכוכית המגדלת. כיוון המחט מותאם מעט מהמדיאלי לצדדי כדי ליישר קו עם הצינור הראשי.
- הזריקו את כל 10 μL של הנגיף לתוך עץ הצינור.
הערה: הצינורות מתחת לעור צריכים להפוך כחולים, אם ההזרקה מוצלחת. כל התנגדות או מראה של שינוי צבע מקומי מציין את כישלון ההזרקה. - הנח את העכבר על מגלשה חמה יותר להגדיר על 45 ° C עד העכבר מתעורר לחלוטין (~ 30-60 דקות).
5. איתור תאים נגועים על ידי סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי
- שלושה עד חמישה ימים לאחר הזרקת הנגיף הנושא GFP או גנים פלואורסצנטיים אחרים, יש להרדים את העכבר על ידי מינון יתר שלו עם 4 uL/g של חומר הרדמה (37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין).
- פתח את חלל בית החזה. חותכים את העור לאורך קו האמצע הגחוני ולאורך הגפיים העליונות והתחתונות באמצעות זוג מספריים. להרים את העור ולחשוף את בלוטות החלב.
- הסר את בלוטת החלב המוזרקת מהעור באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. כמו כן, הסר בלוטה שלא הוזרקה כבקרה.
- מניחים את בלוטות החלב על מגלשות זכוכית ופורשים את הבלוטות לצורתן המקורית.
- התבוננו ודמיינו את הבלוטות תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים מייצגים מוצגים כאן כדי להדגים הזרקה אינטרדוקטלית מוצלחת, זיהום ויראלי מוצלח, ואת ההשפעה של הגנים המועברים על גידולי החלב. כמות הנגיף המוזרק חייבת להיות מותאמת למטרת כל ניסוי. כדי להמחיש עד כמה עץ צינור החלב יכול להיות נגוע, יש להשתמש בכמות גדולה של גנים נושאי וירוסים שניתן לצלם, כגון GFP. מצד שני, כדי לחקות את הגידול הספונטני הטבעי, יש להשתמש בכמות קטנה של נגיף הנושא אונקוגן כך שרק תאים מעטים יהיו נגועים ויתפתחו לנגעים טרום סרטניים, ובסופו של דבר לסרטן פולשני, בשדה של בלוטת החלב הנורמלית לחלוטין.
ההצלחה של הזרקה אינטרדוקטלית יכולה להיות מאושרת באופן מיידי על-ידי חשיפת בלוטת החלב והתבוננות בעץ צינורי כחול (איור 1). יומיים עד חמישה ימים לאחר הזרקת נגיף Lenti-EGFP (FUCGW) (~10,6 IUs)12, ניתן להעריך זיהום בתאי אפיתל של החלב על-ידי הכנת הר שלם ואחריו התבוננות תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2). לחלופין, לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה של חלבונים פלואורסצנטיים או סמני פני השטח של התא המיוצרים על-ידי הנגיף 6,7,19, הבלוטות הנגועות והבלוטות הלא נגועות (כבקרות שליליות) עשויות להיאסף ולעבד לתרחיף חד-תאי כך שניתן יהיה להעריך את קצב ההדבקה הנגיפית (איור 3)). שיטה נוספת לבדיקה/כימות של זיהום בנגיף היא לתקן את בלוטות הבקרה הנגועות והלא נגועות באמצעות 4% פרפורמלדהיד (או פורמלין), לעבד אותן לבלוקים משובצים בפרפין, ולהכתים את החלקים המתקבלים עבור תוצרי הגן המופקים באופן ויראלי ותגי אפיטופ כגון HA ו- FLAG20,21.
