Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Простой протокол для картирования черт архитектуры корневой системы растений

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64876
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,4
1Department of Biology, Western Kentucky University, 2Plant Biotechnology Division, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, 3Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 4Department of Biology, St. Joseph's University

Summary

Мы используем простые лабораторные инструменты для изучения архитектуры корневой системы (RSA) Arabidopsis и Medicago. Ростки выращивают на гидропонике над сеткой и распределяют с помощью художественной кисти, чтобы выявить RSA. Изображения делаются с помощью сканирования или камеры с высоким разрешением, а затем анализируются с помощью ImageJ для отображения черт.

Abstract

Всесторонние знания о развитии архитектуры корневой системы растений (RSA) имеют решающее значение для повышения эффективности использования питательных веществ и повышения устойчивости сортов сельскохозяйственных культур к экологическим проблемам. Представлен экспериментальный протокол для настройки гидропонной системы, роста ростков, распространения RSA и визуализации. В подходе использовалась пурпурная коробчатая гидропонная система, содержащая полипропиленовую сетку, поддерживаемую поликарбонатными клиньями. Экспериментальные условия иллюстрируются оценкой RSA проростков при различном поступлении питательных веществ (фосфатов [Pi]). Система была создана для изучения RSA Arabidopsis, но ее легко адаптировать для изучения других растений, таких как Medicago sativa (люцерна ). Проростки Arabidopsis thaliana (Col-0) используются в этом исследовании в качестве примера для понимания растения RSA. Семена стерилизуют путем обработки этанолом и разбавленным коммерческим отбеливателем и выдерживают при температуре 4 ° C для стратификации. Семена проращивают и выращивают на жидкой полуМС среде на полипропиленовой сетке, поддерживаемой поликарбонатными клиньями. Ростки выращивают в стандартных условиях роста в течение желаемого количества дней, аккуратно вынимают из сетки и погружают в водосодержащие агаровые пластины. Каждая корневая система ростков аккуратно выкладывается на заполненную водой тарелку с помощью круглой художественной кисти. Эти пластины Петри фотографируются или сканируются с высоким разрешением, чтобы задокументировать признаки RSA. Корневые признаки, такие как первичный корень, боковые корни и зона ветвления, измеряются с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. В этом исследовании представлены методы измерения характеристик корней растений в контролируемых условиях окружающей среды. Мы обсудим, как (1) выращивать ростки, собирать и распространять образцы корней, (2) получать изображения распространенных образцов RSA, (3) захватывать изображения и (4) использовать программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки корневых атрибутов. Преимущество настоящего метода заключается в универсальном, простом и эффективном измерении признаков RSA.

Introduction

Архитектура корневой системы (RSA), находящаяся под землей, является жизненно важным органом для роста и продуктивности растений 1,2,3. После эмбриональной стадии растения претерпевают наиболее значительные морфологические изменения. То, как корни растут в почве, сильно влияет на рост частей растений над землей. Рост корней является первым шагом в прорастании. Это информативная черта, поскольку она однозначно реагирует на различные доступные питательные вещества 1,2,3,4. RSA демонстрирует высокую степень пластичности развития, что означает, что окружающая среда всегда используется для принятия решений о развитии 2,5. Изменения в окружающей среде затруднили производство сельскохозяйственных культур в нынешнем сценарии. На постоянной основе ЮАР учитывает сигналы окружающей среды при выборе вариантов развития5. В результате глубокое понимание принципов, лежащих в основе развития корней, имеет важное значение для изучения того, как растения реагируют на изменение окружающей среды 2,5.

RSA определяет различные концентрации питательных веществ и вносит фенотипические изменения 4,6,7,8,9,10,11,12. Исследования показывают, что морфология корня / RSA очень пластична по сравнению с морфологией побегов 1,3. Картирование признаков RSA очень эффективно при регистрации эффекта изменения окружающей почвенной среды 1,11,12.

