Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Изучение Х-хромосомных аберраций в клетках яичников с использованием флуоресцентной гибридизации in situ

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64734
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

Summary

В данной статье представлены два метода, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ , для определения содержания Х-хромосомы клеток яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями.

Abstract

Миллионы людей во всем мире сталкиваются с проблемами, связанными с рождаемостью. Снижение фертильности или даже бесплодие может быть вызвано множеством различных причин, включая генетические нарушения, из которых хромосомные аномалии являются наиболее распространенными. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является хорошо известным и часто используемым методом обнаружения хромосомных аберраций у людей. FISH в основном используется для анализа хромосомных аномалий в сперматозоидах самцов с числовыми или структурными хромосомными аберрациями. Кроме того, этот метод также часто применяется у женщин для обнаружения аберраций Х-хромосомы, которые, как известно, вызывают дисгенезию яичников. Однако информация о содержании Х-хромосомы клеток яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями в лимфоцитах и/или буккальных клетках по-прежнему отсутствует.

Целью данного исследования является продвижение фундаментальных исследований аберраций Х-хромосомной кислоты у женщин, путем представления двух методов, основанных на FISH, для идентификации содержания Х-хромосом в клетках яичников. Во-первых, описан способ определения содержания Х-хромосомы изолированных клеток яичников (ооцитов, гранулезных клеток и стромальных клеток) в нетрансплантированной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями. Второй метод направлен на оценку влияния хромосомных аберраций на фолликулогенез путем определения Х-хромосомного содержания клеток яичников новообразованных вторичных и антральных фолликулов в ткани яичника от самок с Х-хромосомными аберрациями после длительной трансплантации в мышей с ослабленным иммунитетом. Оба метода могут быть полезны в будущих исследованиях, чтобы получить представление о репродуктивном потенциале женщин с аберрациями Х-хромосомы.

Introduction

Бесплодие - это проблема мужской или женской репродуктивной системы, затрагивающая примерно 186 миллионов человек репродуктивного возраставо всем мире 1. Не менее чем у 35% бесплодных пар бесплодие вызвано расстройством женской репродуктивнойсистемы2. Существует множество факторов, которые могут вызвать женское бесплодие, такие как генетические факторы, аномалии половых путей, эндокринная дисфункция, воспалительные заболевания и ятрогенное лечение3.

Генетические аномалии присутствуют примерно у 10% бесплодных женщин 4,5. Из всех генетических аномалий аберрации Х-хромосомы являются наиболее частой причиной дисгенезии яичников2. В нескольких исследованиях сообщалось, что аберрации Х-хромосомы у женщин с синдромом Тернера (ТС) или синдромом тройной Х-хромомы связаны с преждевременной недостаточностью яичников из-за ускоренной потери половых клеток или нарушения оогенеза 6,7,8.

Аберрации Х-хромосомы можно разделить на: 1) числовые аберрации, при которых число Х-хромосом разное, но Х-хромосомы не повреждены; и 2) структурные аберрации, при которых Х-хромосома приобрела или потеряла генетический материал 3,9. Числовые аберрации Х-хромосомы встречаются чаще, чем структурные аномалии, и часто вызваны спонтанными ошибками при деленииклеток 3,9. Когда такая ошибка возникает во время мейоза, это может привести к анеуплоидным гаметам и, в конечном итоге, к потомству с хромосомными аберрациями во всех клетках. Когда хромосомные дефекты возникают в соматических клетках в результате ошибок, возникающих при митозе на ранних стадиях онтогенеза, это может привести к мозаицизму. У этих людей присутствуют как клетки с нормальным содержанием Х-хромосомы, так и клетки с аберрациями Х-хромосомы.

В 1980-х годах был разработан цитогенетический метод, называемый флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), для визуализации и определения местоположения специфических последовательностей нуклеиновых кислот на метафазных и межфазных хромосомах10,11. Этот метод использует флуоресцентные меченные ДНК-зонды для связывания с определенной последовательностью в хромосоме, которую затем можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа.

В настоящее время FISH широко используется в качестве клинического диагностического инструмента и считается золотым стандартом в выявлении хромосомных аберраций10. В области репродуктивной медицины анализ спермы FISH был использован для получения представления о содержании Х-хромосом сперматозоидов у мужчин с числовыми или структурными хромосомными аберрациями в соматических клетках12,13,14. Эти исследования показали, что мужчины с хромосомными аберрациями с большей вероятностью имели более высокую частоту анеуплоидных сперматозоидов, присутствующих в сперме, по сравнению с мужчинами с нормальными кариотипами12,13,14.

В отличие от сперматозоидов, очень мало известно о содержании Х-хромосомы клеток яичников (включая ооциты, гранулезные/тека-клетки и стромальные клетки) у людей с хромосомной аберрацией, а также о возможных последствиях анеуплоидии этих клеток на их репродуктивный потенциал. Важной причиной скудности информации о кариотипе клеток яичников по сравнению со сперматозоидами является тот факт, что женщинам приходится проходить инвазивную процедуру, такую как пункция фолликулов или операция по получению ооцитов или ткани коры яичников. Поэтому женские гаметы трудно получить в исследовательских целях.

В настоящее время в Нидерландах проводится обсервационное интервенционное исследование для изучения эффективности криоконсервации ткани яичников у молодых женщин с TS15. Один фрагмент ткани коры яичников пациентки был доступен для идентификации Х-хромосомного содержимого клеток яичников16,17. В рамках исследования был разработан новый метод, основанный на FISH диссоциированной ткани коры яичников, чтобы определить, присутствуют ли хромосомные аберрации в клетках яичников у женщин, несущих хромосомную аберрацию в неяичниковых соматических клетках, таких как лимфоциты или буккальные клетки. Кроме того, было определено влияние анеуплоидии в клетках яичников на фолликулогенез. С этой целью был модифицирован установленный протокол FISH, который позволяет анализировать гистологические срезы ткани коры яичников после искусственно индуцированного фолликулогенеза во время длительной ксенотрансплантации у мышей с ослабленным иммунитетом. В этом исследовании мы представляем два метода, основанных на FISH, для определения содержания Х-хромосомы в клетках яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы, с целью улучшения фундаментальной науки по этой теме.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол исследования TurnerFertility был одобрен Центральным комитетом по исследованиям с участием людей (NL57738.000.16). В этом исследовании была получена ткань коры яичников 93 женщин с ТС. Материалы, требующие мер предосторожности, перечислены в таблице 1.

Таблица 1: Меры предосторожности.

Материал Опасность
Уксусная кислота Сильные ожоги кожи и раздражение дыхательной системы
Коллагеназа Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу
ДАПИ Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу
ДНКаза I Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу
Этанол Легковоспламеняющийся
Формальдегид Токсичен после вдыхания, проглатывания и контакта с кожей
Формамид
(в флуоресцентных зондах)		 Может навредить будущему ребенку
Либераза Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу
Метанол Легко воспламеняется, токсичен при вдыхании, проглатывании и контакте с кожей
Нонидет П40 Раздражает кожу или глаза
Пепсин Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу
Протеиназа К Затрудненное дыхание после вдоха
Ксилол Легко воспламеняется, токсичен после вдыхания и контакта с кожей. Избегать попадания в глаза.

Таблица 1: Материалы, требующие техники безопасности.

1. FISH на изолированных отдельных клетках коры яичников

  1. Диссоциация ткани коры яичников с получением отдельных клеток
    1. Разрежьте криоконсервированную/размороженную ткань коры яичника на небольшие кусочки размером примерно 1 мм x 1 мм x 1 мм с помощью скальпеля.
    2. Ферментативно расщепляют фрагменты ткани в 4 мл предварительно подогретой (37 °C) среды L15, содержащей 0,1 мг/мл смеси ферментов диссоциации тканей, 10 мкг/мл ДНКазы I и 1 мг/мл коллагеназы I из C. histolyticum в течение максимум 75 мин при 37 °C. Пипеткой перемешивайте смесь для пищеварения каждые 15 минут.
    3. Остановите ферментативное пищеварение, добавив 4 мл холодного L15 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Промойте диссоциированную ткань один раз 8 мл холодной среды L15 центрифугированием при 500 x g и ресуспендируйте в 500 мкл среды L15 без вихря, чтобы избежать повреждения клеток.
    4. Перенесите клеточную суспензию, содержащую в основном отдельные стромальные клетки и небольшие фолликулы (ооциты, окруженные одним слоем гранулезных клеток), в пластиковую чашку Петри и исследуйте клеточную суспензию под стереомикроскопом (100-кратное увеличение).
    5. Возьмите мелкие фолликулы (<50 мкм) вручную с помощью пластиковой пипетки 75 мкм и перенесите фолликулы в каплю среды L15 с добавлением 10% FBS при 4 ° C, чтобы предотвратить агрегацию фолликулов. Выполняйте забор фолликулов в течение максимум 30 минут. Чтобы улучшить распространение фолликулярных клеток перед анализом FISH, перенесите очищенные фолликулы в раствор 0,06% трипсина, 1 мг / мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 1 мг / мл глюкозы и инкубируйте в течение 20 минут при 37 ° C.
    6. Получают стромальные клетки яичников из суспензии клеток коры головного мозга с помощью пластиковой пипетки размером 75 мкм, уделяя особое внимание тому, чтобы избежать загрязнения мелкими фолликулами.
  2. РЫБНЫЙ анализ отдельных клеток яичников
    1. Перенесите обработанные фолликулы яичников (рекомендуемое n = 5-20) с трипсином/ЭДТА/глюкозой или стромальными клетками (n > 1000) в капли по 5 мкл 0,15 мМ KCl/15 мкл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS) на предметное стекло и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C.
    2. Высушите и предварительно зафиксируйте предметные стекла в 300 мкл 0,05 мМ KCl/7,5% уксусной кислоты/22,5% метанола в течение 2 мин при комнатной температуре (RT). Накройте предметные стекла метанолом/уксусной кислотой (3:1) на 2 минуты при RT для окончательной фиксации.
    3. Сделайте 20-кратный стандартный цитрат натрия (SSC), добавив 876 г хлорида натрия и 441 г дигидрата три-цитрата натрия в 5 л дистиллированной воды. Затем добавьте 100 мл 20x SSC к 900 мл деминерализованной (деми) воды, чтобы получить 2x SSC. Промойте образец в 2x SSC при 73 ° C, покройте его 100 мкл 2% протеиназы K и запечатайте покровным стеклом. Инкубируйте предметные стекла в течение 10 мин при 37 °C на станции гибридизации.
    4. Снимите покровное стекло и промойте предметные стекла в течение 5 мин в DPBS при RT. Зафиксируйте образец на 5 мин 1% формальдегидом при RT. На этом этапе материал еще не полностью прикреплен к предметным стеклам, поэтому его не следует размещать на трясущейся платформе.
    5. Промывают предметные стекла в течение 5 мин в DPBS при RT с последующей дегидратацией в последующих 70%, 80%, 90% и 100% этаноле в течение 2 мин каждый. Высушите обезвоженный образец на воздухе и гибридизируйте его с флуоресцентно меченными зондами.
    6. Выберите центромерно-специфический зонд для хромосомы X и другой хромосомно-специфический центромерный зонд в качестве контроля для определения содержания X-хромосомы в клетках яичников. В этом случае используются центромер-специфические зонды для хромосомы X (CEP X [DXZ1]), непосредственно меченной флуорохромом SpectrumGreen и хромосомой 18 (CEP 18 [D18Z1]), непосредственно меченной флуорохромом SpectrumOrange.
    7. Добавьте 1 мкл CEP X, 1 мкл CEP 18 и 18 мкл гибридизационного буфера к образцу и запечатайте покровным стеклом, которое приклеивается к предметным стеклам, чтобы предотвратить испарение зонда во время гибридизации. Перенесите предметные стекла на станцию гибридизации для денатурации при 73 °C в течение 3 мин с последующей гибридизацией во время ночной инкубации при 37 °C.
    8. Удалите покровное стекло и оставшийся клей со предметного стекла после гибридизации. Промойте предметные стекла в 0,4x SSC/0,3% Tween-20 при 72 °C в течение 2 мин с последующей инкубацией в течение 1 мин в 2x SSC/0,1% Tween-20 при RT.
    9. Обезвоживают предметные стекла последующими 2-минутными инкубациями в 70%, 80%, 90% и 100% этаноле и сушат на воздухе в темноте. Накройте предметные стекла монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Хранить при -20 °C не менее 10 минут перед анализом флуоресцентной микроскопией.
  3. Отображение
    1. Изучите сигнал (сигналы) Х-хромосомы с помощью флуоресцентного микроскопа, подключенного к программному обеспечению для обработки изображений.
      1. Во-первых, выберите флуорохром DAPI.
        1. Чтобы получить изображение, выберите «Новая ячейка» > «Захват > реальном времени » с 630-кратным увеличением. Появится новое окно с порогом. Установите синюю полосу порогового значения на 0, чтобы свести к минимуму фон, и красную полосу на максимум (255), чтобы сделать сигналы ярче. Нажмите « Принять».
        2. Появится новое окно с улучшением с предложением темнее/ярче (12), радиуса (3) и глубины (1). Используйте предложенные значения или скорректируйте их, если вас это не устраивает.
      2. Во-вторых, выберите флуорохром SpectrumOrange и нажмите «Захват».
        1. Установите синюю полосу порогового значения на 0, чтобы свести к минимуму фон, и красную полосу на максимум (255), чтобы сделать сигналы ярче. Нажмите « Принять».
        2. Появится окно с улучшением с предложением темнее/ярче (-11), радиуса (2,7) и глубины (0,6). Используйте предложенные значения или скорректируйте их, если вас это не устраивает.
      3. Наконец, выберите флуорохром SpectrumGreen и нажмите «Захват».
        1. Установите синюю полосу порогового значения на 0, чтобы свести к минимуму фон, и красную полосу на максимум (255), чтобы сделать сигналы ярче. Нажмите « Принять».
        2. Появится окно с улучшением с предложением темнее/ярче (0), радиуса (3) и глубины (0). Используйте предложенные значения или скорректируйте их, если они вас не устраивают. Сохраните изображение во вновь созданном файле.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Соматические клетки оценивались только тогда, когда были видны два сигнала контрольной хромосомы 18. В большинстве ооцитов для каждой хромосомы может быть обнаружен только один сигнал.
    2. Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C после анализа, чтобы предотвратить потерю сигнала.

