Summary
एपीट्रैक ओपन एफिज़ प्लेटफॉर्म के लिए विकसित एक सॉफ्टवेयर प्लगइन है जो वास्तविक समय डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और न्यूरोनल एक्शन पोटेंशिअल के बंद-लूप विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग को सक्षम बनाता है। हमने मानव सी-फाइबर नोसिसेप्टर और माउस सी-फाइबर और ए-फाइबर नोसिसेप्टर के लिए माइक्रोन्यूरोग्राफी में इसका सफलतापूर्वक उपयोग किया है।
Abstract
नोसिसेप्टर प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स का एक वर्ग है जो संभावित हानिकारक हानिकारक उत्तेजनाओं का संकेत देता है। तीव्र और पुरानी दर्द की स्थिति में नोसिसेप्टर उत्तेजना में वृद्धि होती है। यह असामान्य चल रही गतिविधि या हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए कम सक्रियण सीमा पैदा करता है। तंत्र-आधारित उपचारों के विकास और सत्यापन के लिए इस बढ़ी हुई उत्तेजना के कारण की पहचान करना आवश्यक है। सिंगल-न्यूरॉन इलेक्ट्रिकल थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग नोसिसेप्टर उत्तेजना को निर्धारित कर सकती है। इसलिए, हमने इस तरह के माप की अनुमति देने और मनुष्यों और कृन्तकों में इसके उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए एक आवेदन विकसित किया है। एपीट्रैक एक अस्थायी रास्टर प्लॉट का उपयोग करके वास्तविक समय डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और एक्शन संभावित पहचान प्रदान करता है। एल्गोरिदम थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग द्वारा एक्शन पोटेंशिअल का पता लगाते हैं और विद्युत उत्तेजना के बाद उनकी विलंबता की निगरानी करते हैं। प्लगइन तब नोसिसेप्टर्स की विद्युत सीमा का अनुमान लगाने के लिए एक अप-डाउन विधि का उपयोग करके विद्युत उत्तेजना आयाम को संशोधित करता है। सॉफ्टवेयर ओपन एफिसिस सिस्टम (वी 0.54) पर बनाया गया था और जेयूसीई ढांचे का उपयोग करके सी ++ में कोडित किया गया था। यह विंडोज, लिनक्स और मैक ऑपरेटिंग सिस्टम पर चलता है। ओपन-सोर्स कोड उपलब्ध है (https://github.com/
Introduction
नोसिसेप्टर परिधीय तंत्रिका तंत्र में प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स हैं जो अत्यधिक या संभावित ऊतक-हानिकारक घटनाओं से सक्रिय होते हैं और तीव्र दर्द1 में एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक भूमिका निभाते हैं। पशु मॉडल, स्वस्थ मानव स्वयंसेवकों और रोगियों में सी-फाइबर और ए-फाइबर नोसिसेप्टर से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग ने दर्दकी स्थिति 2,3,4,5,6,7 की एक विविध श्रृंखला में संवेदीकरण और असामान्य सहज गतिविधि का खुलासा किया है। रोगियों में नोसिसेप्टर उत्तेजना में इन परिवर्तनों को कम करने वाले तंत्र को समझना लक्षितचिकित्सीय हस्तक्षेप को सक्षम कर सकता है। हालांकि, सीधे नोसिसेप्टर उत्तेजना का आकलन करने के लिए कुछ उपकरण हैं, विशेष रूप से रोगियों9 में, लेकिन ऐसे उपकरणों की उपयोगिता की क्षमता अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है10,11.
संपूर्ण तंत्रिका विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग काउपयोग मनुष्यों में अक्षीय उत्तेजना की जांच करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, बड़े, माइलिनेटेड, परिधीय न्यूरॉन्स संवेदी यौगिक कार्रवाई क्षमता के आयाम में असमान रूप से योगदान करते हैं, पूरे तंत्रिका विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग सी-फाइबर फ़ंक्शन11,13 के मूल्यांकन की अनुमति नहीं देता है। दरअसल, पिछले अध्ययन में, मधुमेह न्यूरोपैथी और कीमोथेरेपी-प्रेरित पॉलीन्यूरोपैथी के साथ पुरानी न्यूरोपैथिक दर्द समूहों में पूरे तंत्रिका विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग ने अक्षीय उत्तेजना11 में कोई अंतर नहीं दिखाया।
पिछले अध्ययन में, एकल-न्यूरॉन स्तर पर विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग का उपयोग एक्स विवो चूहे की त्वचा-तंत्रिका तैयारी14 में टीज-फाइबर रिकॉर्डिंग के दौरान सी-फाइबर नोसिसेप्टर की उत्तेजना की जांच करने के लिए किया गया था। लेखकों ने प्रदर्शित किया कि पोटेशियम एकाग्रता, अम्लीय स्थितियों और ब्रैडीकिनिन में वृद्धि हुई है, सभी ने सी-फाइबर नोसिसेप्टर उत्तेजना में वृद्धि की है, जैसा कि कार्रवाई संभावित पीढ़ी के लिए कम विद्युत सीमा द्वारा परिलक्षित होता है। इसके अलावा, गर्मी-संवेदनशील नोसिसेप्टर्स के ग्रहणशील क्षेत्र को गर्म करने से उनकी विद्युत सीमा कम हो गई, जबकि गर्मी-असंवेदनशील नोसिसेप्टर्स ने अपनी विद्युत सीमा14 में वृद्धि का प्रदर्शन किया। यह महत्वपूर्ण प्रमाण प्रदान करता है कि एकल-न्यूरॉन विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग संभव है और उपयोगिता हो सकती है, लेकिन वर्तमान में ऐसी जांच को सक्षम करने के लिए कोई सॉफ्टवेयर और / या हार्डवेयर समाधान उपलब्ध नहीं हैं, खासकर मानव अध्ययन के लिए।
मनुष्यों में, माइक्रोन्यूरोग्राफी सी-फाइबर15 के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का सीधे आकलन करने के लिए एकमात्र उपलब्ध विधि है। इस दृष्टिकोण का उपयोग पुराने दर्द 2,3,4,5,6,7 वाले रोगियों में नोसिसेप्टर डिसफंक्शन का प्रदर्शन करने के लिए किया गया है। माइक्रोन्यूरोग्राफी एकल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल का पता लगा सकती है; हालांकि, कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के कारण, शोधकर्ता सी-फाइबर गतिविधि16 को चिह्नित करने के लिए अंकन तकनीक का उपयोग करते हैं। अंकन तकनीक में, त्वचा में सी-फाइबर ग्रहणशील क्षेत्रों पर सुप्राथ्रेशोल्ड विद्युत उत्तेजना लागू की जाती है। यह विद्युत उत्तेजना एक क्रिया क्षमता उत्पन्न करती है जो एक निरंतर विलंबता पर होती है, जो सी-फाइबर के चालन वेग द्वारा निर्धारित की जाती है। सी-फाइबर गतिविधि-निर्भर धीमापन प्रदर्शित करते हैं, जिससे उनका चालन वेग कम हो जाता है और इसलिए, कार्रवाईसंभावित निर्वहन की अवधि के दौरान उनकी चालन विलंबता बढ़ जाती है। बेसल स्थितियों के तहत, सी-फाइबर आमतौर पर हानिकारक उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में कार्रवाई क्षमता उत्पन्न नहीं करते हैं, और इसलिए, कम आवृत्ति विद्युत उत्तेजना के जवाब में उनकी चालन विलंबता स्थिर है। यांत्रिक, तापीय या औषधीय उत्तेजनाएं, जो फायरिंग को जन्म देती हैं, गतिविधि-निर्भर धीमापन को प्रेरित करती हैं, जो सहवर्ती कम आवृत्ति विद्युत उत्तेजना द्वारा उत्पन्न कार्रवाई क्षमता की विलंबता को बढ़ाती हैं। यह कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के संदर्भ में लागू गैर-विद्युत उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं की उद्देश्य पहचान की अनुमति देता है। इसलिए, गतिविधि-निर्भर धीमापन का उपयोग कार्यात्मक रूप से सी-फाइबर16 को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, सी-फाइबर के विभिन्न कार्यात्मक वर्ग विद्युत उत्तेजना प्रतिमानों में गतिविधि-निर्भर धीमेपन के विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जिसमें उत्तेजना आवृत्ति18,19 को बदलना शामिल है। सी-फाइबर एक्शन पोटेंशिअल की विलंबता में यह परिवर्तनशीलता उनकी निगरानी के लिए डिज़ाइन किए गए एल्गोरिदम के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती है।
एक नोसिसेप्टर में चल रही गतिविधि कम आवृत्ति विद्युत उत्तेजना के दौरान इसकी विलंबता में बढ़ी हुई परिवर्तनशीलता की ओर ले जाती है, और यह फिर से गतिविधि-निर्भर धीमापन के कारण होती है। यह बढ़ी हुई परिवर्तनशीलता, या घबराहट, उत्तेजना का एक मात्रात्मक प्रॉक्सी मापहै। कार्रवाई संभावित विलंबता में परिवर्तनशीलता के आगे के कारणों में फ्लिप-फ्लॉप शामिल है, जहां एक एकल न्यूरॉन की वैकल्पिक टर्मिनल शाखाएं उत्तेजित होती हैं, जिसके कारण उत्पन्न कार्रवाई क्षमता में दो (या अधिक) बेसलाइन लेटेंसी होती हैं जो पारस्परिक रूप से अनन्यहोती हैं। अंत में, परिधीय न्यूरॉन की टर्मिनल शाखाओं के तापमान में परिवर्तन भी थर्मोडायनामिक तरीके से कार्रवाई संभावित विलंबता परिवर्तन का कारण बनता है, वार्मिंग के साथ चालन वेग बढ़ जाता है और शीतलन चालन वेगको धीमा कर देता है। इस प्रकार, नोसिसेप्टिव सी-फाइबर के बंद-लूप विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग करने की मांग करने वाले किसी भी सॉफ्टवेयर को विद्युत रूप से उत्पन्न कार्रवाई क्षमता में विलंबता में परिवर्तन की अनुमति देनी चाहिए।
सी-फाइबर नोसिसेप्टर्स के क्रॉस-प्रजाति विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग के हमारे लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हमने वास्तविक समय, बंद-लूप, विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग और विलंबता ट्रैकिंग को सक्षम करने के लिए ओपन एफिज़ प्लेटफॉर्म21 के लिए एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्लगइन एपीट्रैक विकसित किया। हम प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट डेटा प्रदान करते हैं जो दर्शाता है कि मानव माइक्रोन्यूरोग्राफी के दौरान सी-फाइबर नोसिसेप्टर इलेक्ट्रिकल थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग संभव है। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि इस उपकरण का उपयोग कृंतक पूर्व विवो टीज़-फाइबर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में किया जा सकता है, इस प्रकार मनुष्यों और कृन्तकों के बीच अनुवाद संबंधी अध्ययन को सक्षम किया जा सकता है। यहां, हम विस्तार से वर्णन करेंगे कि शोधकर्ता नोसिसेप्टर फ़ंक्शन और उत्तेजना के अपने अध्ययन में सहायता के लिए इस उपकरण को कैसे कार्यान्वित और उपयोग कर सकते हैं।
Protocol
मानव माइक्रोन्यूरोग्राफी प्रयोगों को ब्रिस्टल विश्वविद्यालय (संदर्भ संख्या: 51882) में जीवन विज्ञान अनुसंधान नैतिकता समिति के संकाय द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी अध्ययन प्रतिभागियों ने लिखित सूचित सहमति दी। ब्रिस्टल पशु कल्याण विश्वविद्यालय और नैतिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदन के बाद यूके पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के अनुसार ब्रिस्टल विश्वविद्यालय में पशु प्रयोग किए गए थे और एक परियोजना लाइसेंस द्वारा कवर किए गए थे।
1. ओपन एफिज़ जीयूआई और एपीट्रैक स्थापित करना
- समर्थित (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) ओपन Ephys ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) के नवीनतम संस्करण को ढूँढने के लिए सॉफ़्टवेयर दस्तावेज़ीकरण की जाँच करें, और उसके बाद डाउनलोड करें और GUI स्थापित करें।
- निम्न URL से GUI का संगत संस्करण स्थापित करें: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
- GitHub से नवीनतम संस्करण डाउनलोड करें: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Windows कंप्यूटर के लिए, प्लगइन्स फ़ोल्डर में .dll फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएँ, जो आमतौर पर C:\Program Files\Open Ephys\plugins पर पाया जाता है. किसी MacOS कंप्यूटर के लिए, पैकेज के सामग्री/प्लगइन्स फ़ोल्डर में .बंडल फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएँ।
2. रिकॉर्डिंग और उत्तेजक उपकरण की असेंबली
- निर्माता-आपूर्ति किए गए केबल का उपयोग करके अधिग्रहण बोर्ड को कंप्यूटर से कनेक्ट करें, और इसे चालू करें।
नोट: मानव माइक्रोन्यूरोग्राफी के लिए, कंप्यूटर से प्रतिभागी को विद्युत रूप से अलग करने के लिए एक यूएसबी 3.0 आइसोलेटर का उपयोग किया गया था, और अधिग्रहण बोर्ड को कृंतक अध्ययन के लिए उपयोग की जाने वाली मुख्य वोल्टेज बिजली आपूर्ति के विपरीत एक पोर्टेबल बैटरी द्वारा संचालित किया गया था। स्टेपर मोटर कंट्रोल बोर्ड को छोड़कर सभी यूएसबी कनेक्शन, मानव अध्ययन के दौरान यूएसबी आइसोलेटर के माध्यम से पारित किए गए थे। - I/O बोर्ड को अधिग्रहण बोर्ड पर एनालॉग इन पोर्ट से कनेक्ट करें। एक सीरियल-परिधीय इंटरफ़ेस (एसपीआई) केबल का उपयोग करके अधिग्रहण बोर्ड से एक इंटन आरएचडी रिकॉर्डिंग हेडस्टेज कनेक्ट करें।
नोट: इंटान 16-चैनल द्विध्रुवी य हेडस्टेज का उपयोग यहां किया गया था, लेकिन अन्य मोनोपोलर आरएचडी 2000 श्रृंखला हेडस्टेज का उपयोग किया जा सकता है। - PulsePal को कंप्यूटर22 से कनेक्ट करें। माउस टीज़-फाइबर रिकॉर्डिंग के साथ, पल्सपाल का उपयोग करके एनालॉग वोल्टेज-नियंत्रित उत्तेजक (जैसे, डीएस 4) के साथ असेंबली के लिए, चरण 2.5.1-2.5.3 का पालन करें; मानव माइक्रोन्यूरोग्राफ़ी रिकॉर्डिंग के साथ, स्टेपर मोटर का उपयोग करके रोटरी एनकोडर-आधारित उत्तेजक (जैसे, डीएस 7) के साथ संयोजन के लिए, चरण 2.6.1-2.6.8 (चित्रा 1) का पालन करें।
- नीचे वर्णित के रूप में जीयूआई में सिग्नल श्रृंखला का निर्माण करें।
- रिदम एफपीजीए प्लगइन को बाएं-क्लिक करके और सिग्नल चेन में खींचकर सिग्नल चेन में डालें; यह जीयूआई को अधिग्रहण बोर्ड से जोड़ता है। सुनिश्चित करें कि आई / ओ बोर्ड से एडीसी चैनलों की रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए एडीसी बटन पर क्लिक किया गया है। एडीसी बटन चालू होने पर नारंगी रंग की रोशनी देगा।
नोट: यदि आप पहले से रिकॉर्ड किए गए प्रयोगात्मक डेटा को वापस खेलना चाहते हैं, तो फ़ाइल रीडर प्लगइन का उपयोग रिदम एफपीजीए के बजाय शुरुआत में किया जा सकता है। एपीट्रैक के साथ संयोजन में इसका उपयोग पिछले प्रयोगों में एक्शन पोटेंशिअल के विज़ुअलाइज़ेशन और लेटेंसी ट्रैकिंग के लिए अनुमति देगा। - सिग्नल चेन में एक बैंडपास फ़िल्टर डालें; 300-6,000 हर्ट्ज की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स मानव और माउस रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उपयुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, इसके बाद एक स्प्लिटर डालें।
- स्प्लिटर के एक तरफ सिग्नल चेन में एपीट्रैक प्लगइन डालें और दूसरी तरफ एलएफपी व्यूअर। एलएफपी व्यूअर एक पारंपरिक ऑसिलोस्कोप जैसा वोल्टेज ट्रेस व्यू प्रदान करता है, जो प्रयोगों के दौरान उपयोगी होता है।
- प्लगइन के बाद एक रिकॉर्ड नोड डालें. ड्रॉप-डाउन मेनू में, डेटा सेव प्रारूप को बाइनरी से ओपन एफिज़ में बदलें। यह एक सरल सिग्नल श्रृंखला को पूरा करता है जो अच्छी तरह से काम करता है (चित्रा 2); हालांकि, अतिरिक्त घटकों को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं द्वारा निर्धारित के रूप में जोड़ा जा सकता है।
नोट: यदि सिग्नल श्रृंखला में प्लगइन से पहले रिकॉर्ड नोड रखा गया है, तो कार्रवाई संभावित ट्रैकिंग जानकारी सहेजी नहीं जाएगी। - जीयूआई के शीर्ष दाईं ओर, अधिग्रहण बोर्ड से डेटा संचारित करना शुरू करने और इसे विज़ुअलाइज़ करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, प्ले बटन के बगल में सर्कुलर रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें।
नोट: रिकॉर्ड पर क्लिक करना भूलना आसान है; हम उस क्षण से डेटा रिकॉर्ड करते हैं जब हम ऐसा होने से रोकने के लिए प्राप्त करना शुरू करते हैं।
- रिदम एफपीजीए प्लगइन को बाएं-क्लिक करके और सिग्नल चेन में खींचकर सिग्नल चेन में डालें; यह जीयूआई को अधिग्रहण बोर्ड से जोड़ता है। सुनिश्चित करें कि आई / ओ बोर्ड से एडीसी चैनलों की रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए एडीसी बटन पर क्लिक किया गया है। एडीसी बटन चालू होने पर नारंगी रंग की रोशनी देगा।
- एनालॉग वोल्टेज-नियंत्रित उत्तेजक के साथ असेंबली के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
- एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक पर शक्ति जिसमें एनालॉग वोल्टेज इनपुट द्वारा नियंत्रित उत्तेजना आयाम होता है। इस मामले में एक DS4 का उपयोग किया गया था (चित्रा 1)।
- पल्सपाल आउटपुट चैनल 1 एनालॉग वोल्टेज कमांड के लिए है। बीएनसी टी-स्प्लिटर का उपयोग करके इस सिग्नल को विभाजित करें, और फिर इसे निरंतर वर्तमान उत्तेजक इनपुट और आई / ओ बोर्ड से कनेक्ट करें ताकि कमांड वोल्टेज रिकॉर्ड किया जा सके।
- पल्सपाल आउटपुट चैनल 2 विद्युत उत्तेजना टीटीएल इवेंट मार्कर के लिए है। इसे आई / ओ बोर्ड से कनेक्ट करें ताकि प्लगइन का उपयोग करने और पोस्ट हॉक विश्लेषण के लिए उत्तेजना टीटीएल इवेंट मार्कर रिकॉर्ड किए जाएं।
- एनालॉग वोल्टेज-नियंत्रित उत्तेजक के साथ असेंबली के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
- एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक पर शक्ति जिसमें इसकी उत्तेजना आयाम एक रोटरी एन्कोडिंग डायल द्वारा नियंत्रित होता है। इस मामले में एक DS7 का उपयोग किया गया था (चित्रा 1)।
- निर्माता-आपूर्ति किए गए केबल और चुंबकीय माउंट का उपयोग करके स्टेपर मोटर कंट्रोल बोर्ड को स्टेपर मोटर से कनेक्ट करें।
- किसी भी मानक USB A से USB माइक्रो-B केबल का उपयोग करके नियंत्रण बोर्ड को सीधे कंप्यूटर से कनेक्ट करें. यूएसबी आइसोलेटर के प्रतिभागी पक्ष पर नियंत्रण बोर्ड को कनेक्ट न करें क्योंकि यह 12 वी मेन बिजली की आपूर्ति से भी जुड़ा हुआ है।
- यदि यह नियंत्रण बोर्ड का उपयोग करने वाला पहली बार है, तो GitHub से स्टेपर मोटर स्क्रिप्ट को नियंत्रण बोर्ड पर अपलोड करें; यह केवल एक बार करने की आवश्यकता है, या यदि स्टेपर मोटर स्क्रिप्ट के लिए कोई सॉफ़्टवेयर अपडेट जारी किए जाते हैं।
- निरंतर वर्तमान उत्तेजक पर उत्तेजना आयाम डायल को 0 एमए पर सेट करें। स्टेपर मोटर और उत्तेजना आयाम डायल को इंटरफ़ेस करने के लिए कस्टम माउंटिंग ब्रैकेट का उपयोग करें। ये 3 डी-मुद्रित हो सकते हैं, जो सस्ते, त्वरित और अनुकूलन योग्य माउंटिंग समाधान सक्षम बनाता है। यह देखने के लिए GitHub से परामर्श करें कि क्या पसंद के उत्तेजक के लिए एक माउंट पहले से ही डिज़ाइन किया गया है।
- स्टेपर मोटर बैरल को उत्तेजना आयाम नियंत्रण डायल से कनेक्ट करने के लिए एक कस्टम बैरल एडाप्टर का उपयोग करें। इन एडाप्टर का निर्माण ताकत और स्थायित्व कारणों के लिए धातु से किया जाना चाहिए; हालांकि, 3 डी-मुद्रित भाग भी उपयुक्त होंगे, हालांकि उन्हें नियमित रूप से प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता हो सकती है। यह देखने के लिए GitHub से परामर्श करें कि क्या एक बैरल एडाप्टर पहले से ही पसंद के उत्तेजक के लिए डिज़ाइन किया गया है।
- एक कस्टम माउंट और बैरल एडाप्टर का उपयोग करके उत्तेजक नियंत्रण डायल में नियंत्रण बोर्ड / स्टेपर मोटर उपकरण को शिथिल रूप से संलग्न करें।
नोट: सॉफ्टवेयर लॉन्च होने के बाद माउंट और बैरल एडाप्टर को बाद में कड़ा किया जाएगा और स्टेपर मोटर, स्वचालित रूप से, शून्य स्थिति में सेट हो जाएगी। - प्रोटोकॉल चरण 2.5.2-2.5.3 (आउटपुट चैनल 1 को उत्तेजक से जोड़ने के लिए माइनस कनेक्ट) में वर्णित पल्सपाल को कनेक्ट करें, क्योंकि विश्लेषण के लिए और प्लगइन को कार्य करने के लिए टीटीएल इवेंट मार्कर उत्पन्न करना अभी भी आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, आउटपुट चैनल 2 को इसे ट्रिगर करने के लिए डीएस 7 उत्तेजक से कनेक्ट करें।
- माउस त्वचा-तंत्रिका तैयारी तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
- 6 जे चूहों (चार्ल्स रिवर लेबोरेटरीज, यूके, इस अध्ययन में) को 2-4 महीने की उम्र के और दोनों लिंगों को भोजन और पानी के साथ प्रदान करें।
- सोडियम पेंटोबार्बिटल (≥200 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से एनेस्थेटिक ओवरडोज से मारने और परिसंचरण की समाप्ति की पुष्टि करने के बाद, माउस हिंद पंजे के पृष्ठीय पहलू और सफेनोस तंत्रिका से त्वचा को विच्छेदित करें, जो ज़िमर्मन एट अल .23 द्वारा वर्णित तरीकों का उपयोग करके इस क्षेत्र को आंतरिक करता है।
- कस्टम-निर्मित दोहरे-कक्ष ऐक्रेलिक स्नान (15 एमएल / मिनट छिड़काव दर, 30 एमएल मात्रा) के आधे हिस्से में 30-32 डिग्री सेल्सियस पर कार्बोजेनेटेड सिंथेटिक अंतरालीय द्रव (तालिका 1) में त्वचा-तंत्रिका तैयारी को बनाए रखें। खनिज तेल से भरे कक्ष में एक छोटे से छेद के माध्यम से तंत्रिका को पिरोएं, और पेट्रोलियम जेली के साथ सील करें। तेल एक इंसुलेटेड रिकॉर्डिंग वातावरण प्रदान करता है।
- सुपर फाइन फोर्सप्स का उपयोग करके तंत्रिका के ट्रंक से दो महीन फिलामेंट्स को दूर करें और एक द्विध्रुवीय चांदी / सिल्वर क्लोराइड रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के प्रत्येक तरफ लटकाएं।
- आरएचडी 2216 16-चैनल द्विध्रुवी य हेडस्टेज का उपयोग करके तंत्रिका संकेत को डिजिटाइज़ और बढ़ाएं, और अधिग्रहण बोर्ड का उपयोग करके इसे संसाधित करें। 300-6,000 हर्ट्ज के बैंडपास फ़िल्टर के साथ 30 kHz पर सिग्नल का नमूना लें, और जीयूआई का उपयोग करके इसे कल्पना करें।
- एक कुंद कांच की छड़ का उपयोग करके, तैयारी की त्वचा को स्ट्रोक करें। यह पुष्टि करने के लिए कि तैयारी जीवित है, कम-आयाम द्रव्यमान गतिविधि का उपयोग करें।
- मानव सी-फाइबर माइक्रोन्यूरोग्राफी करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
- प्रतिभागियों के साथ माइक्रोन्यूरोग्राफी का संचालन करें जिन्होंने लिखित सूचित सहमति प्रदान की है, जैसा कि पहले वर्णित24 है।
- प्रतिभागी को एक बिस्तर पर आराम से बैठने और तकिए के साथ सहारे बैठने के साथ, अल्ट्रासाउंड स्कैनर का उपयोग करके सतही पेरोनेल तंत्रिका की पहचान करें, और मध्य-पिंडली स्तर के आसपास पार्श्व मॉलोलस के समीपस्थ लगभग 5-10 सेमी के लक्ष्य क्षेत्र को चिह्नित करें।
- 70% अल्कोहल वाइप में 2% क्लोरहेक्सिडिन का उपयोग करके लक्ष्य क्षेत्र के आसपास की त्वचा को स्टरलाइज़ करें और मध्य-पिंडली स्तर पर इच्छित रिकॉर्डिंग साइट के पास एक बाँझ संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें।
- लक्ष्य क्षेत्र के भीतर अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के तहत सतही पेरोनेल तंत्रिका में एक बाँझ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालें।
- आरएचडी 2216 16-चैनल द्विध्रुवी य हेडस्टेज का उपयोग करके तंत्रिका संकेत को डिजिटाइज़ और बढ़ाएं, और अधिग्रहण बोर्ड का उपयोग करके इसे संसाधित करें। 300-6,000 हर्ट्ज के बैंडपास फ़िल्टर के साथ 30 kHz पर सिग्नल का नमूना लें, और जीयूआई का उपयोग करके इसे कल्पना करें।
नोट: अधिग्रहण उपकरण को 5 केवी आरएमएस अलगाव के साथ यूएसबी 3.0 आइसोलेटर द्वारा लैपटॉप से विद्युत रूप से अलग किया गया था और कस्टम-निर्मित 12 वी बैटरी पावर सप्लाई के माध्यम से संचालित किया गया था। - यांत्रिक रूप से उत्पन्न बड़े पैमाने पर गतिविधि को प्रकट करने के लिए त्वचा को धीरे से सहलाकर सफल इंट्रान्यूरल पोजिशनिंग की पुष्टि करें। इसके अतिरिक्त, प्रतिभागी आमतौर पर सफल इंट्रान्यूरल पोजिशनिंग पर पैर के डोरसोलेटरल पहलू में पेरेस्टेसिया की रिपोर्ट करते हैं।
3. सॉफ्टवेयर सेटअप और परिधीय न्यूरॉन्स की पहचान और फेनोटाइपिंग
- सॉफ्टवेयर सेट करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
- GUI खोलें (चित्र 3)। यदि स्टेपर मोटर कंट्रोल बोर्ड आपके पीसी से जुड़ा हुआ है, तो इसका पता लगाया जाएगा और खुद को शून्य स्थिति में सेट किया जाएगा। चरण 2.6.5-2.6.7 में वर्णित कस्टम माउंट और बैरल एडाप्टर को कस ें, क्योंकि उत्तेजक के उत्तेजना आयाम डायल और स्टेपर मोटर दोनों शून्य पर सेट हैं।
नोट: यदि स्टेपर मोटर और उत्तेजना आयाम डायल दोनों "शून्य" नहीं हैं, तो इसके परिणामस्वरूप स्टेपर मोटर नियंत्रण डायल को अपनी सीमा से बाहर करने की कोशिश कर सकता है, जिससे नुकसान हो सकता है। - विकल्प मेनू में, ट्रिगर चैनल का चयन करें. पल्सपाल आउटपुट चैनल 2 से विद्युत उत्तेजना टीटीएल मार्कर युक्त एडीसी चैनल चुनें।
- विकल्प मेनू में, डेटा चैनल का चयन करें, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा वाले चैनल का चयन करें।
- उत्तेजना नियंत्रण कक्ष में, स्लाइडर का उपयोग करके प्रारंभिक, न्यूनतम और अधिकतम उत्तेजना आयामों को परिभाषित करें। सुनिश्चित करें कि वर्तमान उत्तेजना 0 से ऊपर सेट है ताकि टीटीएल मार्कर उत्पन्न हों।
नोट: कुछ उत्तेजक पदार्थों में इनपुट-टू-आउटपुट स्केलिंग अनुपात होता है जो 1: 1 नहीं होता है; एक उपयुक्त उत्तेजना आयाम का चयन करते समय इस पर विचार करें। उदाहरण के लिए, निरंतर वर्तमान उत्तेजक से उच्च आउटपुट प्राप्त करने के लिए कुछ उत्तेजना प्रणालियों पर 1: 10 आउटपुट अनुपात का चयन किया जा सकता है। - उत्तेजना नियंत्रण कक्ष में, उत्तेजना निर्देशों वाली फ़ाइल लोड करने के लिए एफ पर क्लिक करें। विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल को वांछित उत्तेजना आवृत्तियों और अवधि से बने अल्पविराम-पृथक मूल्य (सीएसवी) फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत किया जाता है, जो उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोगों के लिए जटिल उत्तेजना प्रतिमान बनाने की अनुमति देता है। एक उदाहरण टेम्पलेट यहाँ उपलब्ध है: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
- उत्तेजना नियंत्रण कक्ष में, लोड किए गए उत्तेजना प्रतिमान शुरू करने के लिए > पर क्लिक करें। डिफ़ॉल्ट रूप से, एपीट्रैक निरंतर वर्तमान उत्तेजक के उत्तेजना आयाम को नियंत्रित करने के लिए अलग-अलग आयामों के 0.5 एमएस अवधि के सकारात्मक वर्ग तरंग पल्स उत्पन्न करने के लिए पल्सपाल से अनुरोध करता है।
- टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट विद्युत उत्तेजना की प्रतिक्रिया के साथ अपडेट करना शुरू कर देगा, जिसमें प्रत्येक नई उत्तेजना प्रतिक्रिया को दाईं ओर एक नए कॉलम के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा।
- GUI खोलें (चित्र 3)। यदि स्टेपर मोटर कंट्रोल बोर्ड आपके पीसी से जुड़ा हुआ है, तो इसका पता लगाया जाएगा और खुद को शून्य स्थिति में सेट किया जाएगा। चरण 2.6.5-2.6.7 में वर्णित कस्टम माउंट और बैरल एडाप्टर को कस ें, क्योंकि उत्तेजक के उत्तेजना आयाम डायल और स्टेपर मोटर दोनों शून्य पर सेट हैं।
- एकल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल की कल्पना करें और पहचानें।
- एकल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल का सफल पता लगाने के लिए, उपयुक्त छवि थ्रेसहोल्ड सेट करना महत्वपूर्ण है। टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट पैनल में, कम, पहचान और उच्च छवि थ्रेशोल्ड मानों को समायोजित करें।
- विकल्प मेनू में रंग योजना का चयन करें. WHOT (व्हाइट हॉट) मोड (डिफ़ॉल्ट) में, कम छवि सीमा के नीचे वोल्टेज काले रंग में एन्कोड किए जाते हैं। कम छवि और पहचान थ्रेसहोल्ड के बीच वोल्टेज ग्रेस्केल में एन्कोड किए गए हैं। डिटेक्शन थ्रेशोल्ड से ऊपर के वोल्टेज हरे रंग में एन्कोड किए जाते हैं, और उच्च छवि सीमा से ऊपर के वोल्टेज लाल रंग में एन्कोड किए जाते हैं।
- परिधीय न्यूरॉन्स कम उत्तेजना आवृत्तियों (<0.25 हर्ट्ज) पर निरंतर विलंबता प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं, और ये प्रतिक्रियाएं उनके चालन वेग और उत्तेजना और रिकॉर्डिंग साइटों के बीच की दूरी से निर्धारित होती हैं। उपयुक्त छवि थ्रेसहोल्ड सेट के साथ, एल्गोरिदम द्वारा पता लगाए गए थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग घटनाओं को हरे रंग में एन्कोड किया जाएगा (चित्रा 4)।
- व्यवस्थित रूप से तंत्रिका द्वारा आंतरिक त्वचा क्षेत्र के चारों ओर उत्तेजक इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित करें जिसे दर्ज किया जा रहा है, जिससे प्रत्येक साइट पर कम से कम तीन उत्तेजना घटनाओं की अनुमति मिलती है। प्रत्येक विद्युत उत्तेजना घटना के बाद एक ही समय बिंदु पर होने वाली थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग घटनाओं (हरे रंग में चिह्नित) के लिए अस्थायी रास्टर प्लॉट की निगरानी करें।
नोट: चूहों में, 5 एमए की खोज उत्तेजना का उपयोग किया गया था। मनुष्यों में, ट्रांसक्यूटेनियस इलेक्ट्रिकल सर्च उत्तेजना के आयाम को मौखिक दर्द रेटिंग के लिए टाइट किया गया था जैसे कि यह कभी भी 7/10 से अधिक नहीं था। - तीन थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग घटनाओं (ग्रीन बार) की जांच करें जो एक ही विलंबता पर और एक ही उत्तेजना स्थिति में एक पंक्ति में दिखाई देते हैं; यह एक परिधीय न्यूरॉन एक्शन क्षमता की पहचान को इंगित करता है।
- लक्ष्य न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र के सबसे विद्युत रूप से संवेदनशील बिंदु की पहचान करके उत्तेजक इलेक्ट्रोड स्थिति का अनुकूलन करें, और फिर इलेक्ट्रोड को स्थिति में ठीक करें। मानव माइक्रोन्यूरोग्राफी में इस बिंदु पर, द्विध्रुवी विद्युत उत्तेजना के लिए इंट्राडर्मल इलेक्ट्रोएक्यूपंक्चर सुइयों (0.2 मिमी व्यास) का उपयोग करने के लिए स्विच करें, चूहों में, एक कस्टम ट्रांसक्यूटेनियस उत्तेजक जांच का उपयोग किया जाता है ताकि उत्तेजना की स्थिति स्थिर हो।
- एकल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल का सफल पता लगाने के लिए, उपयुक्त छवि थ्रेसहोल्ड सेट करना महत्वपूर्ण है। टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट पैनल में, कम, पहचान और उच्च छवि थ्रेशोल्ड मानों को समायोजित करें।
- परिधीय न्यूरॉन्स का वर्गीकरण और संवेदी फेनोटाइपिंग करें।
- सिमुलेशन आयाम को मैन्युअल रूप से समायोजित करके या वांछित होने पर एपीट्रैक का उपयोग करके लक्ष्य कार्रवाई क्षमता की विद्युत सीमा का अनुमान लगाएं (चरण 4.1-4.2 में वर्णित)।
- संवेदी फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल में 0.25 हर्ट्ज की आवृत्ति पर अनुमानित विद्युत सीमा के 2 गुना पर ग्रहणशील क्षेत्र को उत्तेजित करें।
- चालन विलंबता द्वारा चालन दूरी को विभाजित करके न्यूरॉन के चालन वेग की गणना करें। सी-फाइबर को ≤2 मीटर / सेकंड के चालन वेग से पहचाना जा सकता है।
- सक्रियण के लिए यांत्रिक सीमा निर्धारित करने के लिए वॉन फ्रे फिलामेंट्स का उपयोग करके ग्रहणशील क्षेत्र को यांत्रिक रूप से उत्तेजित करें। मेकेनोसेंसेशन को वोल्टेज ट्रेस पर दिखाई देने वाली कार्रवाई क्षमता और न्यूरॉन की विलंबता में वृद्धि से पहचाना जा सकता है, अगर यह पर्याप्त बल पर सी-फाइबर है।
- न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र को गर्म करें, फिर से वोल्टेज ट्रेस पर दिखाई देने वाली कार्रवाई क्षमता और न्यूरॉन की विलंबता में वृद्धि के लिए देखें, यदि यह पर्याप्त गर्मी अनुप्रयोग पर सी-फाइबर है। अक्षीय प्रसार पर थर्मोडायनामिक प्रभाव के कारण गर्मी-असंवेदनशील न्यूरॉन्स विलंबता में कमी का प्रदर्शन करेंगे।
नोट: मानव माइक्रोन्यूरोग्राफी में, तेजी से और सटीक थर्मल नियंत्रण के लिए टीएससी -2 का उपयोग करें। माउस की तैयारी में, ग्रहणशील क्षेत्र पर रखे एल्यूमीनियम अलगाव कक्ष में गर्म या ठंडा सिंथेटिक अंतरालीय तरल पदार्थ जोड़ें ताकि आसपास के तरल पदार्थ में तेजी से गर्मी अपव्यय को प्रतिबंधित करते हुए न्यूरॉन टर्मिनलों तक पहुंच की अनुमति मिल सके। थर्मोकपल का उपयोग करके तापमान रिकॉर्ड करें। - ग्रहणशील क्षेत्र को ठंडा करें, फिर से वोल्टेज ट्रेस पर दिखाई देने वाली कार्रवाई क्षमता और न्यूरॉन की विलंबता में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए देखें, यदि यह पर्याप्त ठंडे आवेदन पर सी-फाइबर है। अक्षीय प्रसार पर थर्मोडायनामिक प्रभाव के कारण सभी न्यूरॉन्स विलंबता में वृद्धि का प्रदर्शन करेंगे, इसलिए अकेले विलंबता वृद्धि के आधार पर न्यूरॉन्स को ठंड-संवेदनशील के रूप में लेबल करने में सावधानी बरतें।
4. विलंबता और विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग
- नीचे वर्णित के रूप में विलंबता ट्रैकिंग करें।
- टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट पर सिंगल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल (ओं) की पहचान के बाद, खोज बॉक्स की स्थिति को समायोजित करने के लिए टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट के दाईं ओर ग्रे रैखिक स्लाइडर को स्थानांतरित करें।
- अस्थायी रास्टर प्लॉट के नीचे, खोज बॉक्स चौड़ाई रोटरी स्लाइडर को उपयुक्त चौड़ाई में समायोजित करें। क्षणिक शोर स्पाइक्स, अनायास फायरिंग एक्शन पोटेंशिअल, या अन्य आस-पास के निरंतर विलंबता एक्शन पोटेंशिअल की संभावना को कम करने के लिए खोज बॉक्स की चौड़ाई को संकीर्ण बनाएं, जिसे रुचि की कार्रवाई क्षमता के रूप में गलत तरीके से पहचाना जा रहा है।
- लक्षित कार्रवाई क्षमता को ट्रैक करना शुरू करने के लिए, मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल के नीचे + पर क्लिक करें। तालिका में एक नई पंक्ति जोड़ी जाएगी जिसमें लक्ष्य कार्रवाई क्षमता का विवरण शामिल है, जिसमें विलंबता स्थान, 2-10 उत्तेजनाओं पर प्रतिशत फायरिंग (विकल्प मेनू में समायोजित), और चरम आयाम का पता लगाया गया है।
- एक बार मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल में एक एक्शन पोटेंशियल जोड़े जाने के बाद, लेटेंसी ट्रैकिंग एल्गोरिदम (चित्रा 5) स्वचालित रूप से हर बाद की विद्युत उत्तेजना पर निष्पादित किया जाएगा।
- यदि टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट पर कई असतत एक्शन पोटेंशिअल दिखाई दे रहे हैं, तो उन्हें ऊपर वर्णित मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल में जोड़ें। एक साथ विलंबता ट्रैकिंग के लिए तालिका में जोड़े जा सकने वाले एक्शन पोटेंशिअल की सैद्धांतिक अधिकतम संख्या अधिकतम 32 बिट पूर्णांक मान है।
- खोज बॉक्स को उस विशेष कार्रवाई क्षमता के लिए उपयुक्त स्थिति में ले जाने के लिए मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग तालिका में ट्रैक स्पाइक बॉक्स की जाँच करें, जैसा कि विलंबता ट्रैकिंग एल्गोरिदम द्वारा निर्धारित किया गया है। यह वास्तविक समय में विलंबता ट्रैकिंग की निगरानी करने की अनुमति देगा और यह सुनिश्चित करेगा कि ट्रैकिंग अपेक्षित कार्रवाई क्षमता का पालन कर रही है। अन्य स्पाइक्स की विलंबता ट्रैकिंग पृष्ठभूमि में सामान्य रूप से जारी रहेगी।
- प्रत्येक पंक्ति के अंत में डिलीट बटन का उपयोग करके मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल से ट्रैक की गई कार्रवाई क्षमता को हटा दें।
- नीचे वर्णित के रूप में विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग करें।
- उत्तेजना नियंत्रण कक्ष में वृद्धि और ह्रास दर को 0.1 V और 0.5 V के बीच समायोजित करें। इन मूल्यों को बराबर रखें, और प्रयोग के दौरान उन्हें समायोजित न करें जब तक कि यह प्रयोगात्मक प्रतिमान का हिस्सा न हो।
- सुनिश्चित करें कि उत्तेजना आवृत्ति एक उपयुक्त दर पर सेट है, आमतौर पर 0.25-0.5 हर्ट्ज, जब तक कि उत्तेजना आवृत्ति का मॉड्यूलेशन प्रयोगात्मक प्रतिमान का हिस्सा न हो। नोसिसेप्टर फायरिंग दर बढ़ने से नोसिसेप्टर की विद्युत सीमा बदल सकती है।
- एक बार जब एक एक्शन पोटेंशिअल सफलतापूर्वक ट्रैक किया जा रहा है, तो मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल में ट्रैक थ्रेशोल्ड बॉक्स की जांच करें, जो इलेक्ट्रिकल थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग एल्गोरिदम (चित्रा 6) शुरू करेगा।
नोट: विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग केवल लक्षित कार्रवाई क्षमता पर चलाया जाता है; दरअसल, मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल में अन्य एक्शन पोटेंशियल की फायरिंग दरों को तदनुसार अपडेट किया जाएगा क्योंकि उत्तेजना आयाम बदलता है। - विद्युत सीमा के अनुमान के लिए उत्तेजना आयाम को मैन्युअल रूप से समायोजित करें; यह विद्युत सीमा निर्धारित करने के लिए प्रतीक्षा समय को कम करेगा। एक विश्वसनीय विद्युत सीमा स्थापित करने में लगने वाला समय उत्तेजना आवृत्ति, वृद्धि और ह्रास दर, और प्रारंभिक उत्तेजना से न्यूरॉन की विद्युत दहलीज तक उत्तेजना आयाम में अंतर पर निर्भर है।
- सॉफ्टवेयर न्यूरॉन्स की विद्युत सीमा के अनुमान के लिए एक अप-डाउन विधि का उपयोग करता है। मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल में, फायरिंग दर 2-10 पिछले उत्तेजनाओं (विकल्प मेनू में चयनित) पर निर्धारित की जाती है। विचार की जाने वाली उत्तेजना घटनाओं की संख्या का चयन करें; एक उच्च संख्या थ्रेशोल्ड अनुमान की विश्वसनीयता में वृद्धि करेगी लेकिन इसे प्राप्त करने में अधिक समय लगेगा।
- मानव माइक्रोन्यूरोग्राफी के दौरान, अत्यधिक प्रतिभागी असुविधा को रोकने के लिए विद्युत उत्तेजनाओं की दर्दनाकता की निगरानी करना महत्वपूर्ण है; नोसिसेप्टर के अध्ययन के दौरान कुछ असुविधा अपरिहार्य है, विशेष रूप से चुप / सोते हुए सी-फाइबर की। नियमित रूप से दर्द रेटिंग के लिए पूछें, जबकि विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग के दौरान उत्तेजना आयाम बढ़ जाता है और प्रतिभागी के अनुरोध पर इसे अलग करने के लिए निरंतर वर्तमान उत्तेजक के पास रहता है।
नोट: वैकल्पिक रूप से, उत्तेजना नियंत्रण कक्ष में [] बटन पर क्लिक करके उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के माध्यम से विद्युत उत्तेजना को अलग किया जा सकता है। - 50% की फायरिंग दर इंगित करती है कि अनुमानित विद्युत सीमा निर्धारित की गई है।
- विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग करते समय, ग्रहणशील क्षेत्र में एक प्रयोगात्मक हेरफेर लागू करें, जैसे तापमान या दवा जोड़तोड़। नोसिसेप्टर की विद्युत दहलीज पर इन जोड़तोड़ के प्रभावों को ट्रैक किया जाएगा।
नोट: प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद एक नई नोसिसेप्टर सीमा की पहचान करने के लिए पर्याप्त समय दें।
Representative Results
एक प्रयोग को नियंत्रित करने के लिए काम करने वाले सॉफ़्टवेयर का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 7 में दिखाया गया है। यह एकल नोसिसेप्टर की विद्युत सीमा को प्रभावी ढंग से खोजने के लिए एक अप-डाउन विधि का उपयोग करके उत्तेजना आयाम को पुन: समायोजित करता है। पहली बार, हम माइक्रोन्यूरोग्राफी (चित्रा 7 ए) के दौरान मनुष्यों में वास्तविक समय एकल-न्यूरॉन विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम एक माउस ए-फाइबर (चित्रा 7 बी) में विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग दिखाते हैं। थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग द्वारा एक्शन पोटेंशिअल की पहचान, जैसा कि यहां उपयोग किया गया है, समय के साथ विद्युत थ्रेसहोल्ड को ट्रैक करने के लिए पर्याप्त है। हम उपयोगकर्ताओं को अपनी रिकॉर्डिंग के दौरान विद्युत शोर को कम करने के लिए कदम उठाने की सलाह देते हैं, जैसे कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार के लिए फैराडे पिंजरे और बैंडपास फिल्टर का उपयोग करके।
यह प्रदर्शित करने के लिए कि विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग का उपयोग मनुष्यों में नोसिसेप्टर उत्तेजना में परिवर्तन के उपाय के रूप में किया जा सकता है, एक कदम हीटिंग प्रतिमान के दौरान विद्युत दहलीज की ट्रैकिंग की गई थी (चित्रा 8)। नोसिसेप्टर टर्मिनलों के तापमान में वृद्धि ने एक कार्रवाई क्षमता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक विद्युत उत्तेजना प्रवाह को कम कर दिया, जो नोसिसेप्टर उत्तेजना में वृद्धि को दर्शाता है (चित्रा 8 सी)। यह संभवतः सी-फाइबर नोसिसेप्टर14 में व्यक्त गर्मी-संवेदनशील आयन चैनलों द्वारा रिसेप्टर क्षमता की पीढ़ी के कारण हुआ था। उच्चतम तापमान चरण में, 44 डिग्री सेल्सियस, थर्मल रूप से उत्पन्न कार्रवाई क्षमता प्राप्त की गई (चित्रा 8 ए, उत्तेजना संख्या 86-96)। यह विद्युत सीमा में वृद्धि का कारण बनता है क्योंकि उच्च आवृत्ति निर्वहन के बाद नोसिसेप्टर दुर्दम्य अवस्था में हो सकता है। जैसा कि अपेक्षित था, तापमान बढ़ने के साथ ट्रैक की गई कार्रवाई क्षमता की विलंबता कम हो गई। यह चालन मशीनरी पर थर्मोडायनामिक प्रभाव के कारण माना जाता है, जो सी-फाइबर के चालन वेग को बढ़ाता है। यह सी-फाइबर फ्लिप-फ्लॉप (चित्रा 8 बी, उत्तेजना संख्या 47-54) का भी प्रदर्शन कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप निम्नलिखित विद्युत उत्तेजना को आयाम में गलती से बढ़ाया जा सकता है यदि कार्रवाई क्षमता एल्गोरिदम खोज विंडो के बाहर आती है।
चित्रा 1: कृन्तकों और मनुष्यों में एपीट्रैक के साथ नोसिसेप्टर इलेक्ट्रिकल थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग के लिए आवश्यक उपकरण सेटअप और केबल कनेक्शन का एक योजनाबद्ध। उत्तेजना आयाम नियंत्रण के दो अलग-अलग तरीकों पर ध्यान दें: हमारे मानव सेटअप में मैन्युअल रूप से समायोजित उत्तेजक के लिए एक स्टेपर मोटर, और हमारे कृंतक सेटअप में इनपुट वोल्टेज-नियंत्रित उत्तेजक के लिए एक पल्सपाल। (1) एक पीसी (विंडोज, मैक, या लिनक्स) ओपन एफिज़ प्लेटफॉर्म के लिए प्लगइन चला रहा है। (2) एक स्टेपर मोटर जो डीएस 7 पर उत्तेजना आयाम डायल संचालित करता है। (3) मनुष्यों में उपयोग के लिए अनुमोदित एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक; यहां हमने डीएस 7 का उपयोग किया। (4) एक यूएसबी 3.0 ऑप्टोइसोलेटर, जो पीसी से मानव प्रतिभागी को अलग करता है (वैकल्पिक, केवल मानव अनुसंधान के लिए आवश्यक)। (5) एक पल्सपाल वी 2 पल्स जनरेटर, जो टीटीएल टाइम स्टैम्प (आउटपुट चैनल 2) और अनुरोधित उत्तेजना आयाम (आउटपुट चैनल 1) के अनुरूप वोल्टेज चरण उत्पन्न करता है। (6) जानवरों में उपयोग के लिए एक निरंतर वर्तमान उत्तेजक; यहां, हमने डीएस 4 का उपयोग किया। (7) सिस्टम के लिए एक डीसी बिजली की आपूर्ति (कृंतक सेटअप के लिए उपयोग की जाने वाली मुख्य डीसी बिजली की आपूर्ति और मानव सेटअप के लिए उपयोग की जाने वाली बैटरी डीसी बिजली की आपूर्ति)। (8) एक अधिग्रहण बोर्ड। (9) संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए बीएनसी समाक्षीय केबलों को जोड़ने के लिए एक आई / ओ बोर्ड, जैसे थर्मोकपल आउटपुट और टीटीएल मार्कर। (10) माउस त्वचा-तंत्रिका तैयारी नोसिसेप्टर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग से गुजर रही है। (11) सतही पेरोनियल तंत्रिका में सी-फाइबर से माइक्रोन्यूरोग्राफी रिकॉर्डिंग से गुजरने वाला एक मानव प्रतिभागी। (12) रिकॉर्डिंग के अधिग्रहण और डिजिटलीकरण के लिए एक इंटान आरएचडी 2216 हेडस्टेज। (13) एक इंटन इलेक्ट्रोड एडाप्टर बोर्ड, जिससे रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड जुड़े होते हैं और जो सिग्नल को आरएचडी 2216 हेडस्टेज पर पारित करने की अनुमति देता है। (14) एक थर्मल उत्तेजना प्रणाली जो बीएनसी समाक्षीय कनेक्शन के माध्यम से तापमान का उत्पादन कर सकती है। (15) एक 3.3 वी बैटरी संचालित बटन / फुट पेडल जिसका उपयोग यांत्रिक उत्तेजना घटनाओं और दवा अनुप्रयोगों को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: टेम्पलेट सिग्नल श्रृंखला। लाल तीर आई / ओ बोर्ड से एडीसी इनपुट को सक्षम करने के लिए बटन को इंगित करता है। पीला तीर ओपन एफिज़ फ़ाइल प्रारूप का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू को इंगित करता है। हरा तीर प्ले और रिकॉर्ड बटन को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: ग्राफिकल यूजर इंटरफ़ेस। जीयूआई में चार मुख्य घटक होते हैं। (1) डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और प्लॉट को नियंत्रित करने से जुड़ी सेटिंग्स के लिए टेम्पोरल रास्टर प्लॉट पैनल (हरा)। धीरे-धीरे गतिविधि-निर्भर धीमापन दिखाने वाली एक निरंतर विलंबता प्रतिक्रिया हरे तीर द्वारा इंगित की जाती है। (2) उत्तेजना आयाम मापदंडों को सेट करने और उत्तेजना प्रतिमान स्क्रिप्ट लोड करने के लिए उत्तेजना नियंत्रण कक्ष (पीला)। (3) मल्टी-यूनिट ट्रैकिंग टेबल (नीला) ट्रैकिंग और इलेक्ट्रिकल थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग को ट्रैक करने और सक्रिय करने के लिए एक्शन पोटेंशिअल जोड़ने के लिए। (4) डेटा और टीटीएल ट्रिगर्स के लिए रंग शैलियों और इनपुट चैनल का चयन करने के लिए विकल्प मेनू। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एपीट्रैक का उपयोग करके एक अस्थायी रास्टर प्लॉट पर वास्तविक समय डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के माध्यम से निरंतर विलंबता कार्रवाई क्षमता की पहचान की सुविधा। यह एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात उदाहरण है। टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट में प्रस्तुत डेटा माइक्रोन्यूरोग्राफी के दौरान सतही पेरोनेल तंत्रिका से मानव सी-फाइबर रिकॉर्डिंग से हैं। वोल्टेज ट्रेस ओपन एफिज़ के भीतर ऑसिलोस्कोप की तरह एलएफपी व्यूअर प्लगइन है। APrack उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्लगइन का ग्राफिकल यूजर इंटरफेस है। ट्रैक की गई कार्रवाई क्षमता को हरे तीर द्वारा इंगित किया जाता है, और टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट की सीमा पर गोलाकार स्लाइडर खोज बॉक्स की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए है जहां एल्गोरिदम थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग घटनाओं की खोज करेंगे। वोल्टेज ट्रेस पर विद्युत उत्तेजना विरूपण साक्ष्य नीले रंग में चिह्नित है। एनालॉग वोल्टेज कमांड के उत्तेजना आयाम को लाल रंग में इंगित किया गया है; ध्यान दें कि यह उत्तेजक पर सेट स्केलिंग कारक के आधार पर उत्तेजना वर्तमान आयाम के समान नहीं हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: विलंबता ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। सरल शब्दों में, यदि थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग द्वारा एक कार्रवाई क्षमता का पता लगाया जाता है, तो खोज बॉक्स पीक वोल्टेज के समय खुद को केंद्र में रखने के लिए अपनी स्थिति को समायोजित करेगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। सरल शब्दों में, यदि थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग द्वारा एक कार्रवाई क्षमता का पता लगाया जाता है, तो उत्तेजना आयाम ह्रास दर से कम हो जाएगा। यदि कोई कार्रवाई क्षमता का पता नहीं लगाया जाता है, तो उत्तेजना आयाम को वृद्धि दर से बढ़ाया जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: 0.25 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्ति पर एकल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल की स्वचालित विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग । (ए) एक माइक्रोन्यूरोग्राफी प्रयोग के दौरान सतही पेरोनियल तंत्रिका के मानव सी-फाइबर के अनुक्रमिक निशान। (बी) त्वचा-तंत्रिका तैयारी के दौरान सेफेनोस तंत्रिका के माउस ए-फाइबर के अनुक्रमिक निशान ने फाइबर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को छेड़ दिया। एक क्रिया क्षमता की पहचान होने पर निशान लाल रंग के थे, जिसके परिणामस्वरूप उत्तेजना आयाम में कमी आई थी। सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम प्रभावी रूप से फायरिंग की 50% संभावना के लिए आवश्यक उत्तेजना आयाम का पता लगाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: मानव सी-फाइबर नोसिसेप्टर की थर्मल उत्तेजना के दौरान 0.25 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्ति पर विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग। वाई-अक्ष प्रतिमान की शुरुआत से उत्तेजना संख्या को एन्कोड करता है। (ए) विद्युत उत्तेजना के बाद 4,000 एमएस के लिए वोल्टेज ट्रेस, जिसमें थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग घटनाओं को लाल रंग में चिह्नित किया गया है। (बी) ए से वोल्टेज ट्रेस ट्रैक की गई कार्रवाई क्षमता के चारों ओर ज़ूम हो गया। ट्रैक की गई कार्रवाई क्षमता का पता चलने पर निशान लाल रंग के थे। ऊर्ध्वाधर नीली रेखा ट्रैक की गई इकाई की आधारभूत विलंबता है। (सी) एपीटीट्रैक द्वारा कमांड की गई उत्तेजना प्रवाह। ऊर्ध्वाधर नीली रेखा आधारभूत विद्युत दहलीज है। (डी) ग्रहणशील क्षेत्र टीसीएस -2 थर्मल उत्तेजक जांच तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| यौगिक | एकाग्रता |
| NaCl | 107.8 mM |
| NaHCO3 | 26.2 mM |
| KCl | 3.5 mM |
| NaH2PO4 | 1.67 mM |
| CaCl2 | 1.53 mM |
| MgSO4 | 0.69 mM |
| सोडियम ग्लूकोनेट | 9.64 mM |
| शर्करा | 7.6 mM |
| ग्लूकोज़ | 5.55 mM |
तालिका 1: माउस त्वचा-तंत्रिका तैयारी के लिए सिंथेटिक अंतरालीय द्रव की सामग्री23.
Discussion
APTrack ओपन Ephys प्लेटफ़ॉर्म के साथ उपयोग के लिए एक सॉफ्टवेयर प्लगइन है। हमने इस मंच को चुना है क्योंकि यह ओपन-सोर्स, लचीला और लागू करने के लिए सस्ता है। निरंतर वर्तमान उत्तेजक की लागत को शामिल नहीं करते हुए, प्लगइन का उपयोग शुरू करने के लिए आवश्यक सभी उपकरण लेखन के समय लगभग $ 5,000 अमरीकी डालर के लिए खरीदे जा सकते हैं। हमें उम्मीद है कि यह शोधकर्ताओं को अपने परिधीय तंत्रिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययनों में एपीट्रैक को अधिक आसानी से लागू करने में सक्षम करेगा। इसके अलावा, शोधकर्ता अपनी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए सॉफ्टवेयर को स्वतंत्र रूप से संशोधित कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इस उपकरण ने मनुष्यों में पहली बार एकल सी-फाइबर नोसिसेप्टर की विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग की अनुमति दी है।
सिग्नल-टू-शोर अनुपात जितना अधिक होगा, एल्गोरिदम उतना ही बेहतर कार्रवाई क्षमता की पहचान कर सकते हैं। माइक्रोन्यूरोग्राफी के दौरान सिग्नल-टू-शोर अनुपात हमारी अधिकांश रिकॉर्डिंग में पर्याप्त था, लेकिन उपयोगकर्ताओं को समय के साथ सिग्नल क्षरण के जोखिम के प्रति सतर्क रहना चाहिए। यह लंबे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि यदि ट्रैक की गई कार्रवाई क्षमता का आयाम पहचान सीमा से नीचे गिर जाता है, तो उत्तेजना आयाम गलती से बढ़ जाएगा; प्लगइन की निगरानी करने वाले प्रयोगकर्ताओं द्वारा इसे कम किया जा सकता है और फिर यदि आवश्यक हो तो सेटिंग्स को समायोजित किया जा सकता है। बैंडपास फ़िल्टरिंग के साथ सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार होता है, लेकिन बड़े क्षणिकों को अभी भी खोज बॉक्स टाइम विंडो के दौरान पहुंचने पर एक्शन पोटेंशिअल के रूप में गलत पहचाना जा सकता है। एक क्रिया क्षमता के रूप में क्षणिक शोर की गलत पहचान करने के जोखिम को समय विंडो को संकीर्ण करके कम किया जा सकता है जिसके दौरान प्लगइन कार्रवाई क्षमता की खोज करता है और थ्रेशोल्ड सेटिंग्स को अनुकूलित करता है। हालांकि, अभी भी ऐसी स्थितियां हैं जो प्लगइन के प्रदर्शन में बाधा डाल सकती हैं। सहज गतिविधि कठिनाइयों का कारण बन सकती है यदि बड़े-आयाम कार्रवाई क्षमता एल्गोरिथ्म की खोज बॉक्स विंडो के भीतर आती है, क्योंकि उन्हें लक्ष्य कार्रवाई क्षमता के रूप में गलत पहचाना जाएगा। इसके अतिरिक्त, रुचि के न्यूरॉन में सहज गतिविधि का मतलब यह हो सकता है कि विद्युत उत्तेजना अपनी दुर्दम्य अवधि के दौरान गिरती है, जिससे कार्रवाई क्षमता उत्पन्न करने में विफलता होती है। सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में कठिनाइयां तब भी उत्पन्न हो सकती हैं जब प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स फ्लिप-फ्लॉप प्रदर्शित करते हैं, जिससे एकल न्यूरॉन की वैकल्पिक टर्मिनल शाखाएं उत्तेजित होती हैं, इस प्रकार उत्पन्न क्रिया क्षमता में दो (या अधिक) बेसलाइन लेटेंसी होती हैं जो पारस्परिक रूप से अनन्यहोती हैं। उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ फ्लिप-फ्लॉप का प्रदर्शन करने वाले न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के दौरान, हमने न्यूरॉन द्वारा प्रदर्शित सभी संभावित चालन वेगों को समाहित करने के लिए खोज बॉक्स की चौड़ाई बढ़ाकर विलंबता और विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया। हालांकि, विद्युत सीमा न्यूरॉन की टर्मिनल शाखा के आधार पर भिन्न हो सकती है जो उत्तेजित हो रही है, जो विद्युत उत्तेजना की साइट से वैकल्पिक नोसिसेप्टर टर्मिनलों तक की दूरी में अंतर के कारण होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, टेम्पलेट मिलान को शामिल करने के लिए कार्रवाई संभावित पहचान प्रक्रिया पर अतिरिक्त काम संभव है और इसे इस सॉफ़्टवेयर में एकीकृत किया जा सकता है। बैंड-स्टॉप या अनुकूली शोर निस्पंदन के लिए जीयूआई प्लगइन्स का उपयोग सिग्नल श्रृंखला में एपीट्रैक के अपस्ट्रीम में भी किया जा सकता है।
हम विद्युत दहलीज को विद्युत उत्तेजनाओं की उपयोगकर्ता-परिभाषित संख्या पर 50% समय की कार्रवाई क्षमता प्राप्त करने के लिए आवश्यक वर्तमान मानते हैं, आमतौर पर 2-10। विद्युत उत्तेजना की आकृति विज्ञान 0.5 एमएस और सकारात्मक, वर्ग तरंग दालें हैं। यह रिओबेस का निर्धारण करने के समान नहीं है, जो आमतौर पर न्यूरोनल उत्तेजना का एक उपाय है। रिओबेस निर्धारित करने के लिए प्लगइन को अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, हमने एक सरल उपाय का पीछा किया, क्योंकि उत्तेजना में गतिशील परिवर्तन, जैसे कि हीटिंग के दौरान होने वाले परिकल्पित, हमारे विद्युत थ्रेशोल्ड अनुमान की तुलना में रिओबेस परिवर्तनों के साथ मात्रा निर्धारित करना अधिक कठिन होगा।
इस सॉफ्टवेयर का उपयोग मानव और कृंतक दोनों प्रयोगों में किया जा सकता है। यह विद्युत उत्तेजना प्रणालियों के लिए लचीले समर्थन से संभव हो गया है। सॉफ्टवेयर किसी भी उत्तेजक के साथ काम करेगा जो एनालॉग कमांड वोल्टेज को स्वीकार करता है या मैन्युअल रूप से स्टेपर मोटर के साथ इंटरफेस किया जा सकता है। माइक्रोन्यूरोग्राफी के लिए, हमने इसे सीई-चिह्नित निरंतर वर्तमान उत्तेजक के साथ इस्तेमाल किया जो मानव अनुसंधान में उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था और इसकी उत्तेजना को डायल द्वारा नियंत्रित किया गया था। एनालॉग वोल्टेज कमांड को स्वीकार करने वाले उत्तेजक शोर हो सकते हैं क्योंकि वे उत्तेजनाओं के बीच सर्किट को डिस्कनेक्ट नहीं करते हैं, जिसका अर्थ है कि एनालॉग इनपुट पर कोई भी 50/60 हर्ट्ज ह्यूम या शोर रिकॉर्डिंग में प्रेषित किया जाएगा। एक उत्तेजक जिसे सर्किट को जोड़ने के लिए एक अतिरिक्त टीएलएल ट्रिगर सिग्नल की आवश्यकता होती है, जिससे एनालॉग वोल्टेज इनपुट के अनुरूप करंट पर उत्तेजना उत्पन्न होती है, प्लगइन के साथ उपयोग के लिए आदर्श है। यह शोर को उत्तेजनाओं के बीच रिकॉर्डिंग में प्रेषित होने से रोकता है।
सॉफ्टवेयर विद्युत सीमा का अनुमान लगाने के लिए एक सरल अप-डाउन विधि का उपयोग करता है। इसका उपयोगकई दशकों से मनोचिकित्सा परीक्षणों में किया गया है। अप-डाउन विधि के अनुरूप, उत्तेजना आयाम को संशोधित करने के लिए विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग एल्गोरिदम केवल अगली उत्तेजना के आयाम की गणना करते समय पिछले उत्तेजना के आयाम और प्रतिक्रिया पर विचार करता है। इसका मतलब यह है कि उत्तेजना आयाम वास्तविक विद्युत सीमा के चारों ओर घूमेगा, इस प्रकार 50% फायरिंग दर का उत्पादन करेगा, यह मानते हुए कि दहलीज स्थिर है। वेतन वृद्धि या ह्रास का न्यूनतम आकार 0.01 वी है; यह 0.01 एमए के बराबर है, यह मानते हुए कि उत्तेजक में 1 वी: 1 एमए इनपुट-टू-आउटपुट अनुपात है और इस छोटे से चरण परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन है। प्लगइन हर बार लक्ष्य कार्रवाई क्षमता की विद्युत सीमा के लाइव अनुमान को अपडेट करेगा जब यह पिछले उत्तेजनाओं (2-10) की उपयोगकर्ता-परिभाषित संख्या पर 50% फायरिंग दर तक पहुंच ता है। पोस्ट हॉक, हम विद्युत सीमा का अनुमान लगाने के लिए पिछले 2-10 उत्तेजनाओं में उत्तेजना आयाम के रोलिंग औसत का उपयोग करने की सलाह देते हैं, और यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह अनुमान केवल तभी सटीक होगा जब फायरिंग दर 50% पर अपेक्षाकृत स्थिर हो। विद्युत दहलीज के लाइव और पोस्ट-हॉक दोनों अनुमानों में, संकल्प, विश्वसनीयता और विचार करने के लिए समय का संतुलन है। छोटी वृद्धि और ह्रास चरणों का उपयोग करने से विद्युत थ्रेशोल्ड अनुमान की सटीकता में वृद्धि होगी, लेकिन शुरू में नई विद्युत सीमा को खोजने और गड़बड़ी के बाद लगने वाले समय में वृद्धि होगी। पिछली उत्तेजनाओं की अधिक संख्या पर विद्युत सीमा की गणना बेहतर विश्वसनीयता प्रदान करेगी लेकिन एक सटीक अनुमान तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी।
एपीट्रैक को परिधीय तंत्रिका रिकॉर्डिंग में उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था, विशेष रूप से प्रयोगात्मक और पैथोलॉजिकल गड़बड़ी के दौरान सी-फाइबर की विद्युत थ्रेसहोल्ड को ट्रैक करने के लिए जहां कार्रवाई संभावित विलंबता अंतर्निहित न्यूरोनल गतिविधि के आधार पर भिन्न हो सकती है। यह विधि न केवल अक्षीय उत्तेजना की जांच को सक्षम करेगी, बल्कि स्वस्थ स्वयंसेवकों और रोगियों में नोसिसेप्टर जनरेटर क्षमता की भी जांच करेगी। हम उम्मीद करते हैं कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अन्य क्षेत्र किसी भी प्रयोग में उपयोग के लिए इस उपकरण को अपना सकते हैं और अनुकूलित कर सकते हैं जिसके लिए उत्तेजना-लॉक गतिविधि की विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, इसे आसानी से एपीट्रैक से संचालित हल्की दालों के साथ ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्लगइन ओपन-सोर्स है और GPLv3 लाइसेंस के तहत शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध है। यह ओपन एफिज़ प्लेटफॉर्म पर बनाया गया है, जो एक अनुकूलनीय, कम लागत वाला, ओपन-सोर्स डेटा अधिग्रहण प्रणाली है। प्लगइन कार्रवाई संभावित जानकारी निकालने और अतिरिक्त उपयोगकर्ता इंटरफेस या अनुकूलनप्रतिमान प्रदान करने के लिए डाउनस्ट्रीम प्लगइन्स के लिए अतिरिक्त हुक प्रदान करता है। प्लगइन वास्तविक समय में एक्शन पोटेंशिअल के विज़ुअलाइज़ेशन और लेटेंसी ट्रैकिंग के लिए एक सरल उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्रदान करता है। यह पिछले डेटा को वापस भी चला सकता है और अस्थायी रास्टर प्लॉट का उपयोग करके उन्हें कल्पना कर सकता है। इसके अलावा, यह पिछले डेटा के प्लेबैक के दौरान विलंबता ट्रैकिंग भी कर सकता है। जबकि वास्तविक समय विलंबता ट्रैकिंग के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं, वे ओपन-सोर्स नहीं हैं और विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग26,27 नहीं कर सकते हैं। एपीट्रैक को वोल्टेज निशान से निरंतर विलंबता कार्रवाई क्षमता की पहचान करने के पारंपरिक तरीकों पर एक फायदा है क्योंकि यह डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक अस्थायी रास्टर प्लॉट का उपयोग करता है। इसके अलावा, कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ प्रयोगों में इसका उपयोग करने के हमारे अनुभवों ने संकेत दिया है कि टेम्पोरल रैस्टर प्लॉट विज़ुअलाइज़ेशन विधि निरंतर विलंबता कार्रवाई क्षमता की पहचान करने की अनुमति देती है जो अन्यथा छूट गई हो सकती है।
होल-नर्व थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग अक्षीय उत्तेजनाका आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। कृंतक सी-फाइबर में एकल-न्यूरॉन विद्युत थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग का उपयोग पहले नोसिसेप्टर उत्तेजना14 को निर्धारित करने के लिए किया गया है, और मनुष्यों में इसकी उपयोगिता10,11 मान्यता प्राप्त है; हालांकि, अब तक, यह संभव नहीं था। हम कृंतक और मानव परिधीय तंत्रिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन दोनों में एकल नोसिसेप्टर उत्तेजना को सीधे मापने के लिए एक नया, ओपन-सोर्स टूल प्रदान करते हैं। एपीट्रैक पहली बार मनुष्यों में एकल-न्यूरॉन एक्शन पोटेंशिअल के वास्तविक समय, ओपन-सोर्स, इलेक्ट्रिकल थ्रेशोल्ड ट्रैकिंग को सक्षम बनाता है। हम उम्मीद करते हैं कि यह कृन्तकों और मनुष्यों के बीच नोसिसेप्टर्स के ट्रांसलेशनल अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा।
Disclosures
जीडब्ल्यूटीएन ब्रिस्टल विश्वविद्यालय और एली लिली एंड कंपनी (बीबी / टी 508342/1) के साथ एक बीबीएसआरसी सहयोगी प्रशिक्षण साझेदारी डॉक्टरेट स्टूडेंटशिप है। ए.पी.एन. एली लिली एंड कंपनी का वर्तमान कर्मचारी है और इस कंपनी में स्टॉक का मालिक हो सकता है।
Acknowledgments
हम अपने फंडर्स को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं: एकेडमी ऑफ मेडिकल साइंसेज (जेपीडी, एईपी), बनाम गठिया (जेपीडी, एईपी), जीन गोल्डिंग इंस्टीट्यूट सीडकॉर्न ग्रांट (जेपीडी, एईपी, जीडब्ल्यू, एसीएस, एमएमपी), और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद सहयोगी प्रशिक्षण साझेदारी डॉक्टरेट छात्र के साथ एली लिली (जीडब्ल्यूटी)। हम APrack के विकास में सभी योगदानकर्ताओं को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम अपने स्वयंसेवकों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने माइक्रोन्यूरोग्राफी प्रयोगों में भाग लिया और हमारे रोगी और सार्वजनिक भागीदारी और सगाई सहयोगियों को उनके अमूल्य योगदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC Power Supply | NA | NA | To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators. |
| 36 Pin Electrode Adapter Board | Intan Technology | C3410 | APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021. |
| APTrack Plugin | NA | NA | https://github.com/Microneurography/APTrack |
| Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode | Custom | NA | Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Concentric Stimulating Electrode | World Precision Instruments | SNE-100 | For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode | Custom | NA | For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography. |
| BNC T Splitter (1+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter. |
| BNC to BNC cables (3+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC cables. |
| C6H11NaO7 | Merck | S2054 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| CaCl2 | Merck | C5670 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Digitimer DS4 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS4 | Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. |
| Digitimer DS7 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS7A | Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. |
| Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes | Harmony Medical | NA | For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0450/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| HDMI Cable | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board. |
| KCl | Merck | P9541 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| MgSO4 | Acros Organics | 213115000 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Mineral Oil | Merck | 330779 | Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| NaCl | Merck | S9888 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S6014 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S0751 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Open Ephys Acquisition Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022. |
| Open Ephys Graphical User Interface | Open Ephys | NA | https://github.com/open-ephys/plugin-GUI |
| Open Ephys I/O Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022. |
| PulsePal V2 | Sanworks | 1102 | APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly. |
| RHD 6ft SPI Cable | Intan Technology | C3206 | APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021 |
| RHD2216 16ch Bipolar Headstage | Intan Technology | C3313 | APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8560/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| TCS-II Thermal Stimulator | QST.Lab | NA | For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography. |
| Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) | FHC | 30085 | For microneurography recordings. 35mm. |
| Ultrasound Scanner iQ+ | Butterfly Network | NA | For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography. |
| USB 3.0 5kV RMS Isolation | Inota Technology | 7055-D | For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022. |
| USB-A to micro USB-B cable (2) | NA | NA | APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. |
| uStepper S-lite + NEMA17 motor | uStepper | NA | To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022. |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 | For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors. |
References
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