השאלה אם התאים הנגועים בנגיפים יתרחבו וייצרו נגעים טרום סרטניים, ולאחר מכן גידולים, תלויה בעוצמת האונקוגן המועבר ובכמות הנגיף המוזרק. עבור אונקוגן חזק כגון PyMT ו- RAS מופעל, נגעים מוקדמים נוצרים תוך מספר ימים, וגידולים מופיעים תוך מספר שבועות10 (Bu et al., תצפיות שלא פורסמו). ERBB2 פעיל מוביל לנגעים טרום סרטניים תוך מספר שבועות ולגידולים תוך מספר חודשים 10,22,23 (איור 4), בעוד PIK3CA מופעל מוביל לגידולים עם חביון חציוני של כ-5 חודשים 24. מצד שני, Wnt1 גורם לגידולים די לאט: רק כ-20% מהעכברים הנגועים פיתחו גידולים לאחר 20 חודשים21.
איור 1: עץ צינור חלב שהוחדר בהצלחה. התמונה צולמה מיד לאחר הזרקה intraductal של בלוטת החלב מספר 4 של עכבר נקבה FVB/N בן 9 שבועות. החץ מציין את מיקום הפטמה מספר 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי תאים נגועים על-ידי סטריאומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. (A) בלוטה נגדית שלא הוזרקה משמשת כבקרה. (B) תמונה שצולמה תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה את עץ צינור החלב הנגוע. בלוטת החלב מספר 3 של עכבר FVB/N בן 10 שבועות הוזרקה תוך צינורית עם וירוס Lenti-EGFP (FUCGW) (~ 10,6 IUs). בלוטת החלב המוזרקת נאספה 5 ימים לאחר ההזרקה. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות תאים נגועים על-ידי ניתוח ציטומטריית זרימה עבור EGFP המיוצר על-ידי לנטיוירוס. תעלת הפיקוריתרין (PE) שימשה לחשיפת האות הפלואורסצנטי האוטומטי. בלוטות החלב הנגדיות שימשו כבקרה שלילית. בלוטות החלב שהוזרקו מעכבר נקבה FVB/N בת 12 שבועות נאספו 2.5 ימים לאחר הזרקה intraductal של Lenti-EGFP (~ 10, 6 IUs/בלוטה) ועובדו לתרחיף חד-תאי. התרחיף החד-תאי נותח לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה כדי לזהות את התאים החיוביים ל-GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אישור אימונוהיסטוכימי של תוצר אונקוגן המתבטא בנגיף בנגע מוקדם ובגידול. (A) בלוטת חלב מוקדמת המכילה נגע #4 נאספה 14 יום לאחר הזרקה אינטרדוקטלית של 106 IUs של RCAS-Neu (HA) לעכברי MMTV-tva. צביעה אימונוהיסטוכימית שימשה לזיהוי תג HA. (B) גידול נאסף שנה לאחר הזרקה intraductal של 10 4 IUs של RCAS-Neu (HA) לתוך בלוטת #4 של עכברי MMTV-tva. גיל העכבר בעת ההזרקה: 12 שבועות. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מדגים את טכניקת ההזרקה התוך-צינורית הנגיפית להחדרת גנים לתאי אפיתל חלב של עכברים לצורך מידול סרטן שד ספורדי. בדרך כלל, עכברים של לפחות 5 שבועות ומעלה מוזרקים כך התהליך האונקוגני מתחיל לאחר התפתחות בלוטת החלב. חוץ מזה, פתח הפטמה של עכברים מתחת לגיל 5 שבועות הוא לעתים קרובות קטן מדי להזרקה. מצד שני, פטמות של עכברים זקנים מאוד מנוונות לפעמים, וטרנסקציה עלולה להיכשל בחשיפת פתח צינורי. כמו כן, חשוב לציין כי הפטמות של כמה מודלים של גידולים טרנסגניים או נוקאאוט עשויים להיות קשים להזרקה עקב התפתחות חלב לא תקינה הנגרמת על ידי מוטציות גנטיות germline.
מלבד תרגול השימוש בציוד מגן אישי סטנדרטי (PPE) בטיפול בנגיפים, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע עקיצות מחט מקריות בידיו של הנסיין. אמנם אין עדות לכך שנגיף לויקוזיס העופות מדביק בני אדם, אך לנטי-וירוסים המשמשים למידול סרטן במכרסמים יכולים להדביק גם בני אדם. הגנה זו מפני זיהום מקרי חשובה במיוחד כאשר הנגיף נושא אונקוגן חזק25.
כאשר מספר גנים מעניינים צריכים להיות מועברים לתאי אפיתל, הם יכולים להיות מועברים על ידי תערובת של וקטורים שונים הנושאים כל גן בודד או על ידי וקטור שנועד לשאת את כל הגנים לבדיקה. השיטה הראשונה יכולה לנצל וירוסים שיוצרו בעבר, אך הדבקה משותפת מתרחשת רק בתת-קבוצה קטנה של האוכלוסייה הנגועה. מצד שני, הגישה השנייה דורשת לעתים קרובות בניית וירוסים חדשים, אבל זיהום משותף מובטחת.
בהשוואה למודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMM), טכניקת ההזרקה התוך-צינורית מספקת גמישות מרחבית-זמנית טובה יותר כדי להעביר את הגן המעניין לתאי אפיתל החלב. גמישות זו מאפשרת חיקוי טוב יותר של גידולים סרטניים בחולים, שכן רוב מקרי סרטן השד מקורם בתאים סומטיים הסובלים משינויים גנטיים במהלך שלבים בוגרים5. בקרה מרחבית-טמפורלית יכולה גם לסייע בחקר תרומתם של תת-סוגי תאים לגידולי שד 6,7,9,26,27,28.
טכניקת ההזרקה האינטרדוקטלית שימשה בעיקר להעברת גנים אקסוגניים המונעים על ידי מקדמים מלאכותיים עם וקטור נגיפי. כאשר אונקוגן מועבר בדרך זו, השעתוק שלו שונה מזה של פרוטו-אונקוגן אנדוגני שעבר מוטציה טבעית. והבדל זה עשוי להשפיע לאחר מכן על היווצרות סרטן, התקדמות ותגובה לטיפול. כדי להתגבר על חשש זה, ניתן להשתמש בווקטורים הנושאים רכיבי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 לעריכת גנים אנדוגניים בעלי עניין29,30. לאחרונה שיפרנו אסטרטגיה זו והפכנו אותה לגמישה ויעילה מאוד (Bu et al., תוצאות שלא פורסמו). התקדמות זו בעריכת גנים הופכת את טכניקת ההזרקה האינטרדוקטלית לכלי רב עוצמה עוד יותר למידול סרטן.
לסיכום, הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים היא טכניקה רבת עוצמה ליצירת מודלים עכבריים של סרטן השד המחקים באופן הדוק היווצרות סרטן שד אנושי. השילוב של טכניקה זו עם טכנולוגיית TVA ועריכת CRISPR משחרר פוטנציאל רב עוד יותר לשיטה רב-תכליתית זו בהבנת היווצרות סרטן השד. מודלים אלה מספקים גם משאבים יקרי ערך לבדיקת אסטרטגיות חדשות במניעת סרטן השד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שני המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר גארי צ'מנס על הערותיו המועילות על כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה (DOD) CDMRP BC191649 (YL) ו- BC191646 (YL) כמו גם המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) CA271498 (YL). המחברים רוצים להודות למתקן הליבה הפתולוגית של מרכז השד הנתמך על ידי SPORE P50CA186784, ולליבת הציטומטריה ומיון התאים הנתמכת על ידי CPRIT-RP180672, NIH CA125123 ו- RR024574 בסיועו של ג'ואל מ. סדרסטרום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
References
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
- Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
- Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
- Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
- Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
- Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
- Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
- Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
- Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
- Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
- Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
- Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
- Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
- Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
- Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
- Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
- Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
- Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
- Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
- Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
- Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).
