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Neuroscience

Hypothalamische Kisspeptin-Neurone als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem eine Ganzzell-Patchklemme auf Hirnschnitten durchgeführt werden kann, die Kisspeptin-Neuronen, den primären Modulator von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Zellen, enthalten. Durch das Hinzufügen von Wissen über die Aktivität von Kisspeptin-Neuronen hat dieses elektrophysiologische Werkzeug in den letzten 20 Jahren als Grundlage für bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Neuroendokrinologie gedient.

Abstract

Kisspeptine sind essentiell für die Reifung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) und die Fruchtbarkeit. Hypothalamische Kisspeptin-Neuronen, die sich im anteroventralen periventrikulären Kern und rostralen periventrikulären Kern sowie im Nucleus arcuatus des Hypothalamus befinden, projizieren unter anderem auf Neuronen des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH). Frühere Studien haben gezeigt, dass der Kisspeptin-Signalweg über den Kiss1-Rezeptor (Kiss1r) erfolgt, was letztendlich die Aktivität des GnRH-Neurons anregt. In Menschen und experimentellen Tiermodellen sind Kisspeptine ausreichend, um die GnRH-Sekretion und damit die Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) zu induzieren. Da Kisspeptine eine wesentliche Rolle bei den Fortpflanzungsfunktionen spielen, arbeiten die Forscher daran, zu untersuchen, wie die intrinsische Aktivität der hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen zu reproduktionsbezogenen Aktionen beiträgt, und die primären Neurotransmitter/Neuromodulatoren zu identifizieren, die diese Eigenschaften verändern können. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik hat sich zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Aktivität von Kisspeptin-Neuronen in Nagetierzellen entwickelt. Diese experimentelle Technik ermöglicht es den Forschern, spontane erregende und hemmende Ionenströme, das Ruhemembranpotential, das Aktionspotentialfeuer und andere elektrophysiologische Eigenschaften von Zellmembranen aufzuzeichnen und zu messen. In der vorliegenden Arbeit werden entscheidende Aspekte der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, bekannt als elektrophysiologische Messungen, die hypothalamische Kisspeptin-Neurone definieren, und eine Diskussion relevanter Fragen zur Technik besprochen.

Introduction

Hodgkin und Huxley machten den ersten intrazellulären Nachweis eines Aktionspotentials, das in mehreren wissenschaftlichen Studien beschrieben wurde. Diese Aufnahme wurde am Squid-Axon durchgeführt, das einen großen Durchmesser (~500 μm) hat, so dass eine Mikroelektrode im Axon platziert werden kann. Diese Arbeit bot große Möglichkeiten für die wissenschaftliche Forschung, die später in der Schaffung des Spannungszangenmodus gipfelte, der zur Untersuchung der ionischen Grundlagen der Erzeugung von Aktionspotentialenverwendet wurde 1,2,3,4,5,6,7,8. Im Laufe der Jahre wurde die Technik verbessert und in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet 6,9. Die Erfindung der Patch-Clamp-Technik, die Ende der 1970er Jahre durch Studien von Erwin Neher und Bert Sakmann erfolgte, ermöglichte es den Forschern, einzelne Ionenkanäle und intrazelluläre Membranpotentiale oder -ströme in praktisch jedem Zelltyp mit nur einer einzigen Elektrode aufzuzeichnen 9,10,11,12. Patch-Clamp-Ableitungen können an einer Vielzahl von Gewebepräparaten, wie z. B. kultivierten Zellen oder Gewebeschnitten, entweder im Voltage-Clamp-Modus (Halten der Zellmembran auf einer festgelegten Spannung, was die Aufzeichnung von z. B. spannungsabhängigen Strömen und synaptischen Strömen ermöglicht) oder im Current-Clamp-Modus (der die Aufzeichnung von z. B. Änderungen des Ruhemembranpotentials ermöglicht, die durch Ionenströme induziert werden) durchgeführt werden. Aktionspotentiale und postsynaptische Potentialfrequenz).

Der Einsatz der Patch-Clamp-Technik ermöglichte mehrere bemerkenswerte Entdeckungen. In der Tat sind die bahnbrechenden Erkenntnisse über die elektrophysiologischen Eigenschaften von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen, die sich an den anteroventralen periventrikulären und rostralen periventrikulären Kernen (AVPV/PeN Kisspeptin), auch bekannt als rostraler periventrikulärer Bereich des dritten Ventrikels (RP3V), und dem Nucleus arcuatus des Hypothalamus (ARHKisspeptin) befinden13,14,15 sind von besonderem Interesse. Im Jahr 2010 führten Ducret et al. die ersten Aufnahmen von AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronenin Mäusen mit einem anderen elektrophysiologischen Werkzeug, der Loose-Cell-Patch-Clamp-Technik, durch. Diese Studien lieferten eine elektrische Beschreibung von AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und zeigten, dass ihre Feuermuster vom Brunstzyklus abhängen16. Im Jahr 2011 verwendeten Qiu et al. die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, um zu zeigen, dassARH-Kisspeptin-Neuronen endogene Schrittmacherströme exprimieren17. In der Folge zeigten Gottsch et al., dass Kisspeptin-Neuronen spontane Aktivität aufweisen und sowohl h-Typ (Schrittmacher) als auch T-Typ Kalziumströme exprimieren, was darauf hindeutet, dassARH-Kisspeptin-Neuronen elektrophysiologische Eigenschaften mit anderen Schrittmacherneuronen des Zentralnervensystems teilen18. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ARH-Kisspeptin-Neurone sexuell dimorphe Feuerraten aufweisen und dass AVPV/PeN-Kisspeptin-Neurone ein bimodales Ruhemembranpotential (RMP) aufweisen, das von ATP-sensitiven Kaliumkanälen (KATP) beeinflusst wird19,20. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass Gonadensteroide die spontane elektrische Aktivität der Kisspeptin-Neuronen in Mäusen positiv beeinflussen 19,20,21. Die ersten Arbeiten, die die elektrophysiologischen Eigenschaften von Kisspeptin-Neuronen untersuchen, werden erwähnt 16,17,18,19,20. Seitdem wurde in vielen Studien die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um zu zeigen, welche Faktoren/Neuromodulatoren ausreichen, um die elektrische Aktivität von Kisspeptin-Neuronen zu modulieren (Abbildung 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Angesichts der Bedeutung dieser Technik für die Untersuchung von Neuronen, die für die Fortpflanzung benötigt werden, neben anderen Zelltypen, die hier nicht behandelt werden, beschreibt dieser Artikel die grundlegenden Schritte für die Entwicklung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, wie z. B. die Herstellung der Lösungen, das Sezieren und Schneiden des Gehirns und das Versiegeln der Zellmembran für Aufzeichnungen. Darüber hinaus werden relevante Fragen der Technik diskutiert, wie z.B. ihre Vorteile, technischen Einschränkungen und wichtigen Variablen, die für eine optimale experimentelle Leistung kontrolliert werden müssen.

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Protocol

Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo genehmigt und gemäß den ethischen Richtlinien des brasilianischen Kollegiums für Tierversuche durchgeführt.

1. Herstellung von Lösungen

  1. Herstellung der inneren Lösung
    Anmerkungen: Die interne Lösung füllt die Patch-Clamp-Mikropipette und kommt mit dem Inneren der Zelle in Kontakt (siehe Beispiel in Abbildung 2). Interne Lösungen können je nach Art der zu messenden Aktivität variieren33.
    1. Wählen Sie die interne Lösung unter Berücksichtigung ihres experimentellen Zwecks und des geeigneten Datensatztyps aus. Um das Membranpotential im Stromklemmenmodus aufzuzeichnen, verwenden Sie die interne Lösung, die aus 120 mM K-Gluconat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl und 4 mM (Mg)-ATP besteht. Wiegen Sie alle Salze entsprechend dem gewünschten Endvolumen, wie in Tabelle 1 angegeben.
    2. Verwenden Sie genügend deionisiertes Wasser, um 90 % des Endvolumens der Lösung zu erreichen. Dieses Volumen bietet genügend Platz, um den pH-Wert und die Osmolarität einzustellen.
    3. Nachdem Sie alle Zutaten hinzugefügt und gründlich gemischt haben, stellen Sie den pH-Wert mit 5 M KOH mit einem pH-Messgerät auf 7,2-7,3 ein. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen, die bei etwa 275-280 mOsm liegen sollte (stellen Sie bei Bedarf nur nach unten ein).
    4. Bereiten Sie die innere Lösung im Voraus vor und lagern Sie sie bei 8 °C. Fügen Sie das ATP am Tag des Experiments hinzu. Lagern Sie die ATP-haltige interne Lösung bei -20 °C (1 mL Aliquots) für 3-4 Monate.
  2. Herstellung der Schneidelösung
    1. Bereiten Sie eine Schnittlösung vor, die 238 mM Saccharose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mMNaH2PO4, 10 mM Glucose, 1,0 mM CaCl2und 5,0 mMMgCl2 enthält. Wiegen Sie alle Salze entsprechend dem gewünschten Endvolumen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Das genaue Volumen dieser herzustellenden Lösung hängt von der Größe der Schneidkammer ab.
    2. Während Sie alle Salze in deionisiertem Wasser mischen, sättigen Sie sie ständig mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO2). Befestigen Sie Polyethylenschläuche (1,57 mm Außendurchmesser [OD] x 1,14 mm Innendurchmesser [ID]) an einem Carbogenzylinder, um Carbogen der Schneidlösung zuzuführen. Halten Sie das offene Ende des Röhrchens in das Becherglas mit der Schneidlösung.
    3. Nachdem Sie alle Zutaten gut vermischt haben, stellen Sie den pH-Wert mit 10% Salpetersäure mit einem pH-Messgerät auf 7,3 ein. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen, die 290-295 mOsm betragen sollte (stellen Sie bei Bedarf nur nach unten ein). Anschließend kühlen Sie die Lösung auf 0-2 °C ab.
  3. Vorbereiten einer CSF-Lösung für Aufnahmen
    1. Bereiten Sie eine künstliche Liquorlösung (aCSF) für Aufnahmen vor, die 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mMNaH2PO4, 1,2 mMMgSO4, 5 mM Glukose und 2,5 mM CaCl2 enthalten. Wiegen Sie alle Salze entsprechend dem gewünschten Endvolumen, das in Tabelle 3 angegeben ist.
    2. Während Sie alle Salze in deionisiertem Wasser mischen, sättigen Sie sie ständig mit Carbogen (95 %O2 und 5 % CO 2), wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.
    3. Nachdem Sie alle Zutaten hinzugefügt und gemischt haben, stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 7,3 (10% Salpetersäure kann verwendet werden) ein. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen, die 290-300 mOsm betragen sollte. Anschließend das aCSF in ein Becherglas geben und im Wasserbad bei 30 °C aufbewahren.

2. Dissektion und Schneiden des Gehirns

HINWEIS: Da unterschiedliche Gehirnstrukturen in verschiedenen Ebenen (koronale, sagittale oder horizontale Schichten) geschnitten werden müssen, hängt der genaue Ansatz zur Gewinnung der Schnitte von der interessierenden Gehirnregion ab. Typischerweise werden die Kiss1-exprimierenden Zellen in den AVPV/PeN- und ARH-Neuronen (hier als AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen undARH-Kisspeptin-Neuronen bezeichnet; Abbildung 2A,B), werden koronale Hirnschnitte (200-300 μm) in der Regel 17,19,20,21,34 hergestellt. Die AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen befinden sich etwa 0,5 bis -0,22 mm vom Bregma entfernt, während dieARH-Kisspeptin-Neuronen bei -1,22 bis -2,70 mm liegen. Die Lage der Zellkerne kann mit Hilfe eines stereotaktischen Maushirnatlas35 oder des Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/) bestimmt werden. In dieser Studie wurden adulte weibliche (Diestrus-Stadium) und männliche Kiss1-Cre/GFP-Mäuse36 verwendet.

  1. Entfernung des Gehirns
    1. Bereiten Sie die Sezierstelle und die Werkzeuge vor, die zum Extrahieren des Gehirns benötigt werden: Enthauptungsschere, Irisschere, gebogene Castroviejo-Schere, Osteotom, Pinzette, Spatel, Filterpapier, Petrischale, Rasierklinge und Cyanacrylatkleber.
    2. Bereiten Sie vor der Herstellung der Scheiben die Bank vor, auf der die Präparation durchgeführt werden soll, da alle nachfolgenden Eingriffe schnell durchgeführt werden müssen. Stellen Sie sicher, dass Sie Zugang zu einem Schneidegerät wie einem Vibratom haben.
    3. Bereiten Sie eine Aufnahmekammer vor, um die Hirnschnitte zu erhalten, bevor Sie das Gewebe schneiden. Erwerben Sie eine Aufnahmekammer mit Badabmessungen von 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x B x H) von einer Handelsmarke (Table of Materials) oder stellen Sie eine im eigenen Haus her.
      HINWEIS: Eine hauseigene Rückgewinnungskammer kann wie folgt hergestellt werden: Schneiden Sie eine 24-Well-Platte so zu, dass neun Wells zur Verfügung stehen. Kleben Sie ein Nylonsieb auf den Boden der neun Vertiefungen. Machen Sie mit dem Rest der Wellplatte eine Basis, so dass der untere Teil des Nylons frei ist. Dieser angepasste Boden kann in ein 500-ml-Becherglas mit dem aCSF gegeben werden (ergänzende Abbildung 1).
    4. Nachdem Sie alles vorbereitet haben, betäuben Sie das Tier mit einem inhalativen Anästhetikum mit 4%-5% Isofluran. Die Anästhesie muss nach einem von der Ethikkommission genehmigten Protokoll erfolgen. Kurz nachdem das Tier bewegungsunfähig ist, führen Sie Schwanz- und Pfotenquetschtests durch, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt ist.
    5. Enthaupten Sie die Mäuse schnell, während das Herz noch aktiv ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Ernte das Gehirn schnell nach der Enthauptung.
    6. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in die Haut an der Oberseite des Schädels des Tieres, von kaudal bis rostral, und entfernen Sie die Kopfhaut vom Kopf des Tieres. Als nächstes schneiden Sie die Interparietalplatte mit der Irisschere entlang der sagittalen Naht und entfernen das Hinterhauptbein. Schieben Sie das Osteotom unter den Scheitelbein und ziehen Sie es vorsichtig heraus, bis das Gehirn freigelegt ist.
    7. Nachdem Sie das Gehirn freigelegt haben, drehen Sie den Kopf auf den Kopf, senken Sie das Gehirn sanft ab, um den Trigeminusnerv auf jeder Seite sichtbar zu machen, und schneiden Sie dann den Trigeminusnerv mit einer gebogenen Castroviejo-Schere durch. Nachdem Sie den Hypothalamus dargestellt haben, identifizieren Sie den Sehnerv und schneiden Sie ihn sanft durch.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Sehnerv durchtrennen, da durch Ziehen der angrenzende hypothalamische Bereich, der den AVPV/PeN-Kern enthält, zerrissen wird.
    8. Schneiden Sie den vordersten Teil des Frontallappens ab und entfernen Sie das Gehirn vollständig. Tauchen Sie das Gehirn sofort in die Schneidelösung ein, bis Sie die Scheiben erhalten.
  2. Schneiden von Gehirnproben
    1. Legen Sie das Gehirn auf Filterpapier (gestützt auf eine Petrischale), um die überschüssige Lösung zu trocknen. Führen Sie dann mit einer scharfen Rasierklinge einen koronalen Schnitt durch, der den Hirnstamm mit dem Kleinhirn vom Rest des Gewebes trennt.
    2. Als nächstes kleben Sie den kaudalen Teil des Gehirns auf die Basis des Vibratoms und füllen die Kammer des Schneidegeräts mit der auf 0-2 °C abgekühlten Schneide-/aCSF-Lösung. Packen Sie während des Vorgangs Trockeneis um die Vibratomkammer, um die Schneidelösung kalt zu halten.
    3. Führen Sie die Rasierklinge in das Vibratom ein und stellen Sie die entsprechenden Schneidparameter des Geräts ein: Geschwindigkeit = 3, Frequenz = 9 und Vorschub = 250 μm. Verwenden Sie eine Acryl-Transferpipette (invertierte Pasteur-Glaspipette, die an einem Silikonsauger befestigt ist), um die Scheiben während des Gewebeschneidens in die Auffangkammer (siehe Schritt 2.1.3) zu übertragen. Warten Sie 60 Minuten, bis sich das Gewebe nach der Schnittaufnahme erholt hat.

3. Zellenversiegelung für die Aufnahme

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte (Mikroskop, Verstärker, Digitizer, Mikromanipulator und andere) eingeschaltet sind, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
  2. Füllen Sie die am Mikroskop angebrachte Aufnahmekammer einer handelsüblichen Marke (Table of Materials) mit der aCSF-Lösung für Aufzeichnungen. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den aCSF konstant mit einer Rate von 2 ml/min zu perfundieren.
  3. Übertragen Sie einen gewünschten Brain Slice (einen nach dem anderen) in die Aufnahmekammer. Verwenden Sie eine Acryl-Transferpipette (invertierte Pasteur-Glaspipette, die an einem Silikonsauger befestigt ist), um die hypothalamischen Scheiben in die Kammer zu übertragen. Verwenden Sie einen Schichtanker (Materialtabelle), um die Scheibe so zu halten, dass sie sich während der aCSF-Perfusion nicht bewegt.
  4. Legen Sie eine Scheibe in die Mitte der Aufnahmekammer, die am Mikroskop befestigt ist. Die Schichtposition ist entscheidend, um eine gute Sicht auf den gewünschten Bereich unter dem Mikroskop zu ermöglichen und die Aufnahmemikropipette perfekt zu erreichen.
  5. Verwenden Sie die lichtsparende Objektivlinse (10x oder 20x) eines Tauchmikroskops, um die Positionierung der Schicht und die Lokalisierung des interessierenden Bereichs zu unterstützen.
  6. Nachdem Sie die interessierende Region lokalisiert haben, schalten Sie die Objektivlinse auf die Hochleistungslinse (63x) um und konzentrieren Sie sich auf die Gewebeebene, wobei Sie das endogene fluoreszierende Protein und die Formen der Zellen in der Zielregion beobachten, um die Kisspeptin-Zellen auf der Oberfläche der Gehirnscheibe20 zu lokalisieren.
  7. Wenn sich eine mögliche Zielzelle befindet, markieren Sie sie auf dem Computerbildschirm mit dem Mauszeiger oder indem Sie ein Format, z. B. ein Quadrat, über den gewünschten Bereich zeichnen. Die Bildschirmmarkierung des Computers hilft dabei, die Position der Aufzeichnungsmikropipette zur Zelle zu führen.
  8. Nachdem Sie die genaue Position der Zielzelle bestimmt haben, heben Sie das Objektiv an und führen Sie die mit der internen Lösung gefüllte Aufnahmemikropipette ein. Achten Sie beim Einsetzen der Mikropipette in den Elektrodenhalter darauf, dass die innere Lösung mit der Silberelektrode in Kontakt steht.
    Anmerkungen: Informationen zur Vorbereitung, Platzierung und Positionierung der Mikropipette auf dem Elektrodenhalter finden Sie unter33.
  9. Üben Sie vor dem Eintauchen der Mikropipette in die aCSF-Lösung einen Überdruck aus, um zu verhindern, dass Schmutz in die Mikropipette eindringt, indem Sie eine luftgefüllte 1-3-ml-Spritze verwenden, die über einen Polyethylenschlauch (≈130 cm länger) mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist. Tragen Sie fast 100-200 μl Luft auf.
  10. Führen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator unter die Mitte des Objektivs. Bewegen Sie die Tasten am Mikromanipulator, um die Mikropipette auf der X-Y-Z-Achse in Richtung der gewünschten Zelle zu führen.
  11. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die Spitze der Mikropipette zu sehen ist, und bringen Sie den Fokus näher, aber nicht zu nah an die Schicht. Verringern Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators und senken Sie die Mikropipette langsam auf die Fokusebene. Achten Sie darauf, dass die Mikropipettenspitze nicht abrupt in die Scheibe eindringt, sondern langsam absinkt, bis sie die Oberfläche der Zelle/Zielregion berührt.
  12. Üben Sie mit der luftgefüllten 1-3-ml-Spritze, die am Mikropipettenhalter befestigt ist, leichten Überdruck (≈100 μl) aus, um jeglichen Schmutz von der Annäherungsbahn zu entfernen.
  13. Konzentrieren Sie sich auf die Zielzelle und bewegen Sie den Mikromanipulator langsam auf der X-Y-Z-Achse, um die Mikropipette näher an die Zielzelle zu bringen. Wenn die Mikropipette mit der Zelle berührt wird, wird ein Grübchen beobachtet, das durch den Druck verursacht wird, der durch die Mikropipettenspitze ausgeübt wird (Abbildung 2C).
  14. Nach der Bildung des Grübchens ist aufgrund der Nähe der Mikropipette zur Zelle ein schwacher, kurzer Sog mit dem Mund (1-2 s) durch das mit dem Mikropipettenhalter verbundene Röhrchen durchzuführen, um die Abdichtung zwischen der Mikropipette und der Zelle zu erzeugen (Gigaohm-Dichtung oder Gigaseal >1 GΩ; Abbildung 2D). Um die Dichtung zu bilden, verwenden Sie den Voltage-Clamp-Modus in der Software. Einzelheiten zur Siegelbildung finden Sie unter33.
  15. Wenn die Dichtung stabil bleibt (die Gigaohm-Dichtung sollte mechanisch stabil und ohne Rauschstörungen sein, ermittelt durch Beobachtung für ca. 1 min), stellen Sie die Haltespannung auf das nächstgelegene physiologische Ruhepotential der interessierenden Zelle ein. Für Kisspeptin-Hypothalamus-Neurone werden -50 mV empfohlen.
  16. Saugen Sie kurz mit dem Mund (Unterdruck) ab, wobei die Mikropipette an der Zelle versiegelt ist, um die Plasmamembran zu durchbrechen (Abbildung 2E). Eine adäquate Ganzzellkonfiguration wird erreicht, wenn das Absaugen mit ausreichender Kraft durchgeführt wird, so dass die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft und keinen beträchtlichen Teil der Membran oder sogar der Zelle anzieht.
  17. Überprüfen Sie das verwendete Handbuch für die Systemeinstellungen. Mit der Software (siehe Materialtabelle) können Sie den Serienwiderstand (SR) und die Ganzzellkapazität (wcc) digital überprüfen und berechnen.
  18. Aktivieren Sie im Voltage-Clamp-Modus nach dem Aufbrechen der Zellmembran die Option "Gesamte Zelle" und klicken Sie auf den Befehl Auto, der sich auf die Registerkarte "Gesamte Zelle" bezieht. Die SR und WCC der Zelle werden automatisch berechnet und sofort von der Software angezeigt. Diese Parameter können auch überprüft werden, indem der Membrantest mit dem in der Materialtabelle33 genannten Verstärker durchgeführt wird.
  19. Stellen Sie sicher, dass Sie die Parameter der Zellviabilität überprüfen. Überprüfen Sie bei Kisspeptin-Neuronen, ob die elektrophysiologischen Messungen wie folgt sind: SR < 25 mΩ, Eingangswiderstand > 0,3 GΩ und Haltestrom Absolutwert < 30 pA (persönliche Beobachtungen und Referenz21). Der Mittelwert des WCC von AVPV/PeN-Kisspeptin- oderARH-Kisspeptin-Neuronen beträgt ≈ 10-12 pF in Gonaden-intakten Mäusen20.
  20. Überwachen Sie die SR und die stationäre Kapazität der Zelle während der Experimente. Stellen Sie sicher, dass sich der SR während einer Aufnahme nicht um mehr als 20 % ändert und dass die Membrankapazität stabil ist.
  21. Überprüfen Sie die Softwareeinstellungen. Erstellen Sie spezifische Protokolle für die Aufzeichnungen, je nach Art des Experiments. Um das Membranpotential im Stromzangenmodus mit den in der Materialtabelle genannten Geräten aufzuzeichnen, filtern Sie die elektrophysiologischen Signale bei 2-4 kHz im Tiefpass und analysieren Sie die Ergebnisse offline in einer Software (Softwareinformationen finden Sie in der Materialtabelle ).
  22. Sobald die Gesamtzellenkonfiguration korrekt erreicht ist, messen Sie die synaptischen Ströme im Voltage-Clamp-Modus (Abbildung 2G). Zeichnen Sie Änderungen des Ruhemembranpotentials (RMP) und der induzierten RMP-Variationen im Stromzangenmodus auf (Abbildung 2H). Veränderungen des RMP, wie z. B. die Depolarisation der Zellmembran, können durch die Verabreichung eines bekannten Arzneimittels/Neurotransmitters in das Bad (beschrieben in Schritt 3.2) induziert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt.
    Anmerkungen: Im Stromzangenmodus kann positiver oder negativer Strom eingespeist werden, um die Membranspannung auf einer gewünschten Spannung zu halten. Für Kisspeptin-Neuronen setzen wir normalerweise Null-Strom-Injektion (I = 0), um die spontane Variation des Membranpotentials aufzuzeichnen.

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Representative Results

Um die möglichen Auswirkungen von humanem rekombinantem Wachstumshormon (hGH) auf die Aktivität von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen zu untersuchen, führten wir Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen in Hirnschnitten durch und untersuchten, ob dieses Hormon akute Veränderungen in der Aktivität von AVPV/PeN-Kisspeptin- undARH-Kisspeptin-Neuronen verursacht. In dieser Studie wurden adulte weibliche (Diestrus-Stadium) und männliche Kiss1-Cre/GFP-Mäuse36 verwendet. Für die Experimente wurden Gonaden-intakte Tiere ausgewählt, da die Eigenschaften ihrer hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen je nach Sexualsteroidspiegel variieren können 19,20. Obwohl es den Rahmen der vorliegenden Studie sprengen würde, Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu bewerten, verweisen wir den Leser für weitere Informationen auf Croft et al. und Frazão et al.19,20. Gentechnisch veränderte Tiere, wie Mäuse und Ratten, stellen spannende Werkzeuge für diese Art von Experimenten dar, da Zellen, die ein bestimmtes Gen oder eine selektiv induzierte Ablation exprimieren, unter anderem durch ein fluoreszierendes Protein wie GFP identifiziert werden können23,26,36. Der Einsatz von genetisch veränderten Mäusen stellt einen Durchbruch im Verständnis der Kisspeptin-Neuronenaktivität dar.

Die aufgenommenen Neurone (26 Zellen von 12 Tieren) wurden anhand neuroanatomischer Merkmale35 und der Expression des endogenen GFP20 bestimmt. Im Current-Clamp-Modus wurden Neuronen unter I = 0 in Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration aufgezeichnet. Die AVPV/PeN-Kisspeptin-Neurone (12 Zellen von neun Tieren) wiesen einen mittleren RMP von -59,0 mV ± 3,0 mV (Bereich: -75 mV bis -46 mV), einen Eingangswiderstand von 0,9 ± 0,1 GΩ, einen wcc von 12,3 pF ± 1,6 pF und einen SR von 19,4 ± 1,9 mΩ auf. Unter den aufgezeichneten Neuronen zeigten drei von 12 AVPV/PeN-Kisspeptin-Zellen spontane Entladungen von Aktionspotentialen (APs) im Ruhezustand (0,1 Hz ± 0,06 Hz; der durchschnittliche RMP der spontan aktiven Zellen betrug -50,7 mV ± 2,7 mV). Der durchschnittliche RMP vonARH-Kisspeptin-Neuronen (14 Zellen von 12 Tieren) betrug -50,0 mV ± 1,5 mV (Bereich: -62 mV bis -39 mV), der mittlere Eingangswiderstand betrug 1,7 ± 0,1 GΩ, wcc 9,2 pF ± 0,7 pF und SR von 16,9 ± 1,7 mΩ. Die meistenARH-Kisspeptin-Neurone waren ruhend, wohingegen vier von 14 Zellen spontane APs im Ruhezustand zeigten (0,9 Hz ± 0,5 Hz; der durchschnittliche RMP der spontan aktiven Zellen betrug -52,7 mV ± 1,4 mV).

Die Verabreichung von hGH (20 μg/g) in das Bad induzierte eine signifikante Hyperpolarisation des RMP vieler der aufgezeichneten Neuronen, fünf von 12 AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen (≈55% der Zellen von 9 Mäusen) und neun von 14 aufgezeichneten ARH-Kisspeptin-Neuronen (≈65% der Zellen von 12 Mäusen, p = 0,0006, exakter Fisher-Test; Abbildung 3). Die hyperpolarisierten Neuronen AVPV/PeN Kisspeptin und ARHKisspeptin veränderten signifikant den RMP im Vergleich zu den nicht ansprechenden Zellen (Abbildung 3B,E; Mann-Whitney-Test). Den Effekten auf den RMP (Abbildung 3C,F; ANOVA mit wiederholten Messungen und Tukey's Post-Test) folgte eine signifikante Verringerung des Ganzzell-Eingangswiderstands (IR) auf AVPV/PeN-Kisspeptin (0,9 ± 0,1 GΩ auf 0,7 ± 0,1 GΩ während der hGH-Applikation, p = 0,02; Abbildung 3D) und auf ARH-Kisspeptin (1,7 ± 0,1 GΩ bis 1,0 ± 0,1 GΩ während der hGH-Anwendung, p < 0,0001; wiederholte Messungen der ANOVA und des Tukey-Posttests; Abbildung 3G) neuronen. Darüber hinaus nahm die Frequenz spontaner APs (fAPs) von hGH-hyperpolarisierten Neuronen in beiden Zellpopulationen ab (0,1 Hz ± 0,06 Hz bis 0,0 Hz ± 0,0 Hz bei AVPV/PeN-Kisspeptin und 1,0 Hz ± 0,5 Hz bis 0,2 Hz ± 0,1 Hz bei ARH-Kisspeptin-Neuronen). Das Ausmaß dieses Rückgangs erreichte jedoch keine statistische Signifikanz (p > 0,05, Mann-Whitney-Test). Nach der hGH-Auswaschung wurden RMP und IR wieder auf den Ausgangswert zurückgesetzt (Abbildung 3A,C,D,F,G). Die verbliebenen Kisspeptin-Neuronen reagierten nicht mehr auf die hGH-Verabreichung.

Wir haben bereits gezeigt, dass pGH keine Auswirkungen auf die Aktivität der hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen hat (siehe Silveira et al.25; Abbildung 3H). Bemerkenswert ist, dass hGH neben den GH-Rezeptoren auch Prolaktinrezeptoren (PRL) aktivieren kann37,38. Außerdem depolarisiert PRL indirekt nur ≈20% der AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen in Mäusen24. Im Gegensatz dazu moduliert PRL nicht die schnelle synaptische Übertragung derARH-Kisspeptin-Zellen 24. Daher scheint der hier beschriebene hGH-induzierte Hyperpolarisationseffekt unspezifisch zu sein. Die beobachteten Unterschiede können von Variablen wie der Wirkstoffkonzentration, dem Speziesunterschied (Mensch vs. Maus) oder sogar dem Vorhandensein von Salzen in der Zusammensetzung der verwendeten Arzneimittel abhängen, wie bereits berichtetwurde 28.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung, die den Beitrag der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik zum Wissen über die Aktivität der Kisspeptin-Neuronen zusammenfasst. Kisspeptin-Neurone (grün dargestellt) befinden sich in den anteroventralen periventrikulären und rostralen periventrikulären Kernen (AVPV/PeN) und im Nucleus arcuatus des Hypothalamus (ARH). Die AVPV/PeN-Kisspeptin- undARH-Kisspeptin-Zellen senden direkte Verbindungen zum Soma der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Neuronen im präoptischen Bereich (POA) und ihren Terminals an der medianen Eminenz (ME), was in der Modulation der Hypothalamus-Hypophysen-Achse (HPG) gipfelt. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Neuromodulatoren, wie z.B. Hormone, die Aktivität der AVPV/PeN-Kisspeptin- undARH-Kisspeptin-Neuronen differentiell modulieren. Mögliche Effekte auf das Ruhemembranpotential werden schematisch durch repräsentative Tracings demonstriert, die mit der Ganzzell-Bahnklemmentechnik und Stromzangenaufzeichnungen gewonnen wurden. Die rote Farbe zeigt an, dass ein spezifischer Neurotransmitter die Depolarisation des Ruhemembranpotentials (RMP) induziert17,22,24,26,28,29,30,31,32; Die blaue Farbe zeigt keine Auswirkung auf RMP 24,25,26,27,30 an. Die gestrichelte Linie zeigt den RMP an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Grundlegende Schritte, um die Versiegelung der interessierenden Zelle durch die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik zu erreichen. (A,B) Repräsentative Mikrofotografien von Hirnschnitten (250 μm) mit Kisspeptinzellen am anteroventralen periventrikulären Kern (AVPV) und am Nucleus arcuatus des Hypothalamus (ARH). Kisspeptin-Neurone wurden durch die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) identifiziert. (C) Mikrofotografie, die eine Mikropipette (mit Elektrolytlösung [interne Lösung]) nahe genug an der Zelle zeigt, um ein Grübchen in der Plasmamembran zu erzeugen, um die Versiegelung durchzuführen. (D,E) Ein leichter Unterdruck (Mundabsaugung an einem Schlauch, der an der Kopfstufe und der Mikropipette befestigt ist) ist erforderlich, um die Zellmembran mit der Mikropipette (D) zu versiegeln. Eine zweite Anwendung von Unterdruck (leicht und kurz) ist notwendig, um die Ruptur der Plasmamembran (E) zu induzieren. (F) Die Registrierung der Zellaktivität erfolgt durch einen mechanischen Aufbau, der für Patch-Clamp-Experimente verwendet wird. Nach dem Aufbrechen der Plasmamembran können Ströme, die durch die Ionenkanäle in der gepatchten Zelle fließen, durch eine Elektrode aufgezeichnet werden, die mit einem hochempfindlichen Verstärker verbunden ist. Ein Rückkopplungswiderstand erzeugt den Strom, der für die Aufzeichnung von Spannungszangen (G) oder Stromzangen (H) benötigt wird. Abkürzungen: 3V = dritter Ventrikel; ME = mittlere Eminenz. Maßstabsbalken: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Prüfung der Arzneimittelspezifität. (A) Repräsentative Stromzangenaufzeichnung, die zeigt, dass humanes rekombinantes Wachstumshormon (hGH) eine Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials (RMP) der Kisspeptin-Neurone induziert, die sich am Nucleus arcuatus des Hypothalamus befinden (ARHKisspeptin). (B-G) Balkendiagramme, die die durchschnittliche Änderung des Ruhemembranpotentials (RMP) (B,C,E,F) und des durchschnittlichen Eingangswiderstands (IR) (D,G) von hGH-responsiven Kisspeptin-Neuronen zeigen, die sich an den anteroventralen periventrikulären und rostralen periventrikulären Kernen (AVPV/PeN, Kisspeptin) (B-D) oder ARH (E-G) befinden). Repräsentative Stromklemmen-Aufzeichnungen, die zeigen, dass porcines Wachstumshormon (pGH) keine Wirkung auf den RMP von ARH-Kisspeptin-Neuronen induziert, wie zuvor berichtetwurde 25 (H). Die verwendeten Signifikanztests sind der Mann-Whitney-Test für (B) und (E) sowie die ANOVA mit Wiederholungsmessungen und der Tukey-Posttest für (C,D,F,G). Die gestrichelte Linie zeigt den RMP an. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Innere Lösung (100 ml)
Salz FW (g/mol) Konzentration Gewicht (g)
K-Gluconat 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1,0 mM 0.006
Kcl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5,0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1,0 mM 0.02
KOH 56.11 3,0 mM 0.017
ATP 507.18 4,0 mM 0.20
pH = 7,3 / Osmolarität = 275 - 280 mOsm

Tabelle 1: Reagenzien zur Herstellung der inneren Lösung. Die Tabelle enthält das Molekulargewicht (FW), die gewünschten Konzentrationen und das berechnete Gewicht der Salze für die Herstellung von 100 ml Lösung.

aCSF/Slicing-Lösung (250 ml)
Salz FW Konzentration Gewicht (g)
Saccharose 342.3 238 mM 18.5
KCL 74.5 2,5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1,0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
D-Glukose 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.037
pH = 7,3 / Osmolarität = 290 - 295 mOsm

Tabelle 2: Reagenzien zur Herstellung der Schneidlösung. Die Tabelle enthält das Molekulargewicht (FW), die gewünschten Konzentrationen und das berechnete Gewicht der Salze für die Herstellung von 250 ml Lösung. Das Gehirn wird in diese Lösung getaucht, um in Scheiben geschnitten zu werden.

aCSF für die Aufnahme (1 L)
Salz FW Konzentration Gewicht (g)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
KCL 74.5 3,5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1,25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1,2 mM 0.296
D-Glukose 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1,0 mM 0.148
pH = 7,3 / Osmolarität = 290-300 mOsm

Tabelle 3: Reagenzien zur Vorbereitung von aCSF für Aufzeichnungen. Die Tabelle enthält das Molekulargewicht (FW), die gewünschten Konzentrationen und das berechnete Gewicht der Salze für die Herstellung von 1 l Lösung.

Ergänzende Abbildung 1: Beispiel einer selbst hergestellten Rückgewinnungskammer. (A,B) Eine hauseigene Rückgewinnungskammer kann wie folgt hergestellt werden: Schneiden Sie eine 24-Well-Platte so zu, dass neun Wells zur Verfügung stehen. Kleben Sie ein Nylonsieb auf den Boden der neun Vertiefungen. Machen Sie mit dem Rest der Wellplatte eine Basis, so dass der untere Teil des Nylons frei ist. (C) Diese angepasste Basis kann in ein 500-ml-Becherglas gegeben werden, das künstliche zerebrospinale Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) enthält, die ständig mit Carbogen (95 % O2 und 5 % CO2) gesättigt ist. (D) Das Becherglas, in dem sich die Rückgewinnungskammer befindet, wird während des Versuchs im Wasserbad gehalten. (E,F) Mit einer Acryl-Transferpipette werden die Hirnschnitte in die Auffangkammer übertragen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Entwicklung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik hatte einen erheblichen Einfluss auf die wissenschaftliche Gemeinschaft, da sie als von größter Bedeutung für die Entwicklung der wissenschaftlichen Forschung angesehen wurde und mehrere Entdeckungen ermöglichte. Ihr Einfluss auf die Wissenschaft reichte aus, um 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin zu kulminieren, da diese Entdeckung die Tür zu einem besseren Verständnis der Funktionsweise von Ionenkanälen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen sowie zur Identifizierung potenzieller Ziele für Therapeutika öffnete 11,39,40,41 . In der Medizin war eine der herausragenden Erkenntnisse, die mit dieser Technik erzielt wurden, dass mehrere klinisch verwendete Substanzen direkt mit Ionenkanälen interagieren (z. B. Lokalanästhetika, Antiarrhythmika, Antidiabetika und Muskelrelaxanzien)42. Daher ist seine Anwendbarkeit in klinischen Instituten und Abteilungen der Grundlagenforschung offensichtlich. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die grundlegende Vorbereitung zur Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Experimenten an Hirnschnitten, die hypothalamische Kisspeptin-Neuronen enthalten. Wir skizzieren die grundlegenden Schritte und heben wichtige Parameter hervor, die kontrolliert werden müssen, um Gewebe zu gewinnen und Lösungen für die Patch-Clamp-Technik vorzubereiten. Dieser Artikel kann jedoch die Komplexität dieