Summary
למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.
Abstract
זמינותם של תאים שבודדו מרקמות ואיברים בריאים וחולים מהווה מרכיב מפתח בגישות של רפואה מותאמת אישית. למרות שביובנקים יכולים לספק אוסף רחב של תאים ראשוניים ואימורטליים למחקר ביו-רפואי, אלה אינם מכסים את כל צרכי הניסוי, במיוחד אלה הקשורים למחלות או גנוטיפים ספציפיים. תאי אנדותל וסקולריים (ECs) הם מרכיבים מרכזיים של התגובה הדלקתית החיסונית, ולכן ממלאים תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מגוון הפרעות. יש לציין כי ECs מאתרים שונים מציגים תכונות ביוכימיות ותפקודיות שונות, מה שהופך את הזמינות של סוגי EC ספציפיים (כלומר, כלי דם, כלי דם, עורקים וורידים) חיונית לתכנון ניסויים אמינים. כאן, הליכים פשוטים להשגת תפוקה גבוהה, כמעט טהור אנושי תאי אנדותל microvascular מן העורק הריאה ואת parenchyma הריאות מתוארים בפירוט. מתודולוגיה זו ניתנת לשכפול בקלות בעלות נמוכה יחסית על ידי כל מעבדה כדי להשיג עצמאות ממקורות מסחריים ולקבל פנוטיפים / גנוטיפים EC שעדיין אינם זמינים.
Introduction
אנדותל כלי הדם מצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם. הוא ממלא תפקידי מפתח בוויסות קרישת הדם, טונוס כלי הדם ותגובות דלקתיות של מערכת החיסון 1,2,3,4. למרות שתרבית תאי אנדותל (ECs) שבודדו מדגימות אנושיות חיונית למטרות מחקר, יש לציין כי ECs מכלי דם שונים (עורקים, ורידים, נימים) יש פונקציות ספציפיות. אלה אינם ניתנים לשחזור מלא על ידי תאי אנדותל ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC), אשר זמינים בקלות ונמצאים בשימוש נרחב במחקרים על פתופיזיולוגיה של אנדותל כלי דם 5,6. לדוגמה, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הריאה האנושית (HLMVECs) ממלאים תפקידי מפתח בדלקת ריאות על ידי שליטה בגיוס והצטברות לויקוציטים 4,7. לפיכך, הגדרה ניסיונית שמטרתה לשחזר דלקת ריאות עם נאמנות גבוהה צריך לכלול HLMVECs. מצד שני, תפקוד לקוי של EC ניתן לראות במספר פתולוגיות; לכן, ECs מן המטופל הם היסוד לבניית מודל אמין במבחנה של המחלה. לדוגמה, הבידוד של שברי ECs מעורק הריאה (HPAECs), שנותחו מהריאות המושתלות של אנשים שנפגעו מסיסטיק פיברוזיס (CF), איפשר לנו לחשוף מנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל במחלה זו 8,9.
לפיכך, פרוטוקולים שמטרתם לייעל את הבידוד של ECs ממקורות / איברים שונים גם במצבי מחלה חיוניים כדי לספק לחוקרים כלי מחקר יקרי ערך, במיוחד כאשר כלים אלה אינם זמינים מסחרית. פרוטוקולי בידוד HLMVEC ו-HPAEC דווחו בעבר 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. בכל המקרים, העיכול האנזימטי של דגימות הריאה הביא לאוכלוסיות תאים מעורבות, שטוהרו באמצעות מדיה סלקטיבית אד-הוק ומיון תאים מבוססי חרוזים מגנטיים או ציטומטריים. אופטימיזציות נוספות של פרוטוקולים אלה חייבות לטפל בשתי בעיות עיקריות בבידוד EC: (1) זיהום תאים ורקמות, שיש לפתור במעברי התרבית המוקדמים ביותר האפשריים כדי למזער את ההזדקנות המשוכפלת של EC20; ו-(2) התשואה הנמוכה של מבודדי EC ראשוניים.
מחקר זה מתאר פרוטוקול חדש לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של HLMVECs ו-HPAECs. הליך זה יכול להיות ישים בקלות ולתת ECs macrovascular ו microvascular טהור בכמה צעדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר, והפרוטוקול פעל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של אוניברסיטת קייטי-פסקארה (#237_2018bis). איור 1 מדגים את הבידוד של תאי אנדותל ממקטעים (באורך 1-3 ס"מ) של פרנכימה ריאתית או עורק ריאתי מנבדקים אנושיים לא מזוהים (בהסכמה בכתב) שעברו ניתוחי חזה מסיבות שונות, כגון דלקת ריאות או לובקטומיה. במקרה האחרון, המנתחים אספו גם קטע עורק ריאתי. יש לציין כי המנתחים הונחו במדויק לאסוף דגימות נקיות מסרטן. הפרוטוקול המוצג הותאם להשגת התשואה והטוהר הגדולים ביותר האפשריים.
1. הכנה ניסיונית
- הרכבה מחדש של Collagenase
- יש להמיס אבקת קולגנאז במי מלח חוצצי פוספט ללא CaCl 2 ו-MgCl 2 (PBS−−, ראו טבלת חומרים) בריכוז של2 מ"ג/מ"ל, ולסנן את התמיסה באמצעות מסנן נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
- הכינו 5 מ"ל aliquots, ולאחסן אותם ב -20 ° C. הפשירו וחממו מראש את האליציטוטים ל-37°C לפני השימוש.
- ציפוי פלטה
- עבור ציפוי צלחת, פיפטה 1.5% תמיסת ג'לטין או 50 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין (ראה טבלה של חומרים) לתוך צלחת התרבית (500 μL מספיק כדי לכסות את פני השטח של כל באר של צלחת 6 בארות), לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
- לאחר הדגירה, להסיר את הג'לטין העודף, ולשטוף את הבארות עם PBS−−. שאפו את ה-PBS, ותנו לצלחת להתייבש במכסה מנוע סטרילי.
הערה: להרכבה מחדש של ג'לטין, יש להמיס את האבקה במים כדי ליצור תמיסה של 1.5%, ולאחר מכן לבצע אוטוקלבה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. ג'לטין ב 1.5% אינו נוזלי ב 4 ° C; לכן, יש לחמם אותו לפני ציפוי הצלחת. לחילופין, ניתן להשתמש בכל תמיסת ג'לטין מסחרית המתאימה לתרביות תאים לצורך ציפוי הצלחת.
2. הכנת מדגם
- פרנכימה ריאתית
- שטפו את הדגימות שנאספו על ידי טבילתן בצינור של 50 מ"ל המכיל PBS−−.
- מעבירים את הדגימות לצלחת פטרי סטרילית, וקוצצים ידנית באמצעות מספריים כירורגיים (גודל אופטימלי: >2 ס"מ) למקטעים קטנים של כ-3-4 מ"מ כל אחד.
- מקטעי עורקים
- שטפו את הדגימות שנאספו על ידי טבילתן בצינור של 50 מ"ל המכיל PBS−−.
- העבירו אותו לצלחת פטרי סטרילית ללא קיצוץ, שכן פיצול יגדיל את שטח הפנים של חתך הרוחב של קטע העורק, ובכך יגדיל את האפשרות לבודד שאינם ECs.
3. עיכול אנזימטי
- שטפו את פרנכימת הריאה הקצוצה או את מקטע עורק הריאה פעמיים עם PBS−−. צעד זה יסיר חלק גדול מהדם השיורי.
- מניחים את הדגימות בצינורות של 15 מ"ל, ודגרים עם 5 מ"ל של collagenase מסוג 2 (ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2. במהלך דגירה זו, ההתפרקות של המטריצה החוץ תאית משחררת תאים בודדים וצברי תאים.
4. התאוששות של תאים מעוכלים
- הניחו מסננת פלדה / מתכת סטרילית (כלומר, מסננת תה בגודל רשת ~ 1 מ"מ) על החלק העליון של צינור איסוף של 50 מ"ל.
- יוצקים את כל התוכן מצינורית 15 מ"ל על המסננת, מעסים בעדינות את הרקמה המעוכלת עם מרית, ושוטפים את הדגימה עם PBS−− עד שצינורית האיסוף מתמלאת.
הערה: שלב זה יבטל שברי רקמות גדולים בקנה מידה מילימטרי, ויבטיח יעילות רבה יותר של שלבי הסינון הבאים.
5. הסרה שאינה EC על ידי סינון
- סנן את הזרימה שנאספה בשלב 4.2 באמצעות מסננת תאים בגודל רשת של 70 מיקרומטר, ואסוף את הזרימה בצינור טרי של 50 מ"ל.
- לאחר מכן, השתמש במסננת תאים בגודל רשת של 40 מיקרומטר, ואסוף את הזרימה החוצה בצינור טרי של 50 מ"ל. תייג צינור זה כ"צינור 1".
הערה: סינונים אלה בשלב 5.1 ובשלב 5.2 יסירו צברי תאים גדולים, המורכבים לעתים קרובות מאוכלוסיות תאים מעורבות.
6. שקיעה של צבירי תאים וזריעת תאים
- צנטריפוגה את הדגימות ב 30 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע את אשכולות התא.
- מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה סטרילית (לא שופכים), ומניחים אותו בצינור טרי של 50 מ"ל ("צינור 2").
- השהה את הגלולה ב"צינור 1", ומלא את הצינור עד 50 מ"ל עם PBS−−. מלא "צינור 2" עד 50 מ"ל עם PBS−−.
הערה: משלב זה ואילך, שני הצינורות מטופלים באותו אופן. - צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- להשהות את הכדוריות עם 2 מ"ל של מדיום צמיחה (ראה טבלת חומרים), ולזרוע את התרחיף בשתי בארות נפרדות של צלחת מצופה מראש 6 בארות (שלב 1.2).
הערה: משלב זה, הזן את התאים כל יומיים עם מדיום הגידול עד שהם מגיעים למפגש (כשבוע, בהתאם לגודל המדגם) על מנת לקבל מספר סביר של תאים למיון.
7. הרחבת תאים
- שטפו את התאים עם 2 מ"ל PBS עם CaCl 2 ו-MgCl2 (PBS++, ראו טבלת חומרים) כדי להסיר את שאריות תאי הדם (שימוש ב-PBS++ חשוב כדי למנוע ניתוק תאים).
- הסר את PBS++ והוסף מדיום תרבית רענן.
- חזור על שלב 7.1 ושלב 7.2 עד שהתאים מגיעים למפגש (כשבוע, בהתאם לגודל הדגימה).
8. מיון תאים
- נתק את התאים באמצעות 500 μL של טריפסין-EDTA (0.05%, ראה טבלת חומרים), צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה עם 190 μL של PBS−−.
- הוסף 10 μL של נוגדן CD31-FITC מצומד פלואורסצנטי אנטי-אנושי (דילול 1:20, ראה טבלת חומרים), ודגור על תרחיף התא ב -4 ° C למשך 30 דקות.
- שטפו את התאים באמצעות 10 מ"ל של PBS−−, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשעו מחדש את הגלולה ב 300 מיקרוליטר של PBS−−−.
- בודד ואסוף תאים חיוביים CD31 (CD31+) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), באמצעות פייה של 100 מיקרומטר, ואסוף אותם בצינור.
- בהתאם לאסטרטגיית הגאט, הגדר תחילה את המורפולוגיה של התא באמצעות פרמטרי אזור פיזור הצד, SSC-A ו- FSC-A. לאחר מכן, בחר תאים בודדים באמצעות תרשים נקודות FSC-Area/FSC-Height או SSC-Area/SSC-Height, הגדר את התאים החיוביים במדגם המסומן לעומת דגימת הבקרה הלא מוכתמת, וכוון את התאים הפלואורסצנטיים לתוך צינור האיסוף21.
- צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשעות את הגלולה ב 2 מ"ל של מדיום צמיחה לזריעה בבארות מצופות מראש של צלחת 6 בארות.
9. הרחבה לאחר מיון
- יומיים לאחר מיון התאים, החליפו את המדיום המותנה במדיום גידול טרי.
- חזור על שלב 7.1 ושלב 7.2 כל יומיים לצורך הרחבת תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד HLMEC
הבעיה העיקרית במהלך הבידוד של HLMVECs היא נוכחות של תאים מזהמים, שכן נימים מיקרוסקופיים לא ניתן להפריד בקלות מרקמת סטרומה. לכן, השגת טוהר גבוה ככל האפשר בשלבים המוקדמים ביותר של תהליך הבידוד היא חיונית על מנת להפחית את מעברי התרבית, ובכך את הזדקנות התא. כמו כן, פרוטוקול בידוד אופטימלי אמור לתת את התשואה הגבוהה ביותר האפשרית של HLMVECs טהורים. כדי להשיג מטרות אלה, נקבע נוהל חדש המבוסס על פרוטוקולים 10,11,12,14,15 שתוארו קודם לכן.
למרות שפרנכימת הריאות היא כלי דם מאוד, ולכן מייצגת מקור מצוין של HLMVECs, היא מאוכלסת בעיקר על ידי תאי שריר חלק (SMC), סיבי קולגן ופיברובלסטים. תאים אלה, במיוחד SMCs, יכולים להסתגל למגוון של אמצעי תרבית, וכמעט בכל המקרים, להשתכפל במבחנה הרבה יותר מהר מאשר אוכלוסיות תאים אחרות, כלומר הם משתלטים על תרבית תאים מעורבת. לכן, הדאגה הראשונה שלנו הייתה לכייל את העיכול האנזימטי של הפרנכימה כדי להפחית את הנשיאה של תאים לא רצויים. מאחר שקולגנאז מסוג 2 מנתק במהירות קבוצות של תאי אנדותל משאר הנימים, הסקנו שזמן העיכול של דגימת הריאה עשוי להיות חיוני למזעור זיהום התאים. לכן, כצעד ראשון, זמן החשיפה לקולגנאז של מקטע הריאה שנכרת הופחת למקסימום של 10 דקות במקום 20 דקות15 (איור 2A). לאחר הטיפול הזה, נצפה שחלק מאגרגטי התאים, כולל SMCs ופיברובלסטים, עדיין היו קשורים לסיבים ארוכים (איור 2B), בעוד ש-SMCs ייצגו את רוב הסינגלים שאינם תאי דם. צבירי תאים קטנים וקומפקטיים, שהקטרים שלהם בדרך כלל אינם עולים על 10-20 מיקרומטר, נצפו גם הם ללא אלמנטים המיוחסים לשברי רקמת סטרומה (כלומר, סיבים גדולים) (איור 2B). הועלתה השערה כי צברי תאים קטנים אלה יכולים להיות מורכבים בעיקר מ-HLMVECs.
בעקבות השערה זו, בוצעו שלבי סינון סדרתי כדי למקסם את התאוששות HLMVEC. עבור הסינון הראשון נעשה שימוש במסננת מתכת, והדגימה עוסה בפינצטה כדי להקל על בריחת HLMVECs מהנימים (איור 2C, מימין). מטרת צעד זה הייתה להסיר את הצבירים הגדולים של תאי שריר חלק ופיברובלסטים שעדיין קשורים למטריצה החוץ תאית. לאחר מכן הזרימה סוננה באמצעות רצף של מסננות בגודל רשת של 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר כדי להסיר את שאריות הצברים הגדולים, אם כי לא נראים לעין (איור 2C, באמצע, משמאל). כדי להסיר את סינגלטים התא, הדגימות היו צנטריפוגות ב 30 x גרם במשך 5 דקות, מהירות שמשקעים תאים וצברים בקוטר >7-10 מיקרומטר, ובכך להשאיר את התאים הקטנים יותר בהשעיה. פרמטרים אלה של צנטריפוגות נבחרו על סמך אלה שדווחו על ידי מירון ואחרים עבור כדוריות תאי דם במחזור22. יש לציין שאחרי הצנטריפוגה הזאת, הסופרנאטנט היה בצבע אדום (איור 2D), מה שמצביע על נוכחות של תאי דם אדומים רבים (~5 מיקרומטר קוטר). בשלב זה, הסופרנאטנט הוסר בזהירות והוכנס לצינור שני. שני הצינורות שהכילו את הסופרנאטנט ואת הגלולה מולאו ב-PBS וצנטריפוגות במהירות של 300 x גרם במשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הצינור שהכיל את הסופרנאטנט הראה גלולה אדומה מועשרת בתאי דם, מה שמרמז על כך שהיא הכילה גם את רוב סינגלי התאים שהושתלו (איור 2E, מימין).
הכדוריות שהתקבלו הושעו עם מדיום גידול תאי אנדותל ונזרעו בנפרד בשתי בארות של צלחת בת 6 בארות, אשר צופו מראש בג'לטין 1.5% מעור חזירי (איור 2E, באמצע). לאחר 3 ימים, התאים נשטפו עם PBS++, הוזנו בתווך טרי וצולמו. כפי שניתן לראות משמאל לאיור 2E, איי EC היו נפוצים יותר בבאר שהכילה את התאים מ"צינור 1" (למעלה), בעוד שהבאר שהכילה את התאים מ"צינור 2" (למטה) אוכלסה בעיקר על-ידי תאים בודדים שאינם דמויי אנדותל.
אותו הליך יושם גם על פרוטוקול בידוד HPAEC הפחות מאתגר שדווח בעבודתנו הקודמת, שבו הפרדת HPAEC כללה ניצול זמן ההדבקה הקצר יותר שלהם בהשוואה לזה של תאים מזהמים8. בשל גודלם הגדול, ניתן לנקות עורקים בקלות מרקמות חיבור ושומן שיורית, ובכך לבטל חלק גדול של שאינם ECs. עם זאת, חלק גדול של פיברובלסטים וסיבי מטריצה חוץ-תאיים עדיין היה נוכח בדגימות בשלב זה, בנוסף ל-SMCs8 של כלי הדם. ההליך החדש הגדיל עוד יותר את טוהר ה- EC הראשוני במהלך ה- HPAEC explants (התוצאות לא מוצגות).
טיהור ואפיון פנוטיפי ופונקציונלי של HLMVECs מבודדים טריים
בסוף פרוטוקול הבידוד, טוהר ה- HLMVECs נותח על ידי זיהוי ציטומטרי זרימה של קרום התא CD31. כדי לזהות נכונה את תא התא CD31+, נקבע שער על תרשים נקודות פיזור קדמי (FSC)/פיזור צדדי (SSC), וזוהתה אוכלוסיית תאים הומוגנית מורפולוגית. אוכלוסייה כזו יוצגה בתרשים נקודות FSC-Area/FSC-Height, ותאים בודדים גודרו ונותחו עבור ביטוי פני השטח של CD31 (אסטרטגיית gating היררכית, לא מוצגת). במקרה הטוב ביותר, ~70% תאים בודדים טהורים מסוג HLMVEC (איור 3A,B) התקבלו. יש לציין כי תפוקת HLMVEC הופחתה באופן משמעותי כאשר הדגימה לא עובדה מיד לאחר הניתוח או כאשר התורם היה מבוגר או מעשן.
כדי להשיג תכשירי HLMVEC טהורים יותר, תאי CD31+ מוינו ונזרעו בצלחות תרבית מצופות ג'לטין של 1.5%. התאים הממוינים קיבלו את הצורה האופיינית דמוית האנדותל (איור 3C), וכפי שדווח באיור 3D, מיקרוסקופ קונפוקלי הראה שכמעט 100% מהתאים שטוהרו ב-FAC הוכתמו כחיוביים לאנטיגנים של EC, כלומר CD31 וגורם פון וילברנד הספציפי יותר (vWF)23. יתר על כן, כאשר התאים האלה נזרעו במטריג'ל, הם יצרו מבנים צינוריים, כמו גם HUVECs (איור 3E), ובכך אישרו את הפנוטיפ של האנדותל שלהם.
איור 1: ייצוג סכמטי של ההליך. תרשים הזרימה מציג את הליך בידוד תאי אנדותל והסרת תאים שאינם אנדותל. כל שלב משחזר את האירועים המתוארים בשלבים 2-6 של פרוטוקול הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המחשה של הליך בידוד EC ממוטב. (A) תמונה מייצגת של דגימת פרנכימה ריאתית חתוכה לקוביות במקטעים קטנים לפני עיכול הקולגנאז (משמאל) ומודגרת בצינור של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של קולגנאז מסוג 2 (מימין). (B) ייצוג סכמטי (משמאל) וממשי (מימין; הגדלה: פי 100) של אוכלוסיות התאים המתקבלות לאחר עיכול קולגן. אוכלוסיות אלה כוללות סינגלטים של לא-ECs ו-ECs, קבוצות של ECs וקבוצות של לא-ECs הקשורים לסיבים, אשר מוסרים באמצעות מסננות. (C) סינונים סדרתיים באמצעות מסננות רשת מתכתיות של 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר. (D) תמונה של צינור 50 מ"ל לאחר צנטריפוגה במהירות נמוכה ולפני הפרדת הסופרנאטנטים מהכדורים ב"צינור 1" ו"צינור 2". צבירי תאים כלולים בכדורית, בעוד שהתאים הבודדים נמצאים בעיקר בסופרנטנט. (E) תמונה המציגה את הצבעים והקומפוזיציות השונים של הגלולה והתאים המבודדים מ"צינור 1" (למעלה) ו"צינור 2" (למטה); הגדלה: פי 100. קיצור: EC = תאי אנדותל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של HLMVEC . (A) אוכלוסיית תאים מעורבת המתקבלת מצמח פרנכימה ריאתי. (B) זיהוי CD31 על ידי ציטומטריית זרימה על פני השטח של תאים בסוף המעבר הראשון. אחוז הטוהר (70%) מתייחס לאסטרטגיית ה-gating ההיררכית המשומשת. (C) HLMVECs טהורים לאחר מיון חי לאנטיגן CD31. (D) תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מייצגות של CD31 (משמאל) ו- vWF (מימין) צביעה חיובית (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). (E) תמונות ברייטפילד צולמו 6 שעות לאחר זריעת HUVECs או HLMVECs על Matrigel.הגדלה (A, C, E): 100x. קיצורים: HLMVECs = תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הריאה האנושית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התפקידים המרובים שממלאים תאי אנדותל וסקולריים בפתופיזיולוגיה האנושית הופכים תאים אלה לכלי חיוני למחקרים פתוגנטיים ופרמקולוגיים במבחנה . מכיוון שECs מאתרים / איברים שונים של כלי דם מציגים תכונות ותפקודים מוזרים, הזמינות של ECs בריאים וחולים מהאיבר המעניין תהיה אידיאלית למטרות מחקר. לדוגמה, HLMVECs חיוניים למחקרים על דלקת ריאות; לכן, מתודולוגיה לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאים אלה תועיל לתחומי מחקר שונים.
שיטות לבידוד HLMVECs דווחו על ידי קבוצות שונות 10,11,12,14,15,17,18,19. כל שיטה הציגה גישות חדשניות, כגון מיון תאים עם חרוזים מגנטיים 11,12,15,17,18 או דיסוציאציה מכנית באמצעות צינורית קהה17,18. הפרוטוקול הנוכחי תוכנן לאסוף את האיים הקטנים של תאי אנדותל שהתקבלו לאחר עיכול collagenase והשתמש בצנטריפוגות טוריות מבוססות זמן שיקוע כדי להגביר את טוהר ECs באוכלוסיית התאים המעורבים הראשונית. נקודה זו היא קריטית מכיוון שמספרים גבוהים יותר של תאים התחלתיים פירושם שיש צורך במספר נמוך יותר של הרחבות חוץ גופיות כדי להגיע למספר התאים הדרוש לניסויים, מה שבתורו אומר שניתן להשלים יותר חקירות לפני שה- ECs מזדקנים. היבט זה קשור אך ורק למידת הטוהר של מבודדי HLMVEC, הרלוונטי גם להשגת תוצאות אמינות. יתר על כן, אם דגימת הריאה קטנה מאוד בגודלה ואין אפשרות לבצע מיון EC מיד לאחר החציבה, מה שהיה, מניסיוננו, התרחיש השכיח ביותר, ה- SMCs המזהמים יגדלו מהר יותר מה- ECs, ובכך ישתלטו על התרבית ויקטינו את התשואה של ECs לאחר מיון תאים.
במחקר זה ניסינו להתייחס לנקודות אלה. לשם כך, מה שקרה לדגימות הריאה לאחר עיכול הקולגנאז נוטר בתחילה, וזיהום משמעותי זוהה על-ידי סוגי תאים שונים, במיוחד SMCs (איור 2), אשר גדלים מהר ויכולים לעקוף HLMVECs בתרביות מעורבות. לכן, נקבעה אסטרטגיה למזער את הזיהום הזה באופן מיידי לאחר העיכול (איור 1 ואיור 2). באופן מדהים, HLMVECs עם ~70% טוהר (איור 3A,B) התקבלו באופן עקבי בשלב הבידוד הראשון. התוצאה המצוינת הזו הקלה על שלב הטיהור הבא על-ידי FACS, מה שהוביל לתוצאה הסופית של קבלת HLMVECs כמעט טהורים ופונקציונליים (איור 3C-E). תוצאות דומות התקבלו כאשר מקטעי עורק הריאה שימשו כחומר המוצא ו- HPAECs היו התאים המבודדים, כלומר מתודולוגיה זו מייצגת שיפור של המתודולוגיה שדווחה קודם לכן8.
למרות שהוא פשוט וניתן לשחזור, להליך זה יש דרישות מפתח. לדוגמה, הצלחנו בבידוד HLMVEC רק על ידי עיבוד מקטעי ריאות שהתקבלו תוך 3-6 שעות מהכריתה הניתוחית, בעוד שמרווחי זמן ארוכים יותר היו קשורים לתוצאות גרועות (הנתונים לא הוצגו). זמן העיכול של collagenase יכול גם להציג שונות בתפוקת EC עקב שינויים הרבה להרבה בפעילות אנזימטית24. נקודה קריטית נוספת קשורה למצב המדגם. פרנכימה ריאתית שמקורה במעשנים או בתורמים קשישים הניבה תשואות HLMVEC נמוכות. יתר על כן, supernatant של צנטריפוגה במהירות נמוכה עשוי להכיל כמה אגרגטים המועברים לתוך "צינור 2". מסיבה זו, מומלץ לשמור את התוכן של "צינור 1" ו "צינור 2" בתרבית, לפחות בשלב המוקדם של בידוד התא. המיון הישיר של תאי CD31+, כפי שתואר קודם לכן בפרוטוקולי בידוד EC 11,12,15,17,18, יכול גם להוות פתרון טוב להגברת הטוהר מההתחלה. לא יישמנו את שלב המיון המוקדם הזה בגלל גודלן הקטן של הדגימות שנותחו. עם זאת, אפשרות זו תיבחן בעתיד ביישום הפרוטוקול.
פרוטוקול בידוד פשוט ואמין לבידוד HLMVECs ו-HPAECs יעודד חוקרים להשתמש בנתיב זה כדי להשיג תאים למחקריהם, במיוחד כאשר תאים אלה אינם זמינים מסחרית. לדוגמה, בידוד HLMECs מריאות CF יאפשר בניית נתיב אוויר מלא של CF על שבב25. יתר על כן, יצירת אוסף EC משלהם תאפשר לחוקרים לתכנן ולהריץ ניסויים נוספים בעלות נמוכה יותר.
לסיכום, שיטה זו, אשר פותרת כמה נקודות קריטיות שעלולות להתרחש במהלך בידוד EC מדגימות כירורגיות, משפרת את השיטות הקיימות, ובכך להקל על המחקר על פתולוגיה EC ודלקת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא כל יחסים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממשרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (לשעבר 60% 2021 ו -2022) ל- R. P. ועל ידי מענקים מקרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC #23/2014) וממשרד הבריאות האיטלקי (L548/93) ל- M. R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A.
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G.
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D.
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