2. FISH на парафиновых срезах пересаженной ткани коры яичника

ПРИМЕЧАНИЕ: Один фрагмент криоконсервированной/размороженной ткани коры яичников 18 самок с TS был ксенотрансплантат мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) в течение 5 месяцев. Процедура ксенотрансплантации была описана ранее и проводилась в Католическом университете Лувена (Брюссель, Бельгия) в соответствии с местными рекомендациями Комитета по исследованиям животных в отношении благополучия животных (ссылка 2014/UCL/MD/007)18,19.

  1. Выделение участков ксенотрансплантированной ткани коры яичника, содержащих фолликулы
    1. Зафиксируйте ксенотрансплантированную ткань коры яичника в 4% формальдегиде и вставьте ткань в парафин. Обрежьте блоки скальпелем, чтобы удалить лишний парафин, и разрежьте парафиновый блок до толщины 4 мкм на микротоме вращения.
    2. Выберите каждый седьмой участок парафиновой ленты для окрашивания гематоксилином и эозином (HE), чтобы определить, какие участки содержат фолликулы. Поместите срезы на водяную баню при температуре 40-45 °C и установите их на предметные стекла иммуногистохимического микроскопа.
  2. Депарафинизация и ОФ-окрашивание
    1. Поставьте горки на плиту на 10 минут при температуре 60 °C, а затем погрузите горки в 100% ксилол на 5 минут. Не обязательно размещать горки непосредственно на плите. Гидратируют срезы в течение 15 с в 100% этаноле, а затем 2 х 15 с в 96% этаноле. Промойте предметные стекла в водопроводной воде в течение 2 минут.
    2. Окрашивайте предметные стекла в гематоксилине в течение 10 минут, а затем ненадолго промойте предметные стекла в водопроводной воде. Ненадолго погрузите предметные стекла в раствор гидрокарбоната (100 г сульфата магния и 10 г гидрокарбоната натрия в 5 л дистиллированной воды). Промойте предметные стекла в водопроводной воде в течение 5 минут.
    3. Запятнайте предметные стекла эозином в течение 4 минут и трижды обезвоживайте предметные стекла 100% этанолом, а затем ксилолем. Нанесите пятна HE на предметные стекла и оцените срезы HE под световым микроскопом, чтобы выбрать срезы с фолликулами (100-кратное увеличение).
  3. Предварительная обработка и гибридизация парафиновых срезов для ДНК FISH
    1. Выделите новые участки, которые лежали до или после участка, содержащего фолликулы из парафиновой ленты. Смонтируйте одну секцию на предметное стекло. Высушите парафиновые участки не менее 45 минут на плите при температуре 56 °C. Не обязательно размещать горки непосредственно на плите.
    2. Депарафинизируйте срезы в ксилоле в течение 10 мин. Погрузите предметные стекла в 99,5% этанол и промойте их в течение 5 минут в водопроводной воде. Предварительно обработайте предметные стекла целевым поисковым раствором (низкий pH) в течение 10 мин при 96 °C. После остывания промойте предметные стекла в дистиллированной воде.
    3. Обработать предметные стекла в течение 5 мин 0,01 М соляной кислотой с последующим расщеплением пепсина (200 ЕД/мл) в течение 15 мин при 37 °C. Промойте предметные стекла еще раз в 0,01 М соляной кислоте, а затем в PBS.
    4. Зафиксируйте предметные стекла в 1% формальдегиде/PBS в течение 5 мин. Ненадолго промойте предметные стекла в PBS, а затем снова в деми-воде. Обезвоживайте предметные стекла в 99,5% этанола и дайте им высохнуть на воздухе.
    5. Выберите центромерно-специфический зонд для хромосомы X и другой хромосомно-специфический центромерный зонд в качестве контроля для определения содержания X-хромосомы в клетках гранулезы. Здесь хромосома 18 используется в качестве контроля.
    6. Нанесите 5 мкл зонда CEP 18 (D18Z1), непосредственно меченного флуорохромом SpectrumGreen, и зонда CEP X (DXZ1), непосредственно меченного флуорохромом SpectrumRed, на предварительно обработанные предметные стекла. Нанесите покровное стекло и заклейте область фотоклеем. Поместите предметные стекла в гибридизатор для денатурации при 80 °C на 10 мин и гибридизации на ночь при 37 °C.
    7. На следующий день промойте предметные стекла в течение 5 мин в 2x SSC при 42 °C, затем 2 мин и 1 мин ополаскивайте в 0,3% Nonidet P40 при 73 °C. Обновите 2x SSC и снова промойте предметные стекла в течение 5 минут при комнатной температуре. Накройте кювету так, чтобы срезы держались в темноте.
    8. Ненадолго промойте предметные стекла в дистиллированной воде. Обезвоживайте предметные стекла в 99,5% этанола и дайте им снова высохнуть на воздухе. Наконец, установите слайды с помощью раствора, содержащего DAPI и монтажную среду.
  4. Отображение
    1. Проанализируйте результаты под флуоресцентным микроскопом при 630-кратном увеличении. Откройте программное обеспечение для обработки изображений на компьютере. Выберите FISH в качестве профиля.
    2. Проверьте, установлено ли излучение DAPI на 431 нм и возбуждение на 359 нм, красное излучение Техаса на 613 нм и возбуждение на 595 нм, излучение FITC на 519 нм и возбуждение на 495 нм.
    3. Чтобы получить образ, выберите « Прямой эфир» > «Захват одного образа». Оптимизируйте качество изображения, отрегулировав экспозицию и усиление, перемещая ползунки экспозиции и усиления в меню «Изображение » слева (например, экспозиция: 212 мс и усиление: 7,9). Требуемая экспозиция и усиление могут варьироваться в зависимости от изображения; Наблюдайте за изменениями во время этого процесса, чтобы получить оптимизированное изображение. Сохраните изображение во вновь созданном файле.
    4. Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C после анализа, чтобы предотвратить потерю сигнала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FISH на изолированных клетках яичников перед прививкой
Криоконсервированная ткань коры яичников у женщин с 45,X/46,XX (пациентка А) или 45,X/46,XX/47,XXX (пациентка Б) TS была использована для иллюстрации результатов с использованием этого протокола. У пациента А 50% лимфоцитов имели кариотип 45,Х и 50% - 46,ХХ. У пациента В 38% лимфоцитов были 45,X, 28% - 46,XX, а 34% - 47,XXX. Центромер-специфические зонды для хромосомы X (зеленый) и хромосомы 18 в качестве контрольной (красный) использовали для определения содержания Х-хромосомы отдельных гранулезных клеток, стромальных клеток и ооцитов, выделенных из ткани коры яичников пациентов с ТС без предварительной ксенотрансплантации (рис. 1).

Figure 1
Рисунок 1: FISH-анализ изолированных клеток яичников из ткани коры яичников до трансплантации. Ооциты (наконечники стрелок) и гранулезные клетки из одиночных первичных фолликулов (A, B) и (C, D) окружающих стромальных клеток были проанализированы с помощью флуоресцентных специфических зондов для хромосомы X (зеленые сигналы) и контрольной хромосомы 18 (красные сигналы). Белыми стрелками обозначены 45,X клеточных линий, желтыми стрелками обозначены 46,XX клеточных линий, а красными стрелками обозначены 47,XXX клеточных линий. Не все флуоресцентные сигналы находятся в одной плоскости фокуса. Стержни представляют собой 10 мкм. Увеличение сигналов FISH было установлено на 630x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Различия между отдельными примордиальными фолликулами, которые лечились трипсином и без него до FISH, показаны на рисунке 2. При использовании трипсина до анализа FISH гранулезная клеточная масса и ооциты были менее слипшимися, что позволило проанализировать содержание Х-хромосомы отдельных гранулезных клеток и ооцитов. ДНК ооцитов можно легко отличить от ДНК окружающих гранулезных клеток из-за неправильной формы, размера и диффузного появления ДНК из ооцитов. Кроме того, в ооцитах мелких фолликулов наблюдается только один сильный сигнал FISH для каждой хромосомы из-за непосредственной близости четырех сестринских хроматид в этих клетках. Содержание Х-хромосомы в ооцитах можно определить, используя поверхностное отношение сигнала FISH для хромосомы X к соотношению хромосомы 18.

Figure 2
Рисунок 2: Мелкие фолликулы, обработанные трипсином и без него до FISH. (A) Ферментативное переваривание ткани коры яичников привело к суспензии в значительной степени диссоциированных клеток, но с оставлением первичных фолликулов, состоящих из неповрежденного ооцита, окруженного одним слоем гранулезных клеток (наконечники стрелок на панели A). (B) Небольшие фолликулы были отобраны вручную из клеточной суспензии, но создавали трудности с интерпретацией сигналов после FISH из-за слипания гранулезных клеток (C). (Д,Е) Дополнительное переваривание изолированных фолликулов трипсином до FISH приводило к тому, что отдельные гранулезные клетки сокращались в сферическую морфологию на поверхности фолликулов и с большей вероятностью диссоциировали от фолликула, чтобы стать доступными для анализа FISH. Сигналы FISH, полученные из ооцитов, обозначаются стрелками. Черные полосы представляют 100 мкм, а белые — 10 мкм. Увеличение сигналов FISH было установлено на 630x. Панель D была воспроизведена с разрешения Peek et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

FISH-анализ гранулезных клеток на парафиновых срезах трансплантированной ткани коры яичника
Было обнаружено, что вторичные и антральные фолликулы менее восприимчивы к ферментативному перевариванию, что делает ранее описанный способ диссоциации тканей для получения отдельных клеток яичников непригодным для выращивания фолликулов, обнаруженных в ткани яичника после длительного ксенотрансплантата. Поэтому протокол FISH был оптимизирован с использованием гистологических срезов 4 мкм для определения содержания Х-хромосомы гранулезных клеток вторичных и антральных фолликулов в ткани коры яичников после трансплантации (рис. 3). В этих условиях маловероятно, что сигнал FISH либо Х-хромосомы, либо контрольной хромосомы в ооцитах будет захвачен в одном участке размером 4 мкм из-за большого диаметра ооцитов в растущих фолликулах.

Figure 3
Рисунок 3: Гистологическое и FISH-окрашивание срезов тканей коры яичников после ксенотрансплантации. (А,Б) Окрашивание гематоксилином/эозином показало морфологически нормальные вторичные и антральные фолликулы в ткани коры яичников через 5 месяцев ксенотрансплантации. (С,Д) Содержание Х-хромосомы гранулезных клеток этих фолликулов определяли методом FISH-анализа. На этом рисунке хромосома X показана красным цветом, а хромосома 18 - зеленым. Стержень на панели A представляет 50 мкм, стержень на панели B — 20 мкм, а стержни на панелях C и D — 10 мкм. Увеличение сигналов FISH было установлено на 630x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В качестве первого шага были проведены эксперименты с различными методами фиксации тканей, чтобы определить, какой метод приводит к лучшим сигналам FISH. Анализ FISH проводили на трансплантированной ткани, которая была зафиксирована как в растворе Буэна и впоследствии погружена в 4% формальдегид, так и на привитой ткани, которая была зафиксирована только в 4% формальдегиде. Пересаженная ткань, которая была впервые зафиксирована у Буэна, отображала зеленую дымку на изображении, что затрудняло точный подсчет количества сигналов FISH (рис. 4).

Figure 4
Рисунок 4: Пересаженная ткань коры яичника, зафиксированная только в растворе Буэна и формальдегиде. (A) Фиксация трансплантированной ткани коры яичников в растворе Буэна приводила к размытым и в значительной степени затемненным флуоресцентным сигналам в фолликулярных клетках из-за зеленой дымки. (B) Ткань коры яичников, которая была зафиксирована формальдегидом, обеспечивала только отличные флуоресцентные сигналы, которые было легко интерпретировать. Стержни представляют собой 10 мкм. Увеличение сигналов FISH было установлено на 630x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для того чтобы определить содержание Х-хромосомы гранулезных клеток фолликулов в гистологических срезах, не представляется возможным просто подсчитать FISH-сигналы гранулезных клеток. Часть хромосом отдельной гранулезной клетки может быть потеряна в определенном гистологическом срезе, из-за рассечения ткани. Поэтому необходимо сначала определить процент сигналов FISH, потерянных из-за секции, прежде чем окончательно определить потерю содержания Х-хромосомы в популяции гранулезных клеток из-за анеуплоидии во вновь образованных вторичных и антральных фолликулах после пересадки ткани.

Процент потерянных сигналов FISH из-за секционирования можно рассчитать, определив количество сигналов FISH на гранулезную клетку неанеуплоидной контрольной хромосомы 18. Ожидается, что такой же процент Х-хромосомы теряется из-за секции. Любое дополнительное снижение количества сигналов FISH Х-хромосомы в популяции гранулезных клеток связано с анеуплоидией. Однако использование сигналов FISH контрольной хромосомы для определения потери Х-хромосомы из-за анеуплоидии требует, чтобы чувствительность обнаружения сигналов FISH Х-хромосомы и контрольной хромосомы была очень похожей. Таким образом, была определена чувствительность обнаружения обоих зондов FISH в гранулезных клетках растущих фолликулов в гистологических срезах неанеуплоидных лиц 46,ХХ. Когда соотношение сигналов FISH хромосомы X и контрольной хромосомы близко к 1, можно предположить, что чувствительность обнаружения обоих зондов действительно очень похожа, и что зонды FISH, таким образом, могут быть использованы для определения уровня анеуплоидии в популяции гранулезных клеток растущих фолликулов в гистологических срезах ткани яичника после ксенотрансплантации.

Пример
При анализе количества сигналов хромосомы 18 в 130 гранулезных клетках фолликула из яичника 46,XX индивидуума ожидается наличие 260 сигналов. Однако на участке этих клеток размером 4 мкм наблюдалось только 204 сигнала хромосомы 18. Это указывает на то, что 21,5% сигналов теряются из-за секционирования ((260-204)/260 x 100 = 21,5%). Таким образом, количество сигналов хромосомы 18 на гранулезную клетку уменьшается до 204/130 = 1,57 из-за секции.

Далее анализируется количество Х-хромосом в гранулезных клетках антрального фолликула после пересадки в ткань яичника женщины с ТС. Всего был подсчитан 191 сигнал для хромосомы X и 199 сигналов для хромосомы 18. Количество гранулезных клеток можно определить путем деления общего количества сигналов для хромосомы 18 на количество сигналов хромосомы 18 на гранулезную клетку (199/1,57 = 127 гранулезных клеток). Наконец, процентное содержание 45,X гранулезных клеток можно определить путем деления разницы в хромосомных 18 и хромосомных X-сигналах на количество гранулезных клеток (т.е. [199-191]/127 x 100 = 6% гранулезных клеток составляют 45,X, а 94% этих клеток 46,XX).

Примечательно, что у пациентов с клеточной линией 47,XXX можно определить минимальный процент гранулезных клеток с кариотипом 47,XXX, поскольку смесь гранулезных клеток 45,X и 47,XXX имеет такое же количество сигналов Х-хромосомы, как и гранулезные клетки 46,XX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ FISH является хорошо известным методом обнаружения Х-хромосомных аберраций в лимфоцитах или буккальных клетках как мужчин, так и женщин10. В нескольких исследованиях была описана FISH на гаметах мужчин с Х-хромосомными аберрациями, но подробная информация, полученная FISH на клетках яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями, все еще отсутствует14. В этой статье представлены новые методы, основанные на FISH, для определения наличия анеуплоидии в клетках яичников нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями.

Основная проблема протокола выделения отдельных клеток яичников в нетрансплантированной ткани коры яичников заключается в ферментативном переваривании ткани, что требует некоторой предварительной практики. Чтобы получить точные сигналы FISH о достаточном количестве клеток яичников, важно строго следовать шагам, касающимся ферментативного пищеварения, времени инкубации и указанной температуры. Отклонение от протокола может привести к существенной потере клеток яичников во время процесса, и этого особенно следует избегать у пациенток, которые уже имеют низкий овариальный резерв. Другим важным шагом в этом методе является обработка очищенных первичных фолликулов трипсином, чтобы предотвратить слипание ооцитов и гранулезной клеточной массы, что исключает анализ отдельных клеток. Без лечения трипсином количество отдельных гранулезных клеток, которые могут быть надежно проанализированы с помощью FISH, сильно снижается.

Анализ FISH на ткани коры яичников, полученной после длительной трансплантации, требует другой техники, поскольку было обнаружено, что только небольшие фолликулы достаточно восприимчивы к ферментативному пищеварению, необходимому для получения отдельных клеток яичника. Кроме того, подобно аутотрансплантации ткани коры яичника, многие фолликулы теряются после пересадки из-за гипоксии и недостатка питательных веществ до того, как трансплантат будет достаточно реваскуляризирован хозяином20. Поэтому ожидается, что количество фолликулов после трансплантации будет значительно ниже, чем до трансплантации. Для этого метода FISH, используемого для гистологических срезов, важно фиксировать пересаженную ткань в 4% формальдегиде только для получения оптимальных сигналов FISH. Фиксация ткани коры яичников в фиксаторе Буэна обычно используется в лаборатории, и, хотя это дает отличные результаты в сочетании со стандартным окрашиванием HE, фиксация ткани с помощью Буэна до FISH приводит к слабым и размытым флуоресцентным сигналам, которые трудно интерпретировать.

Хотя было доказано, что этот протокол успешно определяет содержание Х-хромосомы в клетках яичников, он все еще имеет некоторые ограничения. Одним из ограничений является то, что эти методы можно использовать только для анализа клеток яичников женщин с численными аберрациями. Числовые аберрации могут быть обнаружены с помощью зондов, направленных на повторяющиеся последовательности21. Эти зонды гибридизуют несколько повторяющихся последовательностей пар оснований в области центромеры, что приводит к сильным сигналам гибридизации. Напротив, структурные аберрации могут быть обнаружены только с помощью зондов против уникальных одиночных последовательностей. Эти зонды гибридизуются с последовательностями, которые встречаются только один раз в гаплоидном геноме, что приводит к значительно менее интенсивному сигналу FISH по сравнению с числовыми аберрациями. Из-за этих относительно слабых сигналов FISH трудно правильно определить содержание Х-хромосомы клеток яичников у женщин со структурными аберрациями.

Во-вторых, FISH-сигналы ооцитов малых фолликулов в нетрансплантированной ткани трудно анализировать из-за близкого расположения четырех сестринских хроматид в профазе мейоза I22. В ооцитах будет присутствовать только один сильный сигнал гибридизации, и поэтому невозможно просто подсчитать количество сигналов в ооцитах для определения содержимого Х-хромосомы. Вместо этого следует использовать поверхностное соотношение сигналов хромосомы X и 18 FISH для определения содержания X-хромосомы в этих клетках. Это может быть надежно определено только в том случае, если сигналы FISH в ооцитах явно присутствуют.

Кроме того, FISH на трансплантированной ткани может быть использован только для определения содержания Х-хромосомы гранулезных клеток из вторичных и антральных фолликулов, поскольку небольшие фолликулы в гистологических срезах трансплантированной ткани имеют только несколько гранулезных клеток, которые могут быть должным образом проанализированы. Кроме того, содержание Х-хромосомы в ооцитах не может быть точно определено с помощью этого метода из-за большого диаметра ооцитов.

Наконец, по-прежнему сложно получить женские гаметы по сравнению с мужскими гаметами, потому что для получения клеток яичников или ткани коры яичников требуется инвазивная хирургия. Поэтому эти методы, скорее всего, будут применяться в исследовательских условиях.

В заключение, FISH-анализ клеток яичников нетрансплантированной и трансплантированной ткани коры яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы является уникальным и полезным методом для получения представления о содержании Х-хромосомы клеток яичников в этой конкретной группе. Эти методы показывают, что криоконсервация ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями возможна, и что криоконсервированные примордиальные фолликулы способны расти во вторичные и антральные фолликулы. Однако следует иметь в виду, что оба метода предназначены для облегчения будущих исследований у женщин с аберрациями Х-хромосомной и не предназначены для использования в качестве диагностического инструмента для скрининга репродуктивных исходов женщин с аберрациями Х-хромосомной в клинической практике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Авторы выражают признательность Марьо ван Бракелю, Доминику Смитсу, Гийому ван де Занде, Патрисии ван Клиф и Милану Интезару за их опыт и техническую помощь. Источники финансирования: Merck Serono (A16-1395), Goodlife и Ferring.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Biosolve BV 0001070602BS
Centrifuge 1200 Hettich Universal 4140
Collagenase I Sigma 131470
Coverslip VWR 0631-0146
DAPI Vector H-1200
DNase I Roche 10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Lonza BE17-513Q
EDTA Merck 108421
Eosin-Y Sigma 1159350100
Ethanol EMSURE 1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technology 10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B Leica Microsystems 
Fluorescence microscope scope A1 Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells Abbott Diagnostics CEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections Abbott Diagnostics CEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde Sigma 252549
Glucose Merck 108337
Glue (Fixogum) Leica Microsystems LK071A
Hematoxylin Sigma 1159380025
Hybridization buffer Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001
Hybridization Station  Dako S2451
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections  Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides Dako K802021-2
L15 Lonza 12-700Q
Liberase DH Roche 05 401 151 001
Light microscope Zeiss West Germany
Magnesium sulphate Merck A335586
Methanol Honeywell 14262-1L
Mounting medium Vectashield, Vector H-1000
Nonidet P40 Sigma 7385-1L
Paraffin Poth Hile 2712.20.10
Pepsin Sigma P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 11530546
Plastic pipette CooperSurgical 7-72-4075/1
Potassium chloride  Merck 1049361000
Proteinase K Qiagen 19131
Rotation microtome HM 355S Thermo sceintific
Scalpel Dahlhausen 11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells Thermo scientific J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate Sigma 55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC) Fisher Scientific, Invitrogen 10515203
Stereomicroscope IX 70 Olympus
Target Retrieval Solution    Dako GV80511-2
Trypsin Sigma T4799
Tween-20 ThermoFisher 85113
Xylene BOOM 760518191000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Tags

Генетика выпуск 194
Изучение Х-хромосомных аберраций в клетках яичников с использованием флуоресцентной гибридизации <em>in situ</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nadesapillai, S., van der Velden,… More

Nadesapillai, S., van der Velden, J., Braat, D., Fleischer, K., Peek, R. Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (194), e64734, doi:10.3791/64734 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter