Summary
Qui, presentiamo l'applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l'attività delle nanoparticelle come battericidi.
Abstract
La microscopia elettronica è uno degli strumenti necessari per caratterizzare le strutture cellulari. Tuttavia, la procedura è complicata e costosa a causa della preparazione del campione per l'osservazione. La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di caratterizzazione molto utile grazie alla sua alta risoluzione in tre dimensioni e all'assenza di qualsiasi requisito per il vuoto e la conduttività del campione. AFM può visualizzare un'ampia varietà di campioni con diverse topografie e diversi tipi di materiali.
AFM fornisce informazioni topografiche 3D ad alta risoluzione dal livello di angstrom alla scala dei micron. A differenza della microscopia tradizionale, AFM utilizza una sonda per generare un'immagine della topografia superficiale di un campione. In questo protocollo, l'uso di questo tipo di microscopia è suggerito per la caratterizzazione morfologica e del danno cellulare di batteri fissati su un supporto. Sono stati utilizzati ceppi di Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isolati da campioni di bulbo d'aglio). In questo lavoro, le cellule batteriche sono state coltivate in specifici terreni di coltura. Per osservare il danno cellulare, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli sono stati incubati con diverse concentrazioni di nanoparticelle (NP).
Una goccia di sospensione batterica è stata fissata su un supporto di vetro e le immagini sono state scattate con AFM a diverse scale. Le immagini ottenute hanno mostrato le caratteristiche morfologiche dei batteri. Inoltre, utilizzando l'AFM, è stato possibile osservare il danno alla struttura cellulare causato dall'effetto delle NP. Sulla base delle immagini ottenute, l'AFM a contatto può essere utilizzato per caratterizzare la morfologia delle cellule batteriche fissate su un supporto. L'AFM è anche uno strumento adatto per lo studio degli effetti delle NP sui batteri. Rispetto alla microscopia elettronica, l'AFM è una tecnica economica e facile da usare.
Introduction
Diverse forme batteriche sono state notate per la prima volta da Antony van Leeuwenhoek nel 17 ° secolo1. I batteri sono esistiti in una grande diversità di forme fin dai tempi antichi, che vanno dalle sfere alle cellule ramificate2. La forma cellulare è una condizione fondamentale per i tassonomisti batterici per descrivere e classificare ogni specie batterica, principalmente per la separazione morfologica dei phyla gram-positivi e gram-negativi3. Diversi elementi sono noti per determinare le forme cellulari batteriche, che sono tutti coinvolti nelle coperture cellulari e nel supporto come componenti della parete cellulare e della membrana, nonché nel citoscheletro. In questo modo, gli scienziati stanno ancora chiarendo i meccanismi e i processi chimici, biochimici e fisici implicati nella determinazione delle forme cellulari batteriche, che sono tutti definiti da gruppi di geni che definiscono le forme batteriche 2,4.
Inoltre, gli scienziati hanno dimostrato che la forma dell'asta è probabilmente la forma ancestrale delle cellule batteriche, poiché questa forma cellulare appare ottimale nei parametri significativi delle cellule. Pertanto, cocchi, spirale, vibrione, filamentoso e altre forme sono considerati adattamenti a vari ambienti; Infatti, particolari morfologie si sono evolute indipendentemente più volte, suggerendo che le forme dei batteri potrebbero essere adattamenti a particolari ambienti 3,5. Tuttavia, durante tutto il ciclo di vita delle cellule batteriche, la forma della cellula cambia, e questo si verifica anche come risposta genetica a condizioni ambientali dannose3. La forma e le dimensioni delle cellule batteriche determinano fortemente la rigidità, la robustezza e il rapporto superficie-volume dei batteri, e questa caratteristica può essere sfruttata per processi biotecnologici6.
La microscopia elettronica viene utilizzata per studiare campioni biologici a causa dell'elevato ingrandimento che può essere raggiunto oltre i microscopi basati sulla luce. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la microscopia elettronica a scansione (SEM) sono le tecniche più comunemente utilizzate per questo scopo; Tuttavia, i campioni richiedono alcuni trattamenti prima di essere inseriti nella camera del microscopio al fine di ottenere immagini appropriate. È necessaria una copertina dorata sui campioni e il tempo utilizzato per l'acquisizione totale dell'immagine non dovrebbe essere troppo lungo. Al contrario, la microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica ampiamente utilizzata nell'analisi delle superfici, ma è anche impiegata nello studio di campioni biologici.
Esistono diversi tipi di modalità AFM utilizzate nell'analisi delle superfici, come la modalità di contatto, la modalità senza contatto o la maschiatura, la microscopia a forza magnetica (MFM), l'AFM conduttivo, la microscopia a forza piezoelettrica (PFM), la maschiatura della forza di picco (PFT), la risonanza di contatto e il volume della forza. Ogni modalità viene utilizzata nell'analisi dei materiali e fornisce informazioni diverse sulla superficie dei materiali e sulle loro proprietà meccaniche e fisiche. Tuttavia, alcune modalità AFM sono utilizzate per l'analisi di campioni biologici in vitro, come PFT, perché PFT consente di ottenere dati topografici e meccanici su cellule in un mezzo liquido7.
In questo lavoro, abbiamo utilizzato la modalità più semplice inclusa in ogni vecchio e semplice modello AFM: la modalità di contatto. AFM utilizza una sonda affilata (circa <50 nm di diametro) per scansionare aree inferiori a 100 μm. La sonda è allineata al campione per interagire con i campi di forza associati al campione. La superficie viene scansionata con la sonda per mantenere costante la forza. Quindi, viene generata un'immagine della superficie monitorando il movimento del cantilever mentre si muove sulla superficie. Le informazioni raccolte forniscono le proprietà nano-meccaniche della superficie, come l'adesione, l'elasticità, la viscosità e il taglio.
Nella modalità di contatto AFM, il cantilever viene scansionato attraverso il campione con una deflessione fissa. Ciò consente di determinare l'altezza dei campioni (Z), e questo rappresenta un vantaggio rispetto alle altre tecniche di microscopio elettronico. Il software AFM consente la generazione di una scansione di immagini 3D mediante l'interazione tra la punta e la superficie del campione e la deflessione della punta è correlata all'altezza del campione attraverso un laser e un rivelatore.
In modalità statica (modalità contatto) con forza costante, l'uscita presenta due immagini diverse: l'altezza (topografia z) e il segnale di deflessione o errore. La modalità statica è una modalità di imaging preziosa e semplice, in particolare per campioni robusti in aria in grado di gestire gli elevati carichi e le forze torsionali esercitate dalla modalità statica. La modalità di deflessione o errore viene azionata in modalità forza costante. Tuttavia, l'immagine topografica viene ulteriormente migliorata aggiungendo il segnale di deflessione alla struttura della superficie. In questa modalità, il segnale di deflessione viene anche definito segnale di errore poiché la deflessione è il parametro di feedback; Qualsiasi caratteristica o morfologia che appare in questo canale è dovuta all'"errore" nel ciclo di feedback o, meglio, al ciclo di feedback richiesto per mantenere un setpoint di deflessione costante.
Il design unico di AFM lo rende compatto - abbastanza piccolo da stare su un tavolo - pur avendo una risoluzione abbastanza alta per risolvere i passaggi atomici. L'apparecchiatura AFM ha un costo inferiore rispetto alle apparecchiature per altri microscopi elettronici e i costi di manutenzione sono minimi. Il microscopio non richiede un laboratorio con condizioni particolari come una camera bianca o uno spazio isolato; Ha solo bisogno di una scrivania priva di vibrazioni. Per l'AFM, i campioni non devono essere sottoposti a una preparazione elaborata come per altre tecniche (copertura dorata, dimagrimento); Solo un campione secco deve essere attaccato al portacampioni.
Utilizziamo la modalità di contatto AFM per osservare le morfologie batteriche e gli effetti delle NP. Si può osservare la popolazione e la morfologia cellulare dei batteri fissati su un supporto, così come il danno cellulare prodotto dalle nanoparticelle sulle specie batteriche. Le immagini ottenute dalla modalità di contatto AFM confermano che si tratta di uno strumento potente e non limitato da reagenti e procedure complicate, rendendolo un metodo semplice, veloce ed economico per la caratterizzazione batterica.
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Protocol
1. Isolamento batterico e identificazione
- Isolamento di un ceppo endofitico dai meristemi del bulbo d'aglio:
- Posizionare frammenti di meristemi di 2 mm provenienti da bulbi d'aglio precedentemente sbucciati, disinfettati e tagliati su agar di soia tripticasi (TSA) come mezzo di crescita ricco e incubare a 25 °C per 1 giorno.
- Sulla base delle differenze morfologiche delle colonie batteriche - forma, dimensione, colore, bordo, luce trasmessa, luce riflessa, consistenza, consistenza e produzione di pigmento - descrivere i diversi morfotipi osservati e purificare striando una colonia rappresentativa di ciascun morfotipo.
- Conservare tutti i ceppi batterici purificati in glicerolo al 30% a -80 °C.
- Identificare un ceppo selezionato casualmente (9AP) sequenziando il rDNA 16S. Estrarre il DNA seguendo il metodo di Hoffman e Winston8.
- Amplificare l'rRNA 16S mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) con 100 ng di DNA, 1x tampone polimerasi, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 10 pmol ciascuno di oligonucleotidi universali 27F/1492r e 1 U di DNA polimerasi9. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclatore: 95 °C per 5 min per la denaturalizzazione iniziale; seguiti da 35 cicli di 1 min a 94 °C come temperatura di denaturalizzazione, 1 min a 56 °C come temperatura di ibridazione e 1 min a 72 °C come temperatura di estensione; e poi 10 minuti a 72 °C come estensione finale.
- Sequenziare capillarmente il prodotto della PCR utilizzando gli stessi oligonucleotidi; Utilizzare il metodo dideossi-terminale con il kit di installazione a matrice per il sequenziamento capillare10 ed eseguire l'elettroforesi in un sistema multicapillare automatizzato11.
- Modificare manualmente le sequenze, confrontare la sequenza con la libreria GenBank utilizzando una ricerca BLAST e identificare provvisoriamente il ceppo con il gold standard di almeno il 98,7% di identità con la specie più vicina12,13.
NOTA: Il ceppo 9AP è stato identificato come appartenente alla specie di Pseudomonas hunanensis, con un'identità del 99,86% con la sequenza per il ceppo P. hunanensis LV (JX545210).
2. Preparazione del campione batterico per l'osservazione morfologica mediante AFM
- In condizioni sterili, posizionare una goccia della sospensione batterica (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) su un vetrino.
- Fissare i campioni sul vetrino riscaldando a secco. Passare il vetrino delicatamente su una fiamma più volte fino a quando il campione è asciutto.
NOTA: La fissazione dei campioni è una tecnica di routine in microbiologia per osservare organismi procarioti fissi e per simulare la loro struttura come cellule viventi il più fedelmente possibile. - Posizionare i campioni fissi in una capsula di Petri e portarli all'apparecchiatura AFM per l'osservazione.
NOTA: Poiché i campioni possono essere alterati dalle condizioni meteorologiche nel tempo, riservare un tempo massimo di 24 ore per l'analisi nell'apparecchiatura AFM. Mantenere i campioni liberi da polvere.
3. Effetto antibatterico delle nanoparticelle di MgO contro i batteri
NOTA: La sintesi e la caratterizzazione delle NP di MgO sono state pubblicate in precedenza14. In questo lavoro, l'attività antibatterica dei nanomateriali è stata stimata sulla base del manuale del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizzando metodi di macrodiluizione e microdiluizione per l'inibizione15,16.
- Stima dell'attività inibitoria minima (MIC) e dei battericidi (CMB)
- Precrescita dei ceppi
- Inoculare una quantità appropriata di Escherichia coli o Staphylococcus aureus in brodo nutriente per ottenere una concentrazione finale di 1 × 108 CFU/ml.
- Incubare la sospensione a 37 °C (± 2 °C) per 18-24 ore.
- Postcrescita di ceppi acclimatati
- Immergere un anello batteriologico sterile nella sospensione, toccando il fondo del tubo.
- Eseguire striature con il cappio su agar eosina e blu di metilene e agar nutriente.
- Incubare le piastre di agar a 37 °C (± 2 °C) per 24 ore.
- Selezione delle colonie per la preparazione dell'inoculo standardizzato
- Prendi da tre a cinque colonie con lo stesso tipo morfologico toccando la parte superiore della colonia nella capsula di Petri con un anello batteriologico.
- Trasferire e immergere la selezione in 3-5 ml di brodo Müller-Hinton.
- Incubare a 37 °C (± 2 °C) per ottenere una torbidità di 1 × 10 8 CFU/mL o 2 × 108 CFU/mL.
NOTA: In questo lavoro, gli standard di torbidità di McFarland sono stati utilizzati come riferimento per le sospensioni batteriologiche; in particolare, lo standard 0,5 corrisponde approssimativamente a una sospensione omogenea di E. coli di 1,5 × 108 cellule/ml. Uno spettrofotometro UV-Vis è stato utilizzato per misurare la torbidità. - Prendi 1 ml e aggiungilo a 9 ml di brodo sterile. Prelevare 200 μL di questa diluizione e aggiungerla a 19,8 mL di brodo sterile per ottenere una concentrazione finale di 5 × 105 CFU/ml.
- Concentrazioni richieste di nanoparticelle di MgO
- Utilizzare un ultrasuoni per la preparazione delle soluzioni.
- Sospendere il nanomateriale in acqua sterile al doppio della concentrazione necessaria per ottenere soluzioni seriali.
- Aggiungere queste sospensioni a tubi sterili contenenti brodo Müller-Hinton per ottenere la nuova gamma di concentrazioni richieste per l'esperimento.
NOTA: Per la microdiluizione sono state applicate le seguenti concentrazioni di NP di MgO: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm e 8.000 ppm.
- Preparazione della microdiluizione15
- Preparare una nuova e sterile micropiastra da 96 pozzetti (micropiastra). Etichetta colonna n. 12 della micropiastra come colonna di sterilità; etichettare la colonna n. 11 come colonna di controllo della crescita.
- Aggiungere 120 μL delle sospensioni di nanoparticelle con le diverse concentrazioni alle colonne n. 1-10.
- Inoculare 120 μL di batteri (5 × 105 CFU/ml) nei pozzetti nelle colonne n. 1-10.
NOTA: Per questo studio, la riga G e la riga H erano controlli con ceftriaxone alle concentrazioni suggerite dagli standard CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm e 0,03 ppm. - Incubare la micropiastra a 96 pozzetti per 24 ore a 37 °C (35 °C ± 2 °C). Infine, analizza i pozzi.
- Precrescita dei ceppi
- Osservazione dei cambiamenti morfo-strutturali indotti da nanoparticelle di MgO nei ceppi batterici mediante AFM
- Prelevare 250 μL dai pozzetti delle prove di microdiluizione, mescolare con 750 μL di acqua sterile e centrifugare a 2.000 × g da 2 min a 5 min a 5 °C.
- Lavare i precipitati tre volte con 1 ml di acqua sterile ogni volta e, alla fine dei lavaggi, aggiungere 500 μL di acqua.
- Per ottenere le immagini AFM, prelevare 10-20 μL della sospensione finale di ciascun pozzetto di partenza, eseguire uno striscio su un vetrino precedentemente pulito dagli ultrasuoni (30 min) e asciugare a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Misurazioni AFM
NOTA: Qui, il microscopio a forza atomica in modalità contatto è stato montato su una postazione di lavoro antivibrante che ha permesso l'isolamento del microscopio da qualsiasi fonte vibrazionale meccanica e ha mantenuto il sistema livellato. Le interferenze elettriche sono ridotte con i filtri di linea e la protezione da sovratensioni. L'AFM utilizzato qui allinea automaticamente il raggio laser al fotorivelatore.
- Accendere il computer e l'AFM, quindi selezionare la modalità Contatto, le sonde contAI-G e le opzioni di Pendenza automatica negli strumenti software. I valori predefiniti del controller Z sono Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10.000, I-Gain = 1.000, D-Gain = 0 e Tensione di punta = 0 mV.
- Posizionare i campioni nella modalità di contatto AFM utilizzando una testina di scansione da 70 μm. Abbiamo utilizzato cantilever in silicio ContAI-G con una costante di molla di 0,13 N/m.
- Utilizzare un dispositivo fotocamera montato su due obiettivi integrati nella testina di scansione per ottenere una rapida visione della superficie dell'area sotto la sonda.
- Eseguire manualmente uno spostamento nel piano XY per scegliere l'area desiderata. La sonda è fatta per avvicinarsi elettronicamente al campione di superficie fino al raggiungimento delle condizioni di contatto. Regolare elettronicamente il piano di misura XY dello scanner e la superficie del campione riducendo le pendenze nelle direzioni XY.
- Utilizzare i parametri standard del software: 1 linea al secondo a 256 punti per linea.
- Innanzitutto, eseguire un intervallo di scansione completo di un'area di 70 μm x 70 μm; Quindi, selezionate un'area più piccola utilizzando lo strumento zoom. L'AFM ottimizza automaticamente l'intervallo del grafico in Z.
NOTA: diminuendo le linee al secondo, il tempo di scansione totale aumenta, la qualità della scansione è più definita e viene eliminato anche il rumore della misurazione. - Per selezionare una nuova area dal campione, ritrarre elettronicamente il cantilever e spostare il campione lungo il piano XY. Eseguire una nuova scansione utilizzando la procedura descritta nei passaggi 4.5 e 4.6.
NOTA: le scansioni ottenute sono mostrate in una scala a barre monocolore, in cui i colori chiari sono associati ad altitudini più elevate e i colori scuri sono associati ad altitudini più profonde. Il software AFM genera una vista 3D della scansione che consente di apprezzare i dettagli della superficie misurata. - Eseguire l'elaborazione dei dati utilizzando il livellamento riga per riga nel menu Strumenti dell'immagine nella selezione del filtro, che è il metodo di livellamento più utilizzato e più semplice.
NOTA: Questo metodo di livellamento prende ogni linea orizzontale o verticale prodotta nell'immagine AFM e la adatta a un'equazione polinomiale. - Ottimizza l'altezza massima e minima nella barra dei colori a destra per ottenere la migliore risoluzione dell'immagine.
- Eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando il menu Analisi nella barra degli strumenti. Determinare le altezze e le distanze selezionando i punti iniziale e finale una volta selezionato l'utensile desiderato.
NOTA: gli utenti devono provare i diversi filtri del menu Strumenti per evitare artefatti dell'immagine della punta dovuti all'appiattimento utilizzato nel processo di livellamento. Gli artefatti dell'immagine appaiono come linee di striature e sono mostrati in alcune delle immagini AFM.
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Representative Results
Le immagini della morfologia e delle dimensioni dei ceppi di S. aureus e P. hunanensis , così come l'organizzazione della popolazione di entrambi i ceppi, sono state prese mediante microscopia a forza atomica in modalità contatto. Le immagini di S. aureus hanno mostrato che la sua popolazione era distribuita per zone con aggregati di cocchi (Figura 1A). Con l'aumento della scala, c'è stato un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della morfologia dei cocchi (Figura 1B). I rapporti di microscopia hanno mostrato che una struttura pseudo-emisferica era presente nelle cellule adiacenti di S. aureus, ma che in generale, i batteri presentavano una morfologia sferica sotto forma di un cocco dopo la divisione cellulare, come precedentemente mostrato nelle immagini AFM. Inoltre, le immagini della modalità di contatto AFM hanno permesso di determinare la dimensione dei cocchi, che hanno mostrato una larghezza media di 1,25 μm. I valori ottenuti dalla misurazione di 20 celle sono mostrati in Figura 2.
Nel caso di P. hunanensis, è stata osservata una distribuzione omogenea su tutta la superficie del supporto vetroso, formando un monostrato batterico che ha aderito al supporto (Figura 3A), come riportato da Zuttion et al., in cui gli autori hanno immobilizzato P. aureginosa su un supporto solido e hanno mostrato lo stesso comportamento. I batteri Pseudomonas hunanensis sono stati osservati a forma di bastoncello, con una lunghezza di 1,9 μm (L) e una larghezza di 0,9 μm (W) (Figura 3B,C); questi dati rientrano nei valori riportati per P. fluorescens di 1,5-2,0 μm (L) e 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
Per visualizzare le alterazioni morfostrutturali dovute all'interazione delle NP di MgO, i ceppi batterici sono stati sottoposti ad analisi AFM dopo il trattamento (microdiluizione). Nella Figura 4 e nella Figura 5 sono mostrati tre gruppi: Figura 4A-C e Figura 5A-C sono i controlli; le immagini in Figura 4D-F e Figura 5D-F sono state ottenute dai risultati della microdiluizione al MIC; le immagini della Figura 4G-I e della Figura 5G-I sono state ottenute ad una concentrazione superiore rispetto al MIC.
Le immagini del gruppo superiore della Figura 4A-C mostrano una cellula di tipo cocco di Staphylococcus aureus con una superficie liscia e contorni omogenei, che è cresciuta in un ambiente adatto nel brodo di Müeller-Hinton per 24 ore secondo la tecnica di microdiluizione. Il diametro medio era di 1 μm ± 0,15 μm. Questo diametro è praticamente scomparso dopo il trattamento NP, come mostrato in Figura 4D-F, poiché il deterioramento della struttura cellulare era molto grave. Secondo la sezione trasversale, l'altezza media per il controllo era di 200 nm ± 50 nm; L'altezza delle cellule trattate è stata ridotta del 40% (120 nm ± 5 nm) rispetto ai controlli. Le immagini mostrano chiaramente cambiamenti nella superficie, come la formazione di vescicole, in seguito all'esposizione a NP MgO nel CMI delle particelle; inoltre, raddoppiando le concentrazioni, lo stato interno delle strutture cellulari è stato influenzato e il materiale citosolico è stato rilasciato, come mostrato nelle immagini della Figura4G-I 20,21.
Questi cambiamenti sono stati identificati anche nelle cellule di E. coli, come mostrato nella Figura 5, con condizioni simili a S. aureus. I controlli di questo batterio hanno mostrato superfici lisce, evidenziando la sua forma molto omogenea a bastoncello (bacillo) senza alcuna apparente alterazione. Le immagini tridimensionali mostrano le regioni topografiche più alte associate al microrganismo in bianco. L'altezza media del controllo E. coli era di 160 nm ± 50 nm e, secondo le immagini della sezione trasversale, l'altezza media è scesa a 76 nm ± 10 nm per le cellule esposte per 24 ore a una concentrazione di nanoparticelle di MgO di 500 ppm (MIC). La struttura scomparve completamente a una concentrazione di 1.000 ppm e si potevano distinguere solo le sagome dei batteri. Analizzando le immagini per entrambe le concentrazioni, è stato osservato che rispetto ai controlli, la morfologia cellulare delle cellule trattate era significativamente alterata, con un allungamento di 2,0 μm ± 0,5 μm (Figura 5A-C) a 3,0 μm ± 0,3 μm, come mostrato nelle immagini della Figura 5D-I. Questo aumento era chiaro quando la struttura cellulare stava perdendo l'omeostasi interna, causando il collasso strutturale20,22. Le immagini dei batteri esposti alle NP di MgO hanno mostrato chiaramente cambiamenti superficiali come la formazione di creste o ondulazioni che formano disturbi vescicolari sia alle MICs che quando si raddoppiano le concentrazioni20,22.
Figura 1: Modalità di contatto al microscopio a forza atomica per Staphylococcus aureus. Questa figura mostra le topografie prese da S. aureus a diverse scale: (A) 70 μm e (B) 5,0 μm. Le aree di mappatura sono state scelte per ottenere la topografia di S. aureus ; l'immagine B mostra chiaramente i cocchi di S. aureus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Topografie e istogrammi di Staphylococcus aureus in modalità di contatto al microscopio a forza atomica. L'immagine mostra la topografia (A) e (B) istogramma dei diametri dei batteri S. aureus fissati su un supporto di vetro mediante la procedura di fissazione del calore. Il diametro della cella è stato misurato con il software AFM; n = 20. L'immagine è una rappresentazione della misurazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Modalità di contatto al microscopio a forza atomica per Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Questa figura mostra le topografie prese da P. hunanensis 1AP-CY a diverse scale: (A) 70 μm, (B) 20 μm e (C) 5,0 μm. Le immagini a diverse scale mostrano la distribuzione della popolazione cellulare sul vetrino. Per analizzare la morfologia cellulare, viene focalizzata un'area con una densità di popolazione inferiore, come mostrato nell'immagine B, che mostra la forma del bastoncello di P. hunanensis (il segnale di deflessione viene mostrato per migliorare l'immagine topografica). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Immagini della modalità di contatto AFM ottenute per S. aureus non trattati (in alto) e S. aureus esposti a nanoparticelle di MgO a 250 ppm e 500 ppm (al centro e in basso) per 24 ore. (A,D,G) Immagini topografiche; (B,E,H) immagini tridimensionali; (C,F,I) immagini in sezione trasversale. Cambiamenti strutturali nei batteri sono stati osservati quando si impiegava la concentrazione minima inibitoria di MgO (250 ppm) e una concentrazione più elevata (500 ppm). Il segnale di deflessione viene mostrato per migliorare l'immagine topografica. Le figure 4A,D,G sono tratte da Muñiz Diaz et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Immagini della modalità di contatto AFM ottenute per E. coli non trattati (in alto) ed E. coli esposti a nanoparticelle di MgO a 500 ppm e 1.000 ppm (al centro e in basso) per 24 ore. (A,D,G) Immagini topografiche; (B,E,H) immagini tridimensionali; (C,F,I) immagini in sezione trasversale. Cambiamenti strutturali nei batteri sono stati osservati quando si impiegava la concentrazione minima inibitoria di MgO (500 ppm) e una concentrazione più elevata (1.000 ppm). Le figure 5A,D,G sono tratte da Muñiz Diaz et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La microscopia è una tecnica comunemente usata nei laboratori biologici che consente di studiare la struttura, le dimensioni, la morfologia e la disposizione cellulare dei campioni biologici. Per migliorare questa tecnica, possono essere utilizzati diversi tipi di microscopi che differiscono tra loro in termini di caratteristiche ottiche o elettroniche, che determinano la potenza di risoluzione dello strumento.
Nella ricerca scientifica, l'uso della microscopia è richiesto per la caratterizzazione delle cellule batteriche; ad esempio, la microscopia ha dimostrato che NaCl influenza la resistenza termica e la morfologia cellulare dei ceppi di E. coli, l'estratto di Schisandra chinensis mostra effetti antibatterici verso S. aureus, S. aureus sviluppa termotolleranza dopo shock termico subletale ed E. coli biomineralizza il platino 23,24,25,26,27 . Pertanto, i vantaggi presentati da AFM hanno permesso la sua espansione alle aree di ricerca dell'ambiente e della biologia.
Il microscopio a forza atomica è uno strumento utilizzato in modalità contatto per analizzare i batteri in situ e in modalità senza contatto per determinare la topografia di materiali macro e nanoscopici. Il vantaggio dell'AFM rispetto ad altre tecniche è che richiede meno campioni per ottenere immagini topografiche; È anche considerata una tecnica non distruttiva e non danneggia o compromette la struttura dell'immagine analizzata. Sebbene abbiamo usato la fissazione del calore in questo protocollo, la morfologia delle cellule batteriche non è stata alterata. È importante ricordare che questa tecnica è comunemente utilizzata nel laboratorio di microbiologia per studiare le morfologie batteriche. A differenza dei campioni di tessuti vegetali e animali, la tecnica di fissazione del calore produce cambiamenti nelle proteine e nei lipidi che si manifestano nel deterioramento dei tessuti; Nei batteri, la tecnica provoca un leggero restringimento della cellula che non interferisce con l'osservazione della forma e dell'identificazione cellulare.
Con l'AFM, la preparazione del campione è semplice e non richiede alcun prodotto chimico, come nel caso della microscopia elettronica, dove è essenziale che il campione da analizzare sia conduttivo, poiché l'immagine è prodotta dall'interazione degli elettroni emessi dall'apparecchiatura e dal campione. Se il campione non è conduttivo, deve essere metallizzato con un elemento conduttivo come l'oro mediante la tecnica di deposizione fisica da vapore. Inoltre, la risoluzione della microscopia elettronica raggiunge fino a 0,4 nm, a seconda della lente e del modello, mentre l'AFM in modalità contatto può raggiungere la risoluzione micrometrica, nanometrica o persino picometrica, il che la rende competitiva con la microscopia elettronica22. Un altro vantaggio dell'AFM rispetto alla microscopia elettronica è che non richiede condizioni di alto vuoto per l'elaborazione del campione20,21. Altri vantaggi dell'AFM rispetto alle tecniche comunemente utilizzate sono il basso costo e il breve tempo di acquisizione delle immagini.
Per quanto riguarda la tecnica di fissaggio del campione batterico a una lastra di vetro, è importante ricordare che la fissazione del calore è una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori di microbiologia. Questa tecnica viene utilizzata in modo che i campioni batterici possano essere identificati mediante colorazione semplice o differenziale. Allo stesso tempo, si può vedere la forma dei batteri, comunemente cocchi o bastoncelli. Uno svantaggio della tecnica di fissazione del calore è la diminuzione delle dimensioni dei batteri, ma questa tecnica non compromette la forma dei batteri.
Dopo la fissazione, è necessario prestare attenzione per evitare l'invecchiamento del campione, che può manifestarsi come una significativa diminuzione delle dimensioni della cellula; Pertanto, è consigliabile analizzare il campione entro 24 ore dalla fissazione. Occorre inoltre prestare attenzione per garantire che il campione non sia esposto alla polvere; i campioni devono pertanto essere conservati in un contenitore chiuso (ad esempio, una capsula di Petri). Queste condizioni sono critiche in quanto possono alterare le immagini AFM ottenute.
È chiaro che la diminuzione delle dimensioni dei batteri può influire su alcuni lavori di ricerca, nonché che potrebbero essere necessari altri modi per attaccare i batteri a un supporto. Ad esempio, i biofilm di S. aureus coltivati in brodo BM su piastre da 34 mm sono stati fissati con gliceraldeide. Inoltre, S. aureus è stato immobilizzato con cantilever a V trattati con poli-l-lisina, mentre per C. albicans, le ife sono state fissate su vetrini rivestiti di poli-l-lisina caricata positivamente al fine di analizzare lo scambio di sieroproteine adsorbite durante l'adesione di entrambi ad una superficie abiotica28,29.
In questo lavoro, il fissaggio termico dei campioni non ha alterato la forma o gli aggregati formati dai batteri e il fissaggio del calore ha permesso di visualizzare l'effetto delle nanoparticelle. Pertanto, le topografie AFM potrebbero mostrare la forma dei cocchi o aggregati isolati di S. aureus e le aste di P. hunanensis (Figura 1 e Figura 3). Inoltre, abbiamo anche scoperto che S. aureus ed E. coli hanno mostrato danni nelle loro strutture a causa dell'effetto delle nanoparticelle di MgO, mentre i campioni di controllo (senza nanoparticelle) non hanno mostrato alcuna alterazione nella loro morfologia (Figura 4 e Figura 5).
Questo lavoro dimostra che l'uso della modalità di contatto AFM è una valida alternativa per caratterizzare la topologia superficiale e i difetti dei campioni biologici, come è stato dimostrato con S. aureus, P. hunanensis ed E. coli. Inoltre, la tecnica di fissazione del calore non è un fattore determinante che altera la superficie cellulare e impedisce l'analisi. Modestamente, possiamo suggerire che la fissazione del calore può essere un vantaggio nell'uso di AFM. I campioni vengono elaborati meno e viene evitato l'uso di reagenti chimici. Pertanto, la metodologia è una tecnica semplice ed economica. Vale la pena ricordare che questo può cambiare a seconda dell'analisi specifica da eseguire, come mostrato per lo studio dei biofilm e dell'adesione batterica28,29. Come possibile estensione di questo lavoro, la modalità di contatto AFM potrebbe essere utilizzata per analizzare l'effetto delle NP su altri batteri importanti dal punto di vista medico o nella ricerca in cui deve essere osservato il danno cellulare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz ringrazia CONACyT per la borsa di studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
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