Summary
В этой статье описывается протокол, позволяющий упростить процесс и сделать приготовление аутологичной кондиционированной сыворотки (ОКС) менее дорогим. Никаких специальных шприцев или стеклянных шариков с поверхностным покрытием не требуется. Кроме того, модифицированная ОКС (mACS) имеет конкурентные преимущества перед обычной аутологичной сывороткой при заживлении ран роговицы мышиных глаз ex vivo.
Abstract
В последние десятилетия местная терапия, полученная из крови человека, была благом для клиницистов. Аутологичная сыворотка (AS) и обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) обогащены эпителиотропными факторами роста, которые необходимы для заживления ран роговицы. В отличие от AS, PRP основана на системе дифференциального центрифугирования, что дает больше тромбоцитарных факторов роста. Аутологичная кондиционированная сыворотка (ОКС) не только сохраняет препарат АС и PRP, но и фокусируется на иммуномодулирующих свойствах, которые важны при воспалительных заболеваниях.
Отсутствие стандартизированных протоколов и высокие затраты на подготовку являются ограничениями для клинического применения ОКС. Этот видеоэксперимент демонстрирует стандартную операционную процедуру приготовления глазных капель модифицированной аутологичной кондиционированной сыворотки (mACS). Во-первых, глицерин добавляли в гепариновые шприцы в качестве стабилизатора клеток крови во время гипоксической инкубации. Для активации клеток крови была начата 4-часовая инкубация при 37 ° C. Затем образцы крови центрифугировали при 3 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. После фильтрации надосадочной жидкости через фильтр 0,22 мкм глазные капли mACS были полностью приготовлены.
Предварительная проверка терапевтического эффекта mACS показала, что он может иметь конкурентные преимущества перед обычным АС при заживлении ран роговицы в глазах мышей ex vivo . АС, использованная в этом исследовании, была подготовлена в соответствии с опубликованными исследованиями и клинической практикой в нашей больнице. Таким образом, эффективность mACS при заболеваниях глазной поверхности может быть оценена в будущих исследованиях с помощью исследований in vivo на животных и клинических испытаний.
Introduction
Терапевтические эффекты аутологичной сыворотки (АС) при заболеваниях сухого глаза были впервые зарегистрированы в 1980-х годах Fox et al.1. Считается, что как смазывающее свойство, так и основные эпителиотропные биохимические компоненты АС, имитирующие естественные слезы, способствуют пролиферации эпителиальных клеток роговицы. За последние десятилетия на этой основе было проведено несколько исследований. Трофические компоненты включают эпидермальный фактор роста (EGF), витамин А, трансформирующий фактор роста β (TGF-β) и другие цитокины. Интересно, что сыворотка богата TGF-β и витамином А, которые, как полагают, играют ключевую роль в пролиферации эпидермиса 2,3,4,5. Кроме того, при лечении пациентов с заболеваниями глазной поверхности несколько исследований показали некоторые преимущества глазных капель АС в исходах, сообщаемых пациентами, других объективных параметрахсухого глаза 6,7 и микроскопических данных, таких как плотность клеток8. Метааналитические исследования показали, что при лечении глазными каплями АС могут быть некоторые преимущества в улучшении синдромов пациентов, но долгосрочные результаты и наблюдения по-прежнему отсутствуют 9,10.
В отличие от АС, обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) получается путем добавления антикоагулянта во время приготовления с дальнейшим дифференциальным центрифугированием и химической активацией тромбоцитов. По сравнению с АС, в PRP присутствуют многочисленные химические вещества и факторы роста, такие как TGF-β, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и EGF. Он также применялся к заболеваниям глазной поверхности с клиническими преимуществами в облегчении симптомов11.
Перекрестная связь между дефектами эпителия и воспалением сложна. Примечательно, что иммунопатофизиология является еще одним важным вопросом при заболеваниях глазной поверхности. Считается, что провоспалительные цитокины, такие как IL-1β и ИФН-γ, являются ключевыми медиаторами в воспалительных каскадах12. Таким образом, открываются новые пути лечения, основанные на понимании иммунного механизма. Стратегии остановки этого воспалительного процесса, включая выработку антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra) и других противовоспалительных цитокинов, также могут играть важную роль при заболеваниях глазной поверхности13,14,15.
С 1998 года Orthokine, коммерциализированная аутологичная кондиционированная сыворотка (ACS), клинически используется у ортопедических пациентов, страдающих остеоартритом (ОА), ревматоидным артритом (РА) и заболеваниями позвоночника13. По сравнению с АС и PRP, обработка стеклянными шариками с химическим покрытием и гипоксическая инкубация для активации моноцитов являются специфическими особенностями ACS16. Теоретически можно секретировать больше противовоспалительных факторов путем добавления стресса выживания к клеткам, что приводит к более высокой концентрации основных иммуномодулирующих компонентов, включая IL-1Ra. Также сообщалось об улучшении терапевтических преимуществ ОКС при ОА по сравнению с АС17. Заболевания глазной поверхности в некоторых отношениях имеют сходную иммунную подоплеку с ортопедическими воспалительными заболеваниями. Таким образом, основываясь на успешных результатах терапии крови человека в ортопедической области, ОКС может иметь преимущества перед традиционными методами лечения в клинической практике по эпителиотропным и иммуномодулирующим свойствам. Несмотря на то, что ОКС широко используется при ортопедических воспалительных заболеваниях, его клиническое применение в офтальмологии все еще нуждается в изучении, что может быть затруднено его высокой стоимостью, отсутствием литературной поддержки и отсутствием стандартизации процесса подготовки, что приводит к разнообразным характеристикам.
В этой видеостатье был продемонстрирован новый, экономически эффективный и удобный метод создания модифицированной ACS (mACS) или плазмы, богатой факторами роста (PRGF), для получения глазных капель с сопоставимой практической ценностью с коммерциализированными ACS. Ключевые идеи добавления антикоагулянтов и запуска клеток крови для секреции противовоспалительных цитокинов путем стрессовой инкубации были сохранены, но в отличие от химически индуцированных методов, таких как основанные на стеклянных шариках с покрытиемCrSO 4 и коммерческих наборах, критический стрессовый статус физически индуцируется гипоксической инкубацией в этом методе. Кроме того, глицерин был добавлен для обеспечения дополнительных преимуществ, включая повышение стабильности мембраны клеток крови, поддержание надлежащего осмотического давления внеклеточной жидкости18 и соответствующий источник питательных веществ в гипоксических условиях, которые позволяют избежать перенапряжения клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии с институциональными руководящими принципами, изложенными в начале раздела протокола. Все протоколы и процедуры были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Медицинского фонда Чан Гун. Все добровольцы были проинформированы о характере этого исследования и подписали форму информированного согласия до их включения. Расходные материалы, необходимые для всей экспериментальной процедуры, представлены на рисунках 1 и 2, а также в таблице материалов.
1. Подготовка материалов, необходимых для производства глазных капель mACS
- Приготовьте 250 мл 10% раствора глицерина и держите наготове инфузионный набор с крылом бабочки весом 21 г, шприц объемом 3 мл без иглы и шесть вакуумных пробирок по 10 мл, содержащих гепарин 158 единиц USP (рис. 1).
- Подсоедините иглу для забора крови 21 г к шприцу объемом 3 мл и наберите 3 мл 10% раствора глицерина в подготовленный шприц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы должны быть стерилизованы перед введением иглы. - Распределите 10% раствор глицерина в вакуумные пробирки последовательно, по примерно 0,5 мл 10% раствора глицерина в каждой (рис. 3А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за отрицательного давления в пробирке игла должна выйти сразу после входа, чтобы равномерно распределить 3 мл раствора глицерина по шести пробиркам. - Стерилизуйте кожу пациента стерильными ватными тампонами со стерильным 75% спиртом. Проколите поверхностную вену верхних конечностей пациента иглой для забора крови 18 G. Всего из поверхностной вены берут 60-70 мл венозной крови.
2. Подготовка к глазным каплям mACS
- Последовательно введите 10 мл взятой венозной крови в каждую из шести вакуумных пробирок (рис. 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от отрицательного давления вакуума для заполнения трубок. Чтобы избежать разрушения клеток крови и гемолиза, не прикладывайте никакого положительного давления. - Поместите шесть вакуумных пробирок в инкубатор с постоянной температурой 37 °C на 4 часа (рис. 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гипоксический статус поддерживается и стабилизируется оставшимся отрицательным давлением в герметичной пробирке, в которую поступал глицерин. - Через 4 ч выньте пробирки из инкубатора и центрифугируйте их при концентрации 3 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- На этом этапе подготовьте материалы для экстракции mACS, включая стерилизованные флаконы с глазными каплями, шприц объемом 3 мл с иглой, фильтр 0,22 мкм, иглу 18 G и пару стерильных перчаток (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Операционный стол следует протереть 75% спиртом, чтобы обеспечить асептическую среду. Надосадочная жидкость после центрифугирования уже является полуфабрикатом mACS. - Поместите шесть пробирок на стойку для пробирок и откройте крышки после полного центрифугирования (рис. 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильность на этом этапе не требуется. - Наденьте стерильные перчатки и вытащите mACS один за другим с помощью шприца объемом 3 мл с иглой 18 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарисовать нижний слой клеток крови на этом этапе (рис. 3E). - Вытащите иглу, подсоедините ее к фильтру 0,22 мкм и подсоедините иглу для сбора крови 23 G, 1,5 дюйма оригинальным шприцем объемом 3 мл к выходному отверстию ниже (рис. 3F).
- Осторожно протолкните иглу через фильтр 0,22 мкм в подготовленные стерильные флаконы с глазными каплями (рис. 3G).
- Повторяйте описанные выше шаги до тех пор, пока все mACS не будут отфильтрованы и сохранены во флаконах с глазными каплями (рис. 3H).
- Храните глазные капли mACS при температуре 4 °C для немедленного использования; хранить при температуре -20 °C для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните их более 2 недель при температуре 4 ° C или более 3 месяцев при -20 ° C 9,19.
3. Модель заживления ран эпителия роговицы мыши ex vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая модель животных ex vivo была основана на предыдущем опыте Hung et al. по механическим повреждениям эпителияроговицы 20. Следующие шаги должны быть выполнены под микроскопом, чтобы создать хорошо очерченную и последовательную эпителиальную рану роговицы.
- Анестезируйте мышей C57BL/6 3%-4% изофлураном. Вдавливайте удар биопсии кожи над центральной роговицей мыши, оставляя неглубокий круг на эпителии в качестве однородного края раны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать разрыва глазного яблока. - Удалите эпителий роговицы в пределах подтвержденной области вплоть до слоя Боумена с помощью кольца для удаления ржавчины роговицы, оснащенного заусенцем 0,5 мм.
- Чтобы создать животную модель механической раны роговицы ex vivo , соберите глазное яблоко и хорошо подготовьте культуру.
- Сначала усыпьте мышей; Затем осторожно надавите на верхний и нижний орбитальные ободки мышей, введите кончик щипцов над ретробульбарным пространством, вытащите глазное яблоко и удерживайте его за щипцы.
- Разрежьте зрительный нерв и периорбитальные мягкие ткани ножницами роговицы, чтобы идеально изолировать глазное яблоко.
- Подготовьте 96-луночную пластину с расплавленным воском внутри. Быстро создайте круглое отверстие с помощью кончиков щипцов, а затем дождитесь застывания.
- Подготовьте среду к тестированию: 0,5% mACS, 0,5% AS для сравнения, нормальный физиологический раствор в качестве отрицательного контроля и модифицированная среда Дульбекко Игла (DMEM).
ПРИМЕЧАНИЕ: mACS получается с использованием протокола, упомянутого выше. - Для культуры ex vivo поместите собранное глазное яблоко на подготовленную тарелку с 96 лунками. Добавьте 200 мкл каждой среды в 96-луночную пластину.
- Поместите культуральную пластину с 96 лунками в инкубатор при температуре 37 °C с содержаниемCO2 5%. Следите за тем, чтобы питательные среды менялись каждые 24 часа.
- Для подтверждения последовательного ранозаживляющего эффекта контролируют область эпителиальной раны под микроскопом каждые 8 ч путем окрашивания флуоресцеином.
- Растворите флуоресцеин на флуоресцеиновой бумаге обычным физиологическим раствором.
- Капните флуоресцеиновый краситель на центральную роговицу мыши, затем наблюдайте и документируйте его под микроскопом. Типичный результат показан на рисунке 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения достаточно одной капли (примерно 0,05 мл) флуоресцеинового красителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунках 1 и 2 показаны материалы, необходимые для эксперимента, а на рисунке 3 показаны последовательные этапы и успешные промежуточные продукты во время подготовки mACS. Сначала 0,5 мл 10% раствора глицерина добавляли в каждую стерильную пробирку объемом 10 мл (рис. 3А). Затем у пациента брали 60-70 мл венозной крови, и в каждую пробирку вводили по 10 мл крови (рис. 3Б). Кровь пациента должна быть подвергнута тщательным, регулярным лабораторным исследованиям перед подготовкой, чтобы убедиться, что качество крови соответствует стандарту. Наиболее распространенный продукт крови низкого качества обусловлен дислипидемией, которая приводит к помутнению верхнего слоя сыворотки после центрифугирования, который трудно удалить; дальнейшее приготовление глазных капель не может быть продолжено (рис. 5А).
Затем запечатанную пробирку помещают в инкубатор при 37 °C на 4 ч (рис. 3C). После инкубации и центрифугирования образец может быть разделен на верхний слой, содержащий предварительный продукт mACS, и нижний слой клеток крови (рис. 3D). Затем собирали жидкость верхнего слоя. В дальнейшем асептические методы имеют важное значение. Поскольку сыворотка является очень питательной средой для размножения микроорганизмов, любая поверхность, контактирующая с иглой, должна быть сначала продезинфицирована 75% спиртом, а во время процесса необходимо использовать стерильные перчатки. Важно отметить, что при удалении надосадочной жидкости следует избегать нарушения клеток крови из нижнего слоя (рис. 3E).
На этом этапе ожидается, что надосадочная жидкость прозрачная или бледно-желтая. Однако, если виден легкий красный цвет, возможно, произошел гемолиз, и препарат может не подходить для последующих этапов (рис. 5B). Собранную сыворотку можно снова центрифугировать, чтобы убедиться, что надосадочная жидкость свободна от эритроцитов. Сыворотку фильтровали через фильтр 0,22 мкм в стерильный флакон с глазными каплями (рис. 3F, G). Конечный продукт, глазные капли mACS, затем охлаждали или замораживали как можно скорее, в зависимости от цели (рис. 3H). Глазные капли нельзя было хранить слишком долго из-за их богатства лабильными питательными веществами и отсутствия консервантов.
В модели поверхностного заживления ex vivo глазные капли mACS показали превосходный результат заживления ран роговицы по сравнению с глазными каплями AS. Сбор глазных яблок мышей C57BL / 6 проводился после создания концентрической раны роговицы путем физического истирания под микроскопом. Затем принесенные в жертву глаза мышей культивировали в четырех различных средах, включая чистый физиологический раствор, DMEM, 0,5% AS, и 0,5% mACS.
Используемая здесь среда АС была подготовлена на основе литературы21 и клинической практики в Мемориальной больнице Чанг Гун Линкоу. Венозная кровь, всего 40 мл, была взята в вакуумные трубки добровольцев после стерилизации кожи. Антикоагулянт в тюбики не добавлялся. Затем кровь хранили в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полное свертывание, с последующим центрифугированием при 3 500 × г в течение 10 мин. После центрифугирования чистый АС занимал верхний слой пробирок, который разбавляли BSS (стерильным ирригационным раствором) до 0,5% в этой модели ex vivo на животных.
Раны роговицы последовательно наблюдались в шесть разных временных точек, а именно в 0, 8, 16, 24, 32 и 48 часах. Предварительные результаты показали, что через 16 ч раны роговицы заживали быстрее под глазными каплями 0,5% mACS, чем в других группах. Через 24 часа группы 0,5% АС и ДМЕМ имели сопоставимые терапевтические эффекты с 0,5% глазными каплями mACS. Заживление ран роговицы, близкое к полному выздоровлению, наблюдалось через 32 ч, за исключением группы с нормальным физиологическим раствором (рис. 4).
Рисунок 1: Материалы, необходимые для добавления 10% раствора глицерина в пробирки . (A) 21 г инфузионного набора с крыльями бабочки. (B) 250 мл 10% раствора глицерина. (C) Шесть вакуумных пробирок по 10 мл, содержащих гепарин 158 единиц USP. (D) Шприц 3,0 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Материалы для экстракции и фильтрации надосадочной жидкости образца крови . (А) Фильтр 0,22 мкм. (B) Стерилизованный флакон с глазными каплями объемом 5 мл. (C) Пара стерильных перчаток. (D) Шприц объемом 3 мл с иглой 23 г. (E) Шприц объемом 20 мл. (F) Иглы весом 18 г. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процедуры центрифугирования крови и подготовки к производству модифицированных аутологичных кондиционированных глазных капель сыворотки . (А) В каждую пробирку добавляли 0,5 мл 10% раствора глицерина. (B) Образец крови, взятый у пациента, был разделен поровну на шесть пробирок (только одна показана на изображении). (C) Внешний вид пробирки после помещения в инкубатор с температурой 37°С на 4 часа. (D) Слои сыворотки и клеток крови после центрифугирования. е) остаток после аспирации надосадочной жидкости. Следует быть осторожным, чтобы не аспирировать нижний слой клеток крови. (F) Надосадочная жидкость собирается в шприц объемом 3 мл, а под него вставляют фильтр 0,22 мкм и иглу емкостью 23 г. (G) Игла осторожно вставляется в стерильный флакон с глазными каплями. (H) Конечный продукт модифицированных глазных капель ACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Последовательные изменения ран роговицы (зеленые области на рисунках после окрашивания флуоресцеином) в глазах мышей в четырех различных питательных средах с течением времени. В группе с физиологическим раствором существенных различий не наблюдалось, в то время как заживление ран (стрелки) с течением времени наблюдалось в группах DMEM, 0,5% AS и 0,5% mACS. В группе 0,5% mACS заживление ран (стрелки) было значительно более полным через 16 часов, чем у тех, кто лечился АС и ДМЭМ. Через 24 часа группы DMEM, 0,5% mACS и 0,5% AS показали дальнейшие эффекты заживления (стрелки), особенно в группе mACS. Почти полное выздоровление наблюдалось через 32 часа во всех группах, за исключением группы с физиологическим раствором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Примеры плохих продуктов крови после центрифугирования . (А) Дислипидемия. Наиболее распространенные дефектные продукты связаны с ожирением или сахарным диабетом, так как верхняя сыворотка содержит высокое содержание жира и холестерина. (Б) Гемолиз. Это также распространенный неоптимальный продукт. Основная причина может быть связана с использованием игл малого диаметра для забора крови или использованием несоответствующей внешней силы при введении продуктов крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании описан протокол приготовления mACS и дополнительно показана польза глазных капель mACS для заживления ран на животных моделях. Важнейшей модификацией этого протокола mACS является добавление приблизительно 0,5 мл 10% раствора глицерина в каждую пробирку, что создает подходящие гипоксические условия во время 4-часовой инкубации при 37 °C. Эта настройка обеспечивает АС надлежащий стресс и побуждает клетки выделять необходимые факторы роста, которые способствуют заживлению ран. Фильтр 0,22 мкм может помочь устранить макромолекулярные белки, клетки крови и примеси, тем самым делая конечный продукт чистым и менее адгезивным.
Кровь инкубируют в течение 4 ч при 37 °С, после чего проводят дальнейшее центрифугирование и фильтрацию. Строгое внимание к стерильности при подготовке и хранении конечных продуктов при надлежащей температуре также имеет решающее значение. Высокое содержание питательных веществ в конечных сывороточных продуктах является отличной питательной средой для бактерий. Таким образом, неправильное хранение или загрязнение во время приготовления может испортить глазные капли. Зараженный mACS может вызывать такие заболевания, как конъюнктивит или инфекционный кератит.
Также важно качество крови пациента; поэтому перед подготовкой mACS необходимы лабораторные анализы для обеспечения безопасности продуктов крови. Во время взятия и при операции с образцами крови пациента операторы должны знать о гемолизе. Любое давление во время приготовления может легко вызвать гемолиз; Поэтому шприц следует медленно тянуть и толкать во время сбора крови. Гипоксию также следует контролировать для получения высоких концентраций факторов роста и противовоспалительных цитокинов. Основываясь на опыте и ранее опубликованных исследованиях22,23, применение 4-часовой гипоксической инкубации является конечной настройкой. Глицерин может обеспечить более подходящий гипоксический стресс для клетки из-за стабилизирующего эффекта и правильного осмотического давления внеклеточной жидкости, которое он может обеспечить18. Тем не менее, оптимальную концентрацию глицерина и то, как она коррелирует с концентрацией цитокинов, все еще необходимо проверить. В будущем для подтверждения его эффективности будут проведены исследования заживления ран на животных in vivo и более масштабное рандомизированное контрольное исследование.
До сих пор исследования в основном были сосредоточены на применении сывороточных продуктов для лечения заболеваний поверхности глаза с использованием традиционного АС и новых глазных капель PRP24,25,26,27. Традиционная АС без какого-либо антикоагулянта и без использования фильтра во время приготовления является янтарем в чистом виде, но часто доставляет пациентам дискомфорт из-за своей адгезивности. В результате обычно используется разбавленный АС (20-50%), что снижает концентрацию питательных веществ. PRP, однако, менее адгезивный и обычно используется в чистом виде (100%). В последних литературных отчетах в основном указывается, что PRP обеспечивает лучшее противовоспалительное и ранозаживляющее действие, чем AS, в основном из-за его богатого содержания противовоспалительных цитокинов, факторов роста и его способности ослаблять IL-1β-индуцированное воспаление16,26. Рандомизированное контролируемое исследование, проведенное García-Conca et al., уже показало, что применение PRP при тяжелых или умеренных гипосекреторных заболеваниях сухого глаза показывает удовлетворительные результаты28. Хотя ОКС, как улучшение по сравнению с АС, редко сообщалось при воспалительных и дегенеративных заболеваниях глазной поверхности, он широко использовался при лечении дегенеративного артрита и заживления ран в ортопедии 29,30,31. Наиболее распространена САУ изготовлена и запатентована в виде коммерческого комплекта13,32. mACS был разработан после корректировки процесса подготовки ACS, чтобы объединить сильные стороны как ACS, так и PRP. mACS может быть произведен по более экономичной цене, поскольку не требуются специальные реагенты, такие как стеклянные шарики с4-кратным покрытием CrSO или какие-либо запатентованные наборы, которые необходимы при приготовлении как ACS, так и PRP.
Помимо экономических соображений, глазные капли mACS также дали удовлетворительные предварительные результаты в эксперименте ex vivo и могут стать революционной альтернативой нынешним, появляющимся глазным каплям PRP. Следует отметить, что ОКС продемонстрировал лучшие результаты, чем большинство установленных методов лечения воспалительных заболеваний суставов, как в качественном, так и в количественном отношении из-за его противовоспалительной способности и улучшенных механизмов эндогенной репарации17. Несмотря на то, что на сегодняшний день нет литературных данных о терапевтических эффектах ОКС в офтальмологии, разумно предположить потенциал его применения у пациентов с дефектами эпителия роговицы из-за его противовоспалительного механизма и успеха в ортопедии33. Только АС сравнивали с mACS в нашем исследовании ex vivo ; однако PRP и ACS, произведенные с помощью коммерческих комплектов, также могут быть сравнены. Будущие исследования по анализу сывороточных уровней противовоспалительных цитокинов и факторов роста в mACS будут полезны для подтверждения его сходства с ACS или PRP и потенциального превосходства над AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Ya-Lan Chien и Chia-Ying Lee за отличную техническую помощь, а также компанию OnLine English за лингвистическое издание. Это исследование было частично профинансировано Chang Gung Medical Research Project (грант No CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
