Summary
In deze studie wordt een rattenmodel van inductie van parodontitis gepresenteerd via een combinatie van retentieve ligatuur en repetitieve injecties van lipopolysaccharide afgeleid van Porphyromonas gingivalis, gedurende 14 dagen rond de eerste maxillaire kiezen. De ligatie- en LPS-injectietechnieken waren effectief in het induceren van peridontitis, resulterend in alveolair botverlies en ontsteking.
Abstract
Parodontitis (PD) is een veel voorkomende, chronische immuunontstekingsziekte van het parodontium, die resulteert in een verlies van gingivaal zacht weefsel, parodontale ligament, cementum en alveolair bot. In deze studie wordt een eenvoudige methode van PD-inductie bij ratten beschreven. We geven gedetailleerde instructies voor het plaatsen van het ligatuurmodel rond de eerste maxillaire kiezen (M1) en een combinatie van injecties met lipopolysaccharide (LPS), afgeleid van Porphyromonas gingivalis aan de mesio-palatale kant van de M1. De inductie van parodontitis werd gedurende 14 dagen gehandhaafd, waardoor de accumulatie van bacteriën, biofilm en ontsteking werd bevorderd. Om het diermodel te valideren, werd IL-1β, een belangrijke ontstekingsmediator, bepaald door een immunoassay in de gingivale creviculaire vloeistof (GCF) en werd het alveolaire botverlies berekend met behulp van cone beam computed tomography (CBCT). Deze techniek was effectief in het bevorderen van gingivarecessie, alveolair botverlies en een toename van IL-1β-niveaus in de GCF aan het einde van de experimentele procedure na 14 dagen. Deze methode was effectief in het induceren van PD en kon dus worden gebruikt in studies naar ziekteprogressiemechanismen en toekomstige mogelijke behandelingen.
Introduction
Parodontitis (PD) is de zesde meest voorkomende volksgezondheidsaandoening wereldwijd, die ongeveer 11% van de totale bevolking treft, een geavanceerde, onomkeerbare en destructieve vorm van parodontitis 1,2. PD is een ontstekingsproces dat de gingivale en parodontale weefsels aantast, wat resulteert in gingivarecessie, apicale migratie van het junctionele epitheel met pocketontwikkeling en het verlies van alveolair bot3. Bovendien wordt PD geassocieerd met verschillende systemische ziekten, waaronder hart- en vaatziekten, obesitas, diabetes en reumatoïde artritis, waarvoor omgevings- en gastheerspecifieke factoren een belangrijke rol spelen 4,5.
Vandaar dat PD een multifactoriële ziekte is die voornamelijk wordt geïnitieerd door de accumulatie van microbiële plaque - als gevolg van dysbiose van microbiële gemeenschappen - en door een overdreven immuunrespons van de gastheer op parodontale pathogenen, wat leidt tot de afbraak van parodontaal weefsel 4,6. Onder verschillende parodontale bacteriën is de gramnegatieve anaerobe bacterie Porphyromonas gingivalis een van de belangrijkste pathogenen in PD4. P. gingivalis bevat een complex lipopolysaccharide (LPS) in de wanden, een molecuul waarvan bekend is dat het polymorfonucleaire leukocyteninfiltratie en vasculaire dilatatie induceert in ontstoken parodontale weefsels7. Dit resulteert in de productie van ontstekingsmediatoren, zoals interleukine 1 (IL-1), IL-6 en IL-8, tumornecrosefactor (TNF) of prostaglandinen, met een daaropvolgende osteoclastische activering en botresorptie, wat leidt tot weefselvernietiging en uiteindelijk tandverlies3.
Een van de verschillende voordelen van diermodellen is het vermogen om cellulaire complexiteiten na te bootsen zoals bij mensen, of om nauwkeuriger te zijn dan in vitro studies, die worden uitgevoerd op plastic oppervlakken met beperkte celtypen8. Voor het experimenteel modelleren van PD in vivo zijn verschillende diersoorten gebruikt, zoals niet-menselijke primaten, honden, varkens, fretten, konijnen, muizen en ratten9. Ratten zijn echter het meest uitgebreid bestudeerde diermodel voor de pathogenese van PD omdat ze goedkoop en gemakkelijk te hanteren zijn10. Hun tandtandvlees heeft vergelijkbare structurele kenmerken als menselijk tandvleesweefsel, met een ondiepe gingivale sulcus en junctioneel epitheel bevestigd aan het tandoppervlak. Bovendien vergemakkelijkt het junctionele epitheel, net als bij mensen, de doorgang van bacteriële, vreemde materialen en exsudaten uit ontstekingscellen 9.
Een van de meest gerapporteerde experimentele modellen van PD-inductie bij ratten is de plaatsing van ligaturen rond de tanden, wat technisch uitdagend maar betrouwbaar is10. De ligatuurplaatsing vergemakkelijkt tandplak en bacteriële accumulatie, waardoor een dysbiose in de gingivale sulci ontstaat, die parodontale weefselontsteking en -vernietiging veroorzaakt11. Verlies van parodontale aanhechting en resorptie van alveolair bot kon in 7 dagen optreden bij deze rat model8.
Een ander diermodel voor PD bestaat uit de injectie van LPS in het tandvleesweefsel. Hierdoor worden osteoclastogenese en botverlies gestimuleerd. De histopathologische kenmerken van dit model zijn vergelijkbaar met door de mens vastgestelde PD, gekenmerkt door hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines, collageenafbraak en alveolaire botresorptie 6,8.
Het doel van deze studie was dus om een eenvoudig rattenmodel van experimentele PD te beschrijven op basis van de technieken van P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) injecties, gecombineerd met ligatuurplaatsing rond de eerste maxillaire kiezen (M1). Dit is een model met vergelijkbare kenmerken als die waargenomen bij menselijke PD-ziekte, die kan worden gebruikt in de studie van ziekteprogressiemechanismen en toekomstige mogelijke behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het experimentele protocol van de studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité voor dierproeven van het Gezondheidsonderzoeksinstituut van de Balearen (CEEA-UIB; referentienummer 163/03/21).
1. Dieranesthesie en procedurevoorbereiding
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten (aluminium mondgags, dental explorer, diamantlans, chirurgische schaar, microchirurgische tang, een micronaaldhouder, een hollenbackcarver, een periostale microchirurgische lift en microchirurgische schaar) (5 min bij 135 °C) vóór de operatie.
- Bereid alle oplossingen voor die nodig zijn voor de procedure in steriele omstandigheden, zoals beschreven:
- Bereid een mix van Ketamine (60 mg / ml) en Xylazine (8 mg / ml) door 1,6 ml ketamine te mengen met 1 ml Xylazine verdund in fosfaatbufferoplossing (PBS) / zoutoplossing. Bewaar de bouillon bij 4 °C.
- Verdun atipamezole tot een eindconcentratie van 0,25 mg/ml in PBS/zoutoplossing. Bewaar de bouillon bij 4 °C.
- Verdun Buprenorfine tot een eindconcentratie van 0,03 mg/ml in PBS/zoutoplossing. Bewaar de bouillon bij 4 °C.
- Bereid 1 ml Pg-LPS (1 mg/ml) in een steriele zoutoplossing. Bewaar de bouillon bij -20 °C.
- Gebruik voor het experiment vrouwelijke en mannelijke Wistar-ratten, 12 weken oud en met een gewicht van 210-350 g op het moment van de operatie. Houd de dieren gehuisvest in groepen onder de juiste omgeving en constante omstandigheden (20-24 °C, 12 uur per dag licht-donker cycli), met voedsel en standaard water, aangeboden ad libitum.
- Om anesthesie te induceren, weegt u de rat en dient u het mengsel van ketamine / xylazine toe in een concentratie van 80/10 mg / kg intraperitoneaal (IP), met behulp van een 25 G steriele hypodermische naald en 1 ml spuit.
- Nadat de rat is verdoofd, plaatst u het dier op zijn rug op een verwarmd chirurgisch platform; Bedek tijdens de procedure het lichaam van het dier om warmteverlies te voorkomen.
OPMERKING: De anesthesiediepte wordt beoordeeld door het verlies van de pedaalreflex tijdens de procedure en door vitale functies te controleren. Gebruik indien nodig een kleine neuskegel om de anesthesie met 2% isofluraan in 100% zuurstof te behouden. Breng steriele oftalmische zalf aan op beide ogen na anesthesie-inductie om de hoornvliezen te beschermen en uitdroging te voorkomen. - Dien tijdens de procedures 100% zuurstof toe met behulp van een kleine neuskegel en controleer de polsslag en zuurstofverzadiging door pulsoximetrie.
OPMERKING: Als de zuurstofverzadiging en polsslag onder respectievelijk 95% en 190 bpm dalen, stop dan de procedure en plaats het dier in de laterale decubituspositie totdat de normale waarden zijn bereikt. - Open de rattenmond met behulp van een aluminium mondgag rond de snijtanden (boven en onder), trek de tong ermee in en stabiliseer de maxilla en onderkaak in een open, comfortabele werkpositie, waardoor toegang tot mandibulaire kiezen mogelijk is.
OPMERKING: Als het dier in laterale decubitus moet worden geplaatst, verwijder dan de mondgag voordat u van positie verandert om herstel te bevorderen. Zodra het dier is verdoofd, verzamelt u gingivale creviculaire vloeistof (GCF) vóór de operatie (monster in basale omstandigheden) (dag 0). - GCF verzamelen zoals beschreven in de volgende stappen:
- Plaats het dier op zijn rug op een chirurgisch platform en stabiliseer de maxilla en onderkaak in een open positie met aluminium mondgags.
- Verzamel GCF met in totaal vier (twee voor elk M1) absorberend papierpunt nº 30 (0,03 cm diameter x 3 cm lengte), door het in de gingivale spleet (ruimte tussen gingivaal epitheel en aangrenzend glazuur) rond het mesio-palatale van de M1 in te brengen tot een lichte weerstand. Houd het papierpunt in totaal 30 s op dezelfde positie voordat u het onmiddellijk verwijdert.
- Breng na het verzamelen het papierpunt onmiddellijk over in een plastic injectieflacon en bewaar bij -80 °C tot de testprestaties.
2. Retentieve ligatuurtechniek en intragingivale Pg -LPS-injectie
OPMERKING: Het ligatuurmodel is gemaakt (dag 0) door een steriele gevlochten zijden ligatuur (5/0) bilateraal rond de M1 in de gingivale sulcus te plaatsen met behulp van microchirurgische instrumenten en deze vast te zetten met de knopen van de chirurg op het palatale oppervlak. De gebruikte microchirurgische instrumenten waren een microchirurgische tang, een micronaaldhouder, een hollenbackcarver, een periostale microchirurgische lift en een microchirurgische schaar. Er werden ook chirurgische loepen met een LED-lichtbron gebruikt (3,6x vergroting).
- Plaats de distale staart van de hechting aan de palatale zijde van het gebit en plaats het proximale segment tussen het contact van M1 en tweede maxillaire kiezen (M2).
- Gebruik de periostale microchirurgische lift om de hechtdraad in de sulcus in te brengen. Wikkel de ligatuur heel voorzichtig rond het buccale oppervlak van de M1, omdat de weefsels op dit niveau een smalle zone van aangehechte gingiva vertonen. Wat het palatale aspect betreft, moet u ervoor zorgen dat de hechtdraad aan beide uiteinden wordt aangespannen om ervoor te zorgen dat deze in de gingivale sulcus wordt gedreven.
OPMERKING: Als weerstand wordt waargenomen bij het inbrengen van de hechtdraad tussen de M1 en de M2, kan het contact enigszins worden geopend met behulp van een tandheelkundige ontdekkingsreiziger en diamantlansvormige bur. - Bind de uiteinden van de hechting vast met de knoop van een chirurg en knip de staarten zo kort mogelijk in. Steek de knoop in de sulcus.
OPMERKING: Tips van chirurgische instrumenten kunnen oraal trauma en bloedingen veroorzaken. Bereid kleine stukjes gaas of een wattenstaafje voor om bloed uit de mondholte te verwijderen en druk uit te oefenen om een bloeding te stoppen. Zorgvuldig beheer van zacht weefsel met een microchirurgische aanpak minimaliseert chirurgische complicaties en leidt tot minder weefseltrauma. - Injecteer na ligatuurpositionering 40 μL Pg-LPS in steriele zoutoplossing met een steriele hypodermische naald van 25 G en een spuit van 1 ml in het subgingivale weefsel (tussen de wortel of hals van een tand en de tandvleesrand) aan de mesio-palatale zijde van de M1 bilateraal (dag 0).
3. Einde van de procedure
- Na ligatiepositionering en Pg-LPS-toepassing, laat de rat los uit de chirurgische toestand en plaats hem in een schone individuele kooi onder een warmtelamp.
- Injecteer de antagonist Atipamezole (0,5 mg/kg subcutaan (SC)) met een steriele injectienaald van 25 G en een spuit van 1 ml.
- Voor pijnverlichting, injecteer 0,03 mg / kg Buprenorfine, SC.
- Volg het herstel van het dier totdat de effecten van de operatie volledig zijn omgekeerd. Plaats elke rat individueel in de juiste omgeving onder constante omstandigheden (20-24 °C, 12 uur per dag licht-donkercycli). Bied voedsel en gedeïoniseerd water ad libitum aan.
- Weeg de dieren gedurende de eerste 2 dagen na de procedure en injecteer Buprenorfine SC tweemaal daags voor pijnverlichting.
OPMERKING: Buprenorfine kan worden toegediend voordat de procedure wordt gestart om het opwindeffect te elimineren. - Controleer gedurende de tijd van het experiment de dieren op gewicht en algemene gedragsbeoordeling een of twee keer per week.
4. Follow-up na de procedure
OPMERKING: De inductie van PD werd gedurende 14 dagen gehandhaafd om de accumulatie van biofilm van bacteriën en de daaruit voortvloeiende ontsteking te bevorderen. De ligaturen moeten worden onderzocht en aangepast en Pg-LPS wordt drie keer per week geïnjecteerd (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 en dag 12).
- Onderzoek en pas de ligatuur (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 en dag 12) als volgt aan:
- Verdoving met 2% isofluraan in 100% zuurstof met behulp van een anesthesie-inductiekamer.
- Nadat de rat is verdoofd, plaatst u het dier op zijn rug en gebruikt u tijdens de procedure een kleine neuskegel met 1% isofluraan in 100% zuurstof voor onderhoud van de anesthesie van het dier.
- Open de rattenmond met behulp van de aluminium mondgag rond de snijtanden (boven en onder), trek de tong ermee in en stabiliseer de maxilla en onderkaak in een open, comfortabele werkpositie, waardoor toegang tot ligaturen mogelijk is.
- Span de ligaturen tegen de gingiva aan met behulp van een periostale microchirurgische lift en zorg ervoor dat de hechting van de ligaturen wordt ingebracht, waardoor ontstekingen rond de gingiva ontstaan.
OPMERKING: Het is mogelijk dat 7-10 dagen na de operatie ligaturen verloren gaan. Als dit gebeurt, volgt u het protocol zoals uitgelegd voor de injectie van Pg-LPS (stap 2.4).
- Injecteer na de ligatuuraanpassing bilateraal 40 μl Pg-LPS met een steriele hypodermische naald van 25 G en een spuit van 1 ml in het subgingivale weefsel aan de mesio-palatale zijde van de M1 (dag 2, dag 4, dag 6, dag 8, dag 10 en dag 12).
- Verwijder de neuskegel voor anesthesie en plaats de rat in zijn kooi. Controleer het herstel van het dier totdat de effecten van de anesthesie volledig zijn omgekeerd.
5. Opoffering en analyse van dieren
OPMERKING: Er zijn verschillende opties voor het evalueren van de progressie van PD. Hier bestaat de beschreven analyse uit een evaluatie van pro-inflammatoire cytokines bij de gingivale creviculaire vloeistof (GCF) en een evaluatie van het verlies van alveolair bot.
- Offer op dag 14 van het onderzoek (dag 14) de dieren met CO2 in een kooldioxidekamer. Een verplaatsingspercentage van 30% tot 70% van het kamervolume / min wordt aanbevolen voor knaagdieren.
OPMERKING: Gebrek aan reactie van dieren op pedaalreflex en afwezigheid van vitale functies moeten worden geverifieerd om euthanasie te bevestigen. - GCF verzamelen zoals beschreven in de volgende stappen:
OPMERKING: GCF wordt verzameld vóór PD-inductie (vóór de operatie) (dag 0) en na PD-inductie (na opoffering) (dag 14).- Plaats het dier op zijn rug op een chirurgisch platform en stabiliseer de maxilla en onderkaak in een open positie met aluminium mondgags.
- Verzamel de GCF met adsorberende papierpunt nº 30 (0,03 cm diameter x 3 cm lengte) door deze in de tandvleesspleet rond het mesio-palatale van de M1 te plaatsen tot een lichte weerstand. Houd het papierpunt in totaal 30 s op dezelfde positie voordat u het onmiddellijk verwijdert.
- Breng na het verzamelen het papierpunt onmiddellijk over in een plastic injectieflacon en bewaar bij -80 °C tot de testprestaties.
- Om eiwitten binnen de GCF te evalueren, bereidt u de volgende oplossingen voor en volgt u de stappen van de elutiemethode zoals beschreven:
OPMERKING: IL-1β wordt geëvalueerd op de GCF (dag 14) met behulp van een immunoassay, volgens het protocol van de fabrikant.- Bereid de elutiebuffer vers voor en houd deze gedurende het hele extractieproces op ijs om de proteaseactiviteit te remmen.
- Bereid alle oplossingen voor die nodig zijn voor de elutiebuffer zoals beschreven:
- Bereid 1 ml aprotina (1 mg / ml) in ultrapuur water.
- Bereid 10 ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (200 mM) in methanol.
- Voeg 125 μL PMSF en 250 μL Aprotinin toe aan 24,5 ml PBS-oplossing (pH = 7,4) om de elutiebuffer te bereiden.
- Los één commerciële fosfataseremmertablet op met 10 ml vers bereide elutiebuffer gedurende 10 minuten onder roeren bij 4 °C.
OPMERKING: De duur van GCF-elutie is beperkt; Gebruik onmiddellijk voor centrifugaties na toevoeging van fosfataseremmertablet binnen de eerste 30 minuten. - Voeg na het toevoegen van de fosfataseremmer 11 μL volledige elutiebuffer rechtstreeks toe aan de buis met de papieren punten.
- Centrifugeer de buis op 452 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Breng de geëlueerde inhoud over in een nieuwe plastic injectieflacon. Herhaal dit proces nog vier keer om een totaal volume van 50 μL te verkrijgen.
- Voeg na de laatste centrifugatie een totaal volume van 60 μL rechtstreeks toe aan het papierpunt en centrifugeer nog een laatste keer bij 452 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gebruik het vereiste volume geëlueerd voor eiwitevaluatie.
- Na euthanasie en GCF-verzameling, met behulp van een chirurgische schaar, knipt u de superieure kaak van de ratten uit. Probeer het masker van de rat af te pellen en laat zo min mogelijk zacht weefsel achter.
- Plaats de kaak in het microscoopstadium voor visualisatie en maak een foto met de gewenste vergroting.
- Plaats de kaak direct in 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS. Ververs twee keer per week met nieuwe PFA gedurende 12 dagen voor een volledige fixatie.
LET OP: Stappen met PFA moeten worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de aanbevelingen van het veiligheidsinformatieblad. - Evalueer na volledige kaakfixatie het botverlies met behulp van een cone-beam computertomografie (CBCT) scanner, als volgt:
- Open de pc.
- Open het CBCT-analyseprogramma.
- Selecteer Scanprotocol > Scanmodus voor kunstgebit.
- Selecteer Field of View (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV spanning en 3 mA stroom).
- Plaats de vaste bovenste maxilla van de ratten in het portaal.
- Klik op Volgende.
- Klik op de röntgenafvurende knop (druk op de röntgenafstandsbediening om de emissie uit te voeren en houd deze gedurende de gehele duur van de scan ingedrukt).
- Verplaats indien nodig de bovenste maxilla in het midden van het frontale vlak door op de bedieningsknop te drukken en klik vervolgens op de röntgenafvurende knop (druk op de röntgenafstandsbediening om de emissie te maken en houd deze gedurende de gehele duur van de scan ingedrukt).
- Klik op Volgende.
- Klik op de röntgenafvurende knop (druk op de röntgenafstandsbediening om de emissie uit te voeren en houd deze gedurende de gehele duur van de scan ingedrukt).
- Verplaats indien nodig de prothese in het midden van het sagittale vlak door op de bedieningsknop te drukken en klik vervolgens op de röntgenafvurenknop (druk op de röntgenafstandsbediening om de emissie te maken en houd deze gedurende de gehele duur van de scan ingedrukt).
- Klik op Volgende.
- Klik op de knop Start (druk op de röntgenafstandsbediening om de uitzending uit te voeren en houd deze gedurende de gehele duur van het examen ingedrukt). Wacht totdat u een verwerkingsbericht ontvangt en volg de weergegeven instructies.
- Er verschijnt een vensterweergave. Stel het grijs in op 65% en klik op Toepassen.
- Om de scan op te slaan, klikt u op Bestand en slaat u deze op in DICOM-indeling. Klik vervolgens op Alle afbeeldingen en selecteer in het DICOM-exportselectievenster alle weergegeven parameters (initiële afbeelding, originele axiale, opnieuw geformatteerde axiale, multiplanaire) en selecteer vooraf gedefinieerd type.
- Verwerk de tweedimensionale en sagittale representatieve beelden van de maxillaire kiezen met behulp van een analyseprogramma, als volgt:
- Open de software.
- Klik op Bestand en openen en selecteer vervolgens de map met afbeeldingen in DICOM-indeling en klik op Openen.
- Wacht tot het venster "Converteren naar 8-bits" verschijnt, selecteer het bereik van 0 tot 6.000 en klik op OK.
- Klik op Raw-afbeeldingen.
- Definieer de boven- en onderkant van de selectie om het interessegebied te beperken. Zoek naar de eerste en laatste afbeelding waar alveolaire bone wordt weergegeven en selecteer deze met de bovenkant van de selectie en de onderkant van de selectieopdrachten .
OPMERKING: Representatieve tweedimensionale afbeeldingen van het alveolaire bot van de kiezen kunnen worden geëxporteerd, zoals in figuur 3A, B. - Voor sagittale representatieve afbeeldingen klikt u op De profielbalk in-/uitschakelen.
- Teken een sagittale lijn in het midden van het gehemelte en klik op Reslice-model. Bepaal parameters voor het afbakenen van het gewenste gebied (segmentafstand: 1; aantal segmenten: 100) en klik op OK. Wacht tot het relicing-model is afgelopen. Klik ten slotte op Opnieuw gesneden afbeeldingen opslaan.
OPMERKING: Representatieve sagittale beelden van het alveolaire bot van de kiezen kunnen worden geëxporteerd, zoals in figuur 3C, D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een tijdlijn van de experimentele stappen is weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een afbeelding van het mandibula na chirurgische ingreep, met ligatuurplaatsing rond de sulcus van de M1 op tijdstip 0 van het experiment. Figuur 2B laat zien hoe, na 14 dagen van de procedure, de ligatuur rond de M1 de gingivale sulcus binnendringt, waardoor ontsteking van de gingiva en infiltrerende accumulatie ontstaat.
Figuur 1: Schematische weergave van de tijdlijn van de experimentele procedure van parodontitis (PD) inductie bij ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representatieve bidimensionale beelden (figuur 3; rood vierkant) tonen alveolaire botverliesverschillen in het mandibula tussen de basale controle, met meer botvolume (figuur 3A), en na PD-vestiging, met een hoger alveolair botverlies (figuur 3B). Bovendien wijst analyse van de sagittale beelden op het grotere alveolaire botverlies in het interradiculaire botgebied van de M1 (figuur 3D; rode pijl) en M2 (figuur 3D; groene pijl) na PD-vorming, vergeleken met de basale controlegroep (figuur 3C). Bovendien werd alveolaire botresorptie gekenmerkt door een toename van de ruimte tussen de cementglazuurverbinding (CEJ) en de alveolaire botkam (ABC). De afstand tussen het CEJ en ABC in beide rattengroepen is weergegeven in figuur 3C,D met blauwe pijlen. Gevestigde PD ontwikkelde grote ruimtes tussen de CEJ en ABC (figuur 3D), vergeleken met de basale controle (figuur 3C).
Op het moment van het offer toonden beelden van het gehemelte verschillen in gingivale recessie in de M1 in de verschillende groepen (figuren 4A,B). De PD-groep (figuur 4B) toont een grotere apicale gingivale migratie als gevolg van het verlies van botondersteuning en wortelblootstelling, vergeleken met de basale controlegroep (figuur 4A). Ook vertoonde de PD-groep (figuur 4B) een grotere ontsteking van de gingiva rond de maxillaire kiezen, vergeleken met de basale controlegroep (figuur 4A). Figuur 4C toont de resultaten van de analyse van pro-inflammatoir cytokine IL-1β uit GCF, met een significant hogere afgifte van IL-1β weergegeven in de PD-groep in vergelijking met de controlegroep. Volgens de literatuur neemt IL-1β deel aan ontsteking, immuunregulatie en botresorptie bij parodontitis en is het een sterke stimulator van parodontale weefselvernietiging12.
Figuur 2: Afbeeldingen van de ligatuur die op verschillende tijdstippen in de sulcus van de M1 is ingebracht. (A) Rattengehemelte met ligatuurplaatsing rond de M1, 0 dagen na het inbrengen van de ligatuur. (B) Rattengehemelte met ligatuurplaatsing rond de M1, 14 dagen na het inbrengen van de ligatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve bidimensionale beelden van alveolair bot en maxillaire kiezen. Representatieve bidimensionale foto's verkregen door CBCT van alveolair bot van maxillaire kiezen (rood vierkant) van (A) de basale controle, en (B) vastgestelde parodontitis (PD) gedurende 14 dagen met ligatuurinbrenging en Pg-LPS-injectie. Representatieve sagittale bidimensionale weergaven van de maxillaire kiezen van (C) de basale controle en (D) de PD. De rode pijlen geven het interradiculaire alveolaire botgebied van de M1 aan, de blauwe pijlen geven de afstand tussen de CEJ en ABC aan en de groene pijlen geven het interradiculaire alveolaire botgebied van de M2 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van het gehemelte. Representatieve beelden van het gehemelte na opoffering van de (A) basale controlegroep en (B) parodontitis (PD) groep, behandeld gedurende 14 dagen met ligatuurinbrenging en Pg-LPS-injectie. (C) Bepaling van IL-1β-concentraties in de GCF van de basale controlegroep en de PD-groep (n = 9). De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. De resultaten werden statistisch vergeleken door Kruskal-Wallis: * p < 0,05 PD-groep versus basale controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode beschrijft de inductie van PD bij ratten na een gecombineerde techniek van Pg-LPS-injecties en ligatuurplaatsing rond de M1, waaruit blijkt dat significante veranderingen in de parodontale weefsels en het alveolaire bot binnen 14 dagen na deze methode kunnen worden geïnduceerd.
Tijdens deze procedure moet aandacht worden besteed aan verschillende kritieke stappen. Tijdens de anesthesie en de voorbereiding van de procedure is het beoordelen van de juiste anesthesie tijdens het chirurgische proces van cruciaal belang voor het succes ervan, net als het waarborgen van de juiste positionering van het dier, het stabiliseren van de open rattenmond met de aluminium mond rond de snijtanden en het voorkomen dat de dieren gewond raken met de gag en chirurgische instrumenten. Als de zuurstofsaturatie en polsslag dalen, moet de procedure worden gestopt en moet het dier in de laterale decubituspositie worden geplaatst totdat de normale waarden zijn bereikt. Tijdens de ligatuurpositie is het essentieel dat de hechting en knoop correct in de sulcus worden ingebracht, aangezien weke delen letsel moeten worden geminimaliseerd om pijn en ontsteking in andere gebieden te voorkomen. Rekening houdend met ethische kwesties met betrekking tot het welzijn van de dieren, is het essentieel om het herstel van het dier te volgen totdat de effecten van de anesthesie volledig zijn omgekeerd. Pijnmedicatie gedurende de eerste 2 dagen na de ingreep is onmisbaar. Het monitoren van het gewicht en het gedrag van de dieren is ook belangrijk om te beoordelen hoe goed de rat de procedure verdraagt en ervoor te zorgen dat deze geen extreme angst vertoont. Tijdens het post-procedure protocol van injectie van Pg-LPS en aanpassing van de ligatuur aan het subgingivale weefsel rond de M1, is het allereerst belangrijk om de ligatuur aan te spannen en te verplaatsen in een apicale positie om de ontsteking te creëren. Ten tweede is het belangrijk om de Pg-LPS met zorg bilateraal te injecteren, om geen oraal trauma te veroorzaken. Ook moet voorzichtigheid worden betracht tijdens het verdoven van het dier en moet het worden gecontroleerd tot herstel. Tijdens het verzamelen van GCF moet het gekalibreerde papier gedurende dezelfde totale tijd op dezelfde positie worden gehouden en het is belangrijk om het in dezelfde gingivale spleet rond de mesio-palatale M1 te plaatsen. Tijdens de GCF-elutiestappen is het belangrijk om de elutiebuffer onmiddellijk na het toevoegen van de commerciële fosfataseremmertablet te gebruiken. Een laatste kritische stap van het protocol is tijdens CBCT-scans; Een goede afstemming van de monsters en het analyseprotocol is van cruciaal belang om interpreteerbare resultaten te verkrijgen.
De variatie van de specifieke blootstelling van elk dier aan Pg-LPS-injectie en de retentieve ligatuur rond de M1 kunnen worden opgenomen als redenen voor het niet bereiken van de juiste ontsteking en de daaruit voortvloeiende botresorptie. Hoewel goede resultaten worden bereikt bij de inductie van PD door deze procedure te gebruiken, is het belangrijk om de variatie tussen dieren nauw te verminderen door het protocol nauwlettend te volgen. Een van de belangrijkste wijzigingen van de methode is de plaatsing van de retentieve ligatuur rond de M1, en niet rond de M2, het meest traditionele ligatuurmodel in de literatuur13,14,15. De operationele procedure voor de ligatuurplaatsing bij muizen of ratten levert technische problemen op en vormt een potentiële uitdaging voor veel onderzoekers vanwege de kleine omvang van de muriene mondholte en tanden11,16. Het gebruik van ratten en het plaatsen van de ligatuur rond de M1 vergemakkelijkte de manipulatie en toegang tot het gebied, wat ook de stress van het dier tijdens de procedure verminderde. Er werd geen dierenleed waargenomen tijdens het protocol, maar als een rat tekenen van nood vertoont, overweeg dan om ze uit het experiment te verwijderen om lijden te voorkomen. Ten slotte is de meest beperkende stap van de procedure om het verlies van de ligatuur te voorkomen, wat 7-10 dagen na de operatie kan gebeuren. Om de ziekte-intensiteit met de tijd te verhogen en te behouden, is het belangrijk om de ligaturen aan te passen om intiem contact met gingivaweefsels te behouden, waardoor de variabiliteit van intensiteiten op parodontitisinductie tussen dieren wordt verminderd15. Over het algemeen geldt dat als de procedure correct wordt uitgevoerd, er geen wijzigingen nodig zijn en consistente resultaten worden verkregen.
Het is belangrijk op te merken dat dit model verschillende beperkingen heeft. Allereerst werd een techniek ontwikkeld voor de studie van PD veroorzaakt door een traumatisch letsel (ligatuurpositie), waarvan wordt gedacht dat het de lokale accumulatie van bacteriën vergemakkelijkt en daardoor bacterie-gemedieerde ontsteking en botverlies verbetert13,10, met de combinatie van Pg-LPS-injectie. Maar in feite bootst de methode niet de natuurlijke etiologische factoren na die verantwoordelijk zijn voor microbiota-dysbiose bij menselijke parodontitis en bootst hij niet verschillende andere mogelijke mechanismen na waardoor parodontitis kan ontstaan. Bovendien zijn muriene tandheelkundige structuren niet identiek aan menselijke15. Verder, hoewel de gepresenteerde methode effectief is voor het bestuderen van acute PD, weerspiegelt deze mogelijk niet de langetermijnbotverlies en inflammatoire infiltratiekenmerken bij chronische PD16. In detail met de voorgestelde methodologie voor de evaluatie van alveolair botverlies, is de meest gebruikte methode voor multidimensionale evaluatie van bot micro-CT, die de evaluatie van externe factoren mogelijk maakt en driedimensionale beelden van het bot biedt. Bovendien kunnen trabeculaire botparameters, botvolume en botmineraaldichtheid worden geanalyseerd zonder de botten te breken14,17. Het gebruik van CBCT voor de beoordeling van alveolair botverlies werd hier echter voorgesteld (figuur 3) als alternatief voor micro-CT; Hoewel afbeeldingen met een lagere resolutie worden verkregen, biedt het ook een nuttige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van parodontitisprogressie18,19,20. CBCT-examens bieden dus een nauwkeurige methode voor beeldvorming, meer beschikbaar en toegankelijk dan micro-CT, wat studies naar parodontitisinductie bij ratten zou vergemakkelijken.
Onder de verschillende diermodellen die zijn gebruikt om PD in vivo16 na te bootsen om tandondersteunende weefsels (gingiva en bot) onder goed gecontroleerde omstandigheden te beoordelen, is het ligatuur-geïnduceerde PD-model uitgebreid gebruikt bij ratten, honden en niet-menselijke primaten13. De literatuur geeft ook aan dat, ondanks dat het in sommige protocollen wordt gebruikt, het gebruik van muizen - dat een handig, goedkoop en veelzijdig model vertegenwoordigt - resulteert in een meer technische uitdaging vanwege de relatief kleine omvang van de mondholte van de muis in vergelijking met ratten13. In vergelijking met andere modellen biedt het ligatuur-geïnduceerde PD-ratmodel verschillende voordelen, waaronder snelle ziekte-inductie, die op een voorspelbaar tijdstip kan beginnen en binnen enkele dagen kan uitmonden in alveolair botverlies (muizen en ratten)13. Er zijn andere voordelen aan deze methode, zoals het potentieel om parodontaal weefsel en alveolaire botregeneratie te bestuderen, evenals het vermogen om ontstoken gingivaal weefsel te lokaliseren en te ontleden om het niveau van ontsteking te beoordelen15. De methode om het ligatuur-geïnduceerde PD-model te combineren met de LPS-injectie voegt een lokale destructieve ontstekingsreactie toe in het parodontium die het verlies van bindweefselaanhechting en alveolaire botresorptie veroorzaakt door de ligatuur verbetert. Dit additieve effect is raadzaam om toe te nemen met de concentratie en frequentie van LPS-injecties10. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerd protocol van een combinatie van ligatuur met Pg-LPS-injectie, met de voordelen en betekenis van beide methoden.
De optimalisatie en ontwikkeling van veilige en economische in vivo modellen van PD zijn van cruciaal belang om het begrip van de pathogenese van parodontitis en het testen van nieuwe therapeutische benaderingen te vergemakkelijken. Het PD-model van de gecombineerde techniek van Pg-LPS-injecties en ligatuurplaatsing rond de hier gepresenteerde M1 wordt beoordeeld als een aantrekkelijk studiemodel om gastheer-microbe-interacties, ontsteking bij parodontitis en alveolaire botresorptie te onderzoeken. Dit model identificeert de meest kritische sets van het protocol, beschrijft ze in beeldgebaseerde technische details en standaardiseert en optimaliseert het gebruik van deze gecombineerde technieken. Het gebruik van aanvullende technieken voor de evaluatie van parodontitisprogressie zou mogelijk kunnen zijn, waaronder histologische analyses van zowel het alveolaire bot als de omliggende aangehechte gingiva, bepaling van andere cytokines die betrokken zijn bij ontsteking en de karakterisering van orale microbiota. Hoewel het model niet alle aspecten van de mechanismen of oorzaken van PD bij mensen kan weerspiegelen, onthult deze studie dat significante degeneratieve en inflammatoire veranderingen in de parodontale weefsels en het alveolaire bot 14 dagen na de interventie kunnen worden geïnduceerd, wat de basis vormt voor toekomstige preklinische preventieve of behandelingsstudies voor parodontitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), door het Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (contract met M.M.B; FI18/00104) en door de Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (contract met M.M.F.C; FPI/040/2020). De auteurs bedanken Dr. Anna Tomás en Maria Tortosa voor hun hulp bij de experimentele chirurgie en het platform van IdISBa. Tot slot, dank aan ADEMA School of Dentistry voor de toegang tot de CBCT-scanner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