В целом, расхождения во влиянии различных дефицитов питательных веществ на фенотип корня были зарегистрированы во многих более ранних исследованиях 3,11,13,14,15. Например, есть несколько противоположных сообщений об изменениях количества, длины и плотности боковых корней (LR), вызванных фосфатным голоданием (Pi). Сообщалось об увеличении плотности LR при условии дефицита Pi 6,8. Напротив, снижение плотности LR в условиях дефицита Pi также было сообщено другими авторами 3,13,16. Одной из основных причин этих несоответствий является использование подверженной элементарному загрязнению желирующей среды, которую агар часто содержит10. Исследователи обычно выращивают свои экспериментальные растения на пластинчатой системе на основе агара и записывают корневые признаки. Многочисленные признаки RSA часто скрыты или укоренены в агаровом материале и не могут быть задокументированы. Эксперименты, связанные с индуцированием дефицита питательных веществ, в которых пользователи часто полностью исключают один компонент из среды, не могут быть выполнены в подверженной элементарному загрязнению желирующей среде11,14,15. Многочисленные питательные вещества часто присутствуют в значительных количествах в агаровой среде, включая P, Zn, Fe и многие другие11,14,15. Кроме того, рост RSA медленнее в средах на основе агара, чем в жидкой среде без агара. В результате возникает необходимость в разработке альтернативного неагарового подхода для количественной оценки и качественной регистрации фенотипа RSA. Следовательно, был разработан текущий метод, в котором ростки выращиваются в пурпурной коробчатой гидропонной системе поверх полипропиленовой сетки, поддерживаемой поликарбонатными клиньями 1,10,11.

В этом исследовании представлена подробная импровизированная версия более раннего метода, описанного Jain et al.10. Эта стратегия была адаптирована к текущим требованиям биологии корней растений и может также использоваться для таких растений, как люцерна, кроме модельных растений. Протокол является основным способом измерения изменений в RSA, и для него требуется только простое оборудование. Настоящий протокол иллюстрирует, как фенотипировать несколько корневых признаков, таких как первичные и боковые корни в нормальной и модифицированной среде (дефицит Pi). Пошаговые инструкции и другие полезные советы, почерпнутые из опыта автора, предоставляются, чтобы помочь исследователям следовать методологиям, предлагаемым в этом методе. Настоящее исследование направлено на то, чтобы предоставить простой и эффективный метод выявления всей корневой системы растений, включая LR высшего порядка. Этот метод включает в себя ручное разведение корневой системы круглой акварельной художественной кистью, позволяющей точно контролировать обнажение корней 1,10,11,12. Он не требует дорогостоящего оборудования или сложного программного обеспечения. Этот метод улучшил усвоение питательных веществ и скорость роста; Растения имеют богатый питательными веществами раствор, легко поглощаемый их корнями. Настоящий метод подходит для исследователей, которые хотят детально отобразить черты корневой системы растения, особенно на ранних стадиях развития (через 10-15 дней после прорастания). Он подходит для небольших корневых систем, модельных растений, таких как арабидопсис и табак, и нетрадиционных растений, таких как люцерна, пока их корневая система не поместится в пурпурные коробочки.

Этапы фенотипического анализа развития RSA у Arabidopsis изложены в этом протоколе следующим образом: (1) метод стерилизации поверхности семян для растений (Arabidopsis), (2) этапы создания гидропонной системы с последующим посевом семян на среду, (3) процедура извлечения полных семян и разбрасывания на пластине Петри для анализа RSA, (4) как записывать изображения для RSA, и (5) вычислять важные параметры RSA с помощью программного обеспечения ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Весь протокол схематично изложен на рисунке 1, показывая все основные этапы, связанные с выявлением архитектуры корневой системы (RSA) проростков. Шаги протокола подробно описаны ниже:

1. Стерилизация поверхности семян арабидопсиса

  1. Переложите крошечную мерную ложку (примерно 100 семян = примерно 2,5 мг) семян в микропробирку и замочите на 30 минут в дистиллированной воде комнатной температуры (RT). Вся эта процедура проводится в асептическом состоянии.
  2. Кратковременно центрифугируйте микрофугу с семенами при 500 x g в течение 5 с, используя любую настольную центрифугу при RT, чтобы дать семенам осесть.
  3. Сцедите воду, добавьте 700 мкл 70% (об./об.) этанола, встряхните в течение нескольких секунд и вращайте. При необходимости повторите вихревое и вращание, но убедитесь, что время обработки 70% этанола остается на уровне 3 минут.
  4. Через 3 минуты немедленно смойте один раз стерильной водой. Проводите этап промывки этанола как можно более своевременно, так как длительное воздействие этанола снижает всхожесть.
  5. Обработайте семена разбавленным коммерческим отбеливателем (4% об./об.) каплей Tween-20 в течение 7 мин. Смешайте семена с раствором хлорной извести, быстро перевернув пробирки 8-12 раз, после чего проведите короткую центрифугу (500 x g в течение 5 с при RT). Видно, как в трубке появляется пена.
  6. Сцедите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл и промойте семена не менее чем пятью промывками стерильной водой, следуя той же процедуре вихряния.
  7. Поверхность стерилизованных семян оставить в воде и выдержать 2-3 дня при температуре 4 °С для стратификации10.

2. Настройка гидропонной системы для проращивания семян

  1. Наполовину заполните стандартную пурпурную коробку дистиллированной водой и автоклавируйте ее. Автоклавируйте лист поликарбоната (прозрачный цвет и гладкая текстура) и вырежьте прямоугольники размером 4 см x 8 см с насечкой в середине прямоугольника, так что два прямоугольника могут соединяться вместе, образуя X-образнуюформу 10. Используйте эту установку для удержания полипропиленовой сетки (квадраты размером 6 см x 6 см с размером пор 250 мкм или в зависимости от требований), вырезанной из листов размером 12 x 24 дюйма10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полипропилен обладает высокой устойчивостью к кислотам, щелочам и другим химическим веществам; Поэтому он был выбран. Автоклавирование имеет тенденцию деформировать полипропиленовую сетку; Следовательно, его рекомендуется носить отдельно, завернутым в алюминиевую фольгу. Рекомендуются типичные условия автоклавирования 16 мин, 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм или 775 мм рт.ст.
  2. Добавьте стерильную базальную среду с витаминами + 1,5% (мас./об.) сахарозы, как описано Shukla et al.1, в каждую коробку, чтобы достичь нижнего края полипропиленовой сетки в ламинарном потоке. Все процедуры проводятся в асептических условиях.
  3. Посейте стерилизованные на поверхности семена на сетку (размер пор 250 мкм) на гидропонике и дайте им прорасти в течение 3 дней.
  4. Через 3 дня переложите сеянцы на сетку (размер пор 500 мкм) и дайте им расти в течение 2 дней.
  5. Через 2 дня (всего 5 дней) перенесите проростки на контрольную среду (т.е. модифицированную питательную среду MS 1, содержащую 2,0 мМ NH 4 NO 3, 1,9 мМ KNO3, 0,15 мМ MgSO 4·7H2O,0,1 мМ MnSO 4· H 2 O, 3,0 мкМ ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 мкМ CuSO 4·5H 2 O, 0,3 мМ CaCl 2·2H 2 O, 5,0 мкМ KI, 0,1 мкМ CoCl 2·6H 2 O, 0,1 мМ FeSO 4·7H 2 O, 0,1 мМ Na 2 ЭДТА·2H 2 O, 1,25 мМ KH 2PO 4, 100 мкМ H 3 BO3, 1 мкМ Na 2 MoO4·2H2O, 1,5% сахарозы, 1,25 мМ MES, рН 5,7 с поправкой на 0,1 М MES [рН 6,1]) и к экспериментальным средам (например, обработка P- [0 мМ]; KH 2 PO4 заменяется 0,62 мМ K2SO4 из состава контрольной среды, как указано выше1. При избыточных обработках Pi концентрацию KH 2 PO4 увеличивают в модифицированной среде MS [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 мМ]1) и дают семенам расти в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Больший размер пор ячеек (500 мкм) облегчает плавный сбор целых саженцев без каких-либо повреждений или необходимости разрезания гипокотиля. Проростки растут в стандартных условиях роста (т. е. 16 ч света / 8 ч темного фотопериода, интенсивность света 150 мкмоль · м-2 · с-1 интенсивность света, влажность 60% -70%) при 23 ° C.

3. Экспертиза ЮАР

  1. Подготовьте агаровые (1,1%) пластины для раскидки корней (размер чашки Петри: 150 мм х 15 мм).
  2. Добавьте 10-20 мл автоклавной фильтрованной водопроводной воды в чашку Петри, как упоминалось выше. Аккуратно вытащите сеянцы из сетки (500 мкм) и погрузите их в воду на тарелках.
  3. Аккуратно разложите корень каждого саженца в заполненной водой тарелке с помощью круглой акварельной художественной кисти (размеры: No 14, 16, 18 и 20).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводя распространение корневой системы, сначала возьмитесь за первичный корень и расправьте его по прямой линии, так как он служит осью. Затем распределите LR симметрично по обе стороны от первичного корня, где это возможно. После этого распространите LR второго порядка, связанный с LR первого порядка. Этот процесс распространения является своего рода искусством; делайте это мягко, медленно, как художник, рисующий изображение ЮАР.
  4. Слегка наклоните тарелку, чтобы удалить воду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе процедуру можно приостановить, поставив эти пластины при температуре 4 °C. Позже, когда потребуется обработка изображения, выньте пластины и поместите их на некоторое время в RT. Протрите конденсатом, и тогда изображение можно будет удобно обрабатывать.

4. Запись изображений для RSA

  1. Отсканируйте или сфотографируйте эти пластины Петри соответствующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высококачественных фотографий для сканирования рекомендуется разрешение 600 dpi, а для фотосъемки рекомендуется использовать камеру не менее 12 мегапикселей.
  2. Измерьте характеристики архитектуры корневой системы с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Чтобы быстро выполнить шаги по измерению длины корня с помощью программного обеспечения ImageJ, обратитесь к примеру «Измерение длины контура ДНК»17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги выполняются для измерения длин корней на изображениях, снятых с помощью сканера или камеры высокого разрешения.
    1. Используйте заданное расстояние длины, чтобы установить масштаб. Известное расстояние до масштабной линейки на рисунке 3 составляет 2 см. Выберите инструмент «Прямая линия » на панели инструментов ImageJ (пятый инструмент слева). Инструмент « Прямая линия » используется для создания выделенной линии, обводящей масштабную линейку. Завершите структурирование, щелкнув правой кнопкой мыши, дважды щелкнув или щелкнув поле в начале.
    2. Измерьте длину известной масштабной линейки в пикселях с помощью панели инструментов «Анализ > измерение ». Запишите длину в пикселях.
    3. Откройте диалоговое окно « Задание масштаба », щелкнув вкладку « Задать масштаб » на вкладке «Анализ». В поле «Расстояние в пикселях» введите длину в пикселях (как указано выше). Далее в поле «Известное расстояние » введите значение, как показано на шкале (здесь это 20 мм). Установите единицу измерения длины в мм. Соотношение сторон пикселей составляет 1,0. Теперь масштаб определяется количеством пикселей x на миллиметр. Чтобы заблокировать масштаб для этого конкретного изображения, нажмите «ОК».
    4. Создайте выделенную линию, которая обводит длину корня, с помощью инструмента «Сегментированная линия ». Завершите структурирование, щелкнув правой кнопкой мыши, дважды щелкнув или щелкнув поле в начале. Щелкните и перетащите маленькие черно-белые «маркеры» вдоль контура, чтобы при необходимости настроить выделение линии.
    5. Используйте команду « Измерить » на вкладке «Анализ » ImageJ для количественной оценки длины корня. Чтобы перенести измеренные данные в электронную таблицу, щелкните правой кнопкой мыши окно «Результаты », выберите « Копировать все » во всплывающем меню, переключитесь на электронную таблицу и вставьте данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано выше, установите масштаб, используя известное расстояние до масштабной линейки в параметре ImageJ set scale. Это дает количество пикселей на единицу длины. Требуется заново устанавливать масштаб каждый раз, когда анализируется новое изображение.
  3. Измерение и расчет признаков RSA
    1. Измерьте длину первичного корня от гипокотильного соединения до конца кончика корня.
    2. Измерьте длину LR первого и второго порядка.
    3. Измерьте зону ветвления (BZ) первичного корня. Зона ветвления первичного корня (BZPR) охватывает первую точку возникновения LR до последней точки возникновения LR.
    4. Запишите количество LR, которое представляет собой количество LR, происходящих в пределах границBZ PR.
    5. Измерьте среднюю длину LR первого и более высокого порядка. Выведите среднюю длину LR первого порядка (1° LR) (сантиметр на корень), разделив общую длину LR 1° на общее количество LR 1°.
    6. Измерьте среднюю длину LR второго порядка. Рассчитайте среднюю длину LR второго порядка (2° LR), разделив общую длину LR 2° на общее количество LR 2°.
    7. Измерьте плотность 1° LR. Рассчитайте плотность 1° LR (количество 1° LR на единицу длины BZ PR), разделив количество 1° LR на длину BZPR.
    8. Измерьте плотность 2° LR. Рассчитайте плотность 2° LR, разделив число 2° LR на длину BZ 1° LR (количество 2° LR на единицу длины BZ боковых корней 1°).
    9. Измерьте общую длину корня (TRL). Это совокупность длин первичного корня, 1° LR и 2° LR (и более, если есть).

5. Измерение корневых волос

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя гидропонная система не очень хороша для стимулирования роста и развития корневых волос, несмотря на то, что она так же надежна, как и в твердых питательных средах, все же важно изучить ее в нынешнем контексте. Выполните следующие действия, чтобы проанализировать развитие корневых волосков на участке 5 мм от кончика первичного корня саженцев.

  1. Отрежьте от кончика корня 2 см срез первичного корня.
  2. Установите корневую часть на предметное стекло, используя 10% глицерина в качестве монтажной среды.
  3. Поместите предметное стекло под стереомикроскоп.
  4. Используйте осевой носитель для визуализации и захвата изображений корневых волосков.
  5. Проанализируйте изображения, чтобы изучить структуру и характеристики корневых волосков с помощью программного обеспечения ImageJ, как описано ранее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Различные морфометрические признаки архитектуры корневой системы (RSA) измеряются с помощью простых лабораторных инструментов, а этапы схематично изображены на рисунке 1. Детали гидропонной установки демонстрируют потенциал протокола в измерении RSA (рис. 1 и рис. 2).

Учитывая наблюдаемые различия в желирующих агентах, мы использовали систему гидропонного выращивания для проведения всех исследований 3,10. В качестве доказательства концепции эта гидропонная система работает хорошо, отражая очевидный контрастный фенотип при дефицитных и достаточных условиях Pi (рис. 3). Семена арабидопсиса культивировали на гидропонике в течение 5 дней в среде с половиной МС на полипропиленовой сетке, как показано на рисунке 2. Ростки пересаживали через 5 дней в недостаточные и достаточные условия для Pi и давали расти в течение 7 дней (рис. 3).

Демонстрация признаков RSA при разнообразном поступлении питательных веществ (Pi)
Мы следовали установленной схеме анализа и записи характеристик RSA3. Различные признаки RSA были проанализированы при контрастных режимах Pi в условиях гидропоники (рис. 3). Лечение с дефицитом Pi (0 мМ Pi) вызывало типичный фенотип корня, демонстрирующий более короткий, мелкий и менее разветвленный RSA по сравнению с достаточным состоянием Pi (рис. 3A). Длина первичного корня была значительно ослаблена при дефиците Pi (рис. 3A, B). Длина первичного корня, быстро набираемая в присутствии Pi (1,25 мМ), показывает эффективность гидропонной системы, адекватно отражающей физико-морфологические изменения (рис. 3A, B). TRL был значительно снижен при условии дефицита Pi (рис. 3B). Зона ветвления (BZPR), как показано на рисунке 3A, была значительно ослаблена при условии дефицита Pi (рис. 3B).

Из этих признаков больше всего пострадал TRL из-за большой разницы в числе LR между двумя условиями Pi. Бурный рост RSA при достаточном Pi условии (1,25 мМ) был обусловлен значительным увеличением числа и длины 1° LR. Таким образом, произошло быстрое изменение RSA, в основном из-за изменения в развитии LR. Мы измерили количество LR, происходящих в пределах границы зоны ветвления первичного корня, так как они считаются более значимыми 1,3,18. Средняя длина 1° LR (сантиметр на корень) была значительно уменьшена в условиях дефицита Pi (рис. 3C). Средняя длина LR на 2° была аналогичным образом уменьшена из-за условия P0; однако он был меньше по количеству, чем средняя длина LR 1° (рис. 3C). Количество LR 1° и LR 2° сильно уменьшилось при условии P0 по сравнению с условием P1,25 (рис. 3D). Плотность 1° LR (число 1° LR на сантиметр длиныBZ PR) не изменялась при условии P0 относительно условия P1,25 (рис. 3E). Плотность 2° LR (количество 2° LR на сантиметр от BZ 1° LR) также не показала существенных изменений (рис. 3E). В результате определение плотности LR имеет важное значение для получения полезного представления о пластичности RSA.

Анализ развития корневых волосков при различных фосфатных (Pi) режимах
Изучено влияние питания Pi на развитие корневых волосков в первичном корне сеянцев. Было обнаружено, что длина корневых волос увеличивалась с увеличением концентрации Pi до 2,5 мМ, но уменьшалась при 5 мМ и 10 мМ. Однако при 20 мМ длина корневых волос вернулась к почти пиковым уровням (дополнительный рисунок 1). Количество корневых волосков было значительно выше при 0 мМ по сравнению со всеми другими источниками Pi, при этом наибольшее количество наблюдалось при 20 мМ (дополнительный рисунок 1).

Применение настоящего способа на растениях, отличных от Arabidopsis
Мы изучили осуществимость настоящего метода на растениях, отличных от Arabidopsis, взяв Medicago sativa (люцерну) в качестве тестового растения. Протокол был изменен в соответствии с требованиями двух аспектов: (1) метода стерилизации поверхности семян и (2) размера пор полипропиленовой сетки (теперь больше, 1000 мкм). Протокол поверхностной стерилизации и стратификации семян всегда должен быть оптимизирован в зависимости от выбранных растений для изучения. Для люцерны были предприняты шаги, описанные Уиксом и др.19. После поверхностной стерилизации семена инкубировали при 4 °C в течение 7 дней для стратификации. После этого мы выполнили ту же процедуру, описанную в этом протоколе, с модификацией размера пор сетки. Как показано на рисунке 4A, B, ростки были хорошо выращены, с измененным RSA при различных поставках Pi. На рисунке 4C показана пластичность корневой системы при 1,25, 0 и 20 мМ питательного раствора Pi. Избыток Pi (20 мМ) и недостаточное поступление Pi приводили к уменьшению развития корневой системы по сравнению с достаточным (1,25 мМ) состоянием (контролем) Pi (рис. 4C). RSA может быть сопоставлен для различных признаков с помощью программного обеспечения ImageJ, описанного в протоколе. Следовательно, протокол прост, эффективен и может быть легко изменен в соответствии с выбранными видами растений. Это дает возможность изучать RSA различных видов растений при различных питательных условиях.

Figure 1
Рисунок 1: Схема процедуры. На принципиальной схеме показаны основные этапы, связанные с протоколом метода для отображения RSA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Отображение гидропонной установки в пурпурных ящиках для выращивания проростков . (Как описано Jain et al.10, с изменениями). (A) Две прямоугольные детали (4 см x 8 см) с насечками из поликарбонатных клиньев для сборки установки. (B) Сборка поликарбонатных клиньев друг в друга через выемку, превращающуюся в Х-образную форму для поддержки поверхности сетки. (C) Полипропиленовый сетчатый лист размером 250 мкм (6 см х 6 см). (D) Вид сверху на сборку поликарбонатных клиньев в пурпурной коробке. (E) Сборка полипропиленовой сетки на поликарбонатных клиньях в пурпурной коробке, заполненной средой. (F) Демонстрация проростков арабидопсиса, проросших на сетке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Демонстрация типичной модуляции RSA при различных условиях питания (дефицит Pi [0 мМ] и достаточный [1,25 мМ]) с использованием этого метода фенотипирования. Саженцы арабидопсиса (Col-0) выращивают на гидропонике в 0,5-кратной среде MS в течение 5 дней, а затем подвергают дефициту Pi и достаточным запасам (0 и 1,25 мМ соответственно) и выращивают в течение 7 дней, как показано на рисунке 2. (A) Отдельные ростки вытаскивают из полипропиленовой сетки (500 мкм) и распределяют по агаровым пластинам Петри с помощью круглой художественной кисти и воды. Данные о признаках RSA представлены для (B) длины первичного корня (PR), общей длины корня (TRL), зоны ветвления (BZ), (C) средней (Av.) боковой длины корня первого порядка (длина 1° LR), средней (Av.) длины бокового корня второго порядка (длина 2° LR), (D) числа 1° LR и 2° LR и (E) плотности 1° LR и 2° LR. Ценности являются средствами ± SE; n = 21. Эта цифра была изменена по сравнению с Shukla et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Демонстрация корневой системы люцерны Medicago sativa (люцерны) в качестве примера, чтобы показать применимость этого метода к другим растениям, кроме арабидопсиса. (A) Вид сбоку на пурпурную коробку, показывающую рост ростков люцерны. (B) Вид сверху пурпурной коробки показывает появление побега на полипропиленовой сетке (размер пор 1000 мкм). (C) Типичная архитектура корневой системы (RSA) модуляции люцерны при различных условиях питательных веществ (дефицит Pi [0 мМ], избыток Pi [20 мМ] и достаточный или контроль [1,25 мМ]) с использованием этого метода фенотипирования RSA. Проростки люцерны выращивают на гидропонике в среде 0,5x MS в течение 5 дней, подвергают дефициту, достаточному и избыточному количеству Pi (0, 1,25 и 20 мМ соответственно) и выращивают в течение 7 дней. Отдельные ростки вытаскивают из полипропиленовой сетки (1,000 мкм) и распределяют по агаровым пластинам Петри, как показано на C, с помощью художественной кисти и воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Различные избыточные концентрации Pi модулируют развитие корневых волос. Саженцы WT выращивали на гидропонике, как описано в протоколе. (A) Срез 1-2 см от кончика первичного корня был нарезан и установлен на предметное стекло с 10% глицерина, а область 5 мм от кончика была задокументирована для количества и длины корневых волосков. Данные представлены для (B) длины корневых волосков и (C) количества корневых волосков в области 5 мм первичного кончика корня. Ценности являются средствами ± SE; n = 10 (B и C). Бары с разными буквами буквы существенно различаются (p ≤ 0,05) по парному t-критерию Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта работа продемонстрировала картографирование RSA с использованием простого лабораторного оборудования. С помощью этого метода регистрируются фенотипические изменения на уточненном уровне. Преимущество этой стратегии заключается в том, что часть побегов никогда не соприкасается со средой, поэтому фенотип проростков является оригинальным. Этот метод включает в себя создание гидропонной системы для выращивания саженцев, как описано в протоколе. Затем каждый росток вынимают неповрежденным и помещают на заполненную агаром пластину Петри. Затем корневая система распространяется вручную с помощью художественной кисти, и фотографии делаются для анализа с помощью программного обеспечения ImageJ 1,10,11,12.

Прорастание семян требует стерилизации поверхности семян для удаления бактерий, грибков и вирусов. Спирт - 70% этанол - используется для стерилизации поверхности семян. Чтобы обеззаразить семена, не уничтожив их, нужно тщательно соблюдать время обработки спиртовой стерилизацией. Всхожесть семян снижается при переусердствованиях со стерилизацией спиртом. Время лечения варьируется в зависимости от вида растений (например, для Arabidopsis ограничение по времени составляет только 3 минуты 1,10,11,12,20, а для Medicago sativa - 5 минут 19. Для того чтобы облегчить беспрепятственный сбор РСА для анализа, важно ограничить количество семян в сетчатой или пурпурной коробочке, не допустить запутывания корневой системы между собой 1,10,11,12. Этого можно добиться, используя меньшее количество семян в сетке. Например, использование четырех семян на сетку может помочь снизить риск запутывания, обеспечивая при этом устойчивый рост и развитие корневой системы. Важно отметить, что оптимальное количество семян на ячейку зависит от конкретного вида растений и целей анализа RSA. Например, если для эксперимента требуется ткань для дальнейшей последующей обработки, такой как выделение РНК, в этом случае рекомендуется массовый посев (100 семян на сетку в случае Arabidopsis)1,10,11,12. Выковырывание саженцев из сетки – деликатный процесс, требующий предельной внимательности и внимания 1,10,11. Важно подходить к этой задаче медленно, осторожно и осторожно, чтобы не повредить нежные ростки. Чтобы вырвать ростки из сетки, рекомендуется использовать тонкий пинцет или щипцы, чтобы захватить ростки мягко, но крепко. Ростки следует осторожно вынимать из сетки, чтобы не нарушить корневую систему и не повредить проростки. Важно набраться терпения и найти время, чтобы осторожно удалить каждый росток из сетки, чтобы убедиться, что они не повреждены во время процесса. Это постепенный процесс, который следует проводить медленно, осторожно и осторожно, чтобы обеспечить успех эксперимента. Чтобы точно измерить RSA проростков, крайне важно отметить шкалу на пластине Петри, чтобы обеспечить точное измерение 1,10,11. Это можно сделать, используя перманентный маркер, чтобы провести линию на пластине Петри на известном расстоянии, например, 1 см или 2 см. Шкала должна быть размещена вдоль края пластины Петри на видном месте. Используя кисть, также важно соблюдать максимальную осторожность при распределении RSA. Первичный корень должен быть аккуратно расположен в центре пластины Петри, а боковые корни должны быть расставлены по обе стороны от первичного корня. Корневая система должна быть частично погружена в воду, чтобы облегчить распространение. Чтобы измерить каждую новую пластину Петри, необходимо каждый раз устанавливать масштаб в программном обеспечении ImageJ.

Для повышения эффективности, неинвазивности и результативности анализа RSA1 можно использовать несколько модификаций. Одним из таких улучшений является изменение размера пор полипропиленовой сетки, используемой для удержания ростков. Размер пор сетки может быть отрегулирован в соответствии с конкретными потребностями изучаемых видов растений и для оптимизации роста и развития корневых систем 1,10,11,12. Например, больший размер пор ячеек (500 мкм) облегчает плавный сбор целых саженцев без разрезания гипокотиля, что ранее практиковалось10,11,12. Кроме того, больший размер пор может быть более подходящим для более крупных видов растений RSA, в то время как меньший размер пор может быть более подходящим для более мелких видов растений. Еще одна модификация, которую можно сделать, заключается в том, чтобы обернуть полипропиленовую сетку алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить ее изгиб. Это может помочь сохранить форму и целостность сетки, что делает ее пригодной для использования в качестве матрицы плоского пола. В дополнение к этим изменениям можно использовать другие методы устранения неполадок для решения любых проблем, которые могут возникнуть во время анализа RSA. Например, если саженцы не растут или развиваются не так, как ожидалось, может потребоваться отрегулировать условия окружающей среды, такие как температура, влажность и уровень освещенности. Если корневые системы запутались, может потребоваться уменьшение количества семян в сетке, как уже говорилось выше.

Одним из основных преимуществ анализа RSA является то, что он позволяет изучать корневые системы растений без необходимости использования агара. Агар обычно используется в качестве отвердителя в культуре тканей растений и экспериментах по проращиванию семян. Однако использование агара может привести к элементарному загрязнению, которое потенциально может генерировать артефакты и влиять на точность результатов10. Исключая требование к агару, анализ RSA устраняет риск элементарного загрязнения, полученного из агара, и возможность образования артефактов. Это делает анализ RSA более надежным и точным методом изучения корневых систем растений 1,3,10,11,12. Например, влияние депривации Pi на плотность боковых корней было предметом ряда противоречивых отчетов. Сообщалось, что плотность LR увеличивается, когда Pi ниже 6,8. Напротив, падение плотности боковых корней также было обнаружено в условиях дефицита Pi 3,13,16. Эти расхождения могут быть связаны с системой питательных сред на основе агара, в которой рабочие используют различные марки агара для желирования сред с различной степенью загрязнения Pi10. Опять же, эксперименты, направленные на то, чтобы проиллюстрировать влияние дефицита Zn на RSA, не могут быть проведены адекватно с использованием метода Петри на основе агара, поскольку желирующая среда на основе агара также включает загрязнение Zn11. Таким образом, проведение анализа RSA может быть нецелесообразным для исследования дефицита питательных веществ с использованием желирующей среды на основе агара. Во-вторых, проростки, выращенные на желирующих средах на основе агара, развиваются не так быстро, как проростки, выращенные на гидропонике. В-третьих, поскольку RSA обычно встроен в агаровую среду, многочисленные корневые признаки отображаются неправильно. В-четвертых, удаление RSA из среды часто наносит существенный ущерб RSA и делает его деструктивным методом отбора проб.

В предыдущем гидропонном методе, опубликованном Jain et al.10, использовалась полипропиленовая ячейка размером 250 мкм, которая имела более узкие поры, которые не позволяли вытащить неповрежденный RSA. В результате, в этом конкретном случае, нам пришлось срезать проростки из гипокотильной области, чтобы отделить RSA, превратив его в деструктивный метод отбора проб10,11,12. Существующий метод является импровизированным, чтобы сделать его неразрушающим с использованием полипропиленовой сетки с большим размером пор (500 мкм), что позволяет вытащить целые ростки арабидопсиса неповрежденными, не нанося никакого ущерба RSA1. Стоит отметить, что мы всегда можем отрегулировать размер пор полипропиленовой сетки в зависимости от типа саженца. Например, на рисунке 4 показано, как аналогичный подход может быть использован для картирования RSA различных растений, таких как Medicago sativa (люцерна). Мы выбрали полипропиленовые поры размером 1 мм для размещения корневой системы Medicago.

Одним из недостатков этой системы может быть развитие корневых волосков, которые часто не процветают в гидропонных системах по сравнению с системами агаровых пластин. Основной причиной является легкая доступность питательных веществ в жидких средах, а не в твердых. Несмотря на то, что мы наблюдали развитие корневых волосков (не устойчивых), используя ту же систему, и получили результаты (дополнительный рисунок 1). Доступность Pi сильно влияет на развитие корневых волос10,11. При этом длина корневых волос сначала увеличилась до 2,5 мМ, а затем уменьшилась.

В целом, ключевыми преимуществами системы являются: (1) это простой и точный метод, не требующий какого-либо сложного высококлассного оборудования; (2) метод позволяет быстро расти проросткам из-за его гидропонной природы; (3) это неразрушающий метод; (4) ручное распространение RSA позволяет правильно отображать каждую черту, выявляя скрытый RSA, предлагая пользователю полный контроль; и (5) в методе используется свободно доступное программное обеспечение для обработки изображений (т.е. ImageJ), которое также простое в использовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы выражаем благодарность Министерству сельского хозяйства США (грант 58-6406-1-017) за поддержку этого исследования. Мы также выражаем признательность Биотехнологическому центру WKU, Университету Западного Кентукки, Боулинг-Грин, штат Кентукки, США, и директору Центрального института лекарственных и ароматических растений CSIR, Лакхнау, Индия, за предоставление инструментального оборудования и поддержки (рукописное сообщение CSIR CIMAP No CIMAP/PUB/2022/103). SS признает финансовую поддержку со стороны Университета Святого Иосифа, Филадельфия, США.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0) Lehle Seeds WT-02 Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes Amazon or any other vendor Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera Leica Microsystems LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software ImageJ ImageJ V
 1.8.0
Magenta box GA-7 Fisher Scientific  50-255-176
Medicago sativa Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm) USA Scientific 8609-0215 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera Cannon or Nikon Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar Sigma-Aldrich A3301 Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets Amazon 1 mm  thick
Polypropylene Mesh Amazon Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner Epson Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
  2. Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
  3. Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
  4. Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
  5. Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
  6. Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
  7. Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
  8. López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
  9. Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
  10. Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
  11. Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
  12. Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
  13. Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
  14. Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
  15. Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
  16. Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
  17. S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
  18. Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
  19. Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
  20. Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 192
Простой протокол для картирования черт архитектуры корневой системы растений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shukla, D., Trivedi, P. K., Sahi, S. … More

Shukla, D., Trivedi, P. K., Sahi, S. A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits. J. Vis. Exp. (192), e64876, doi:10.3791/64876 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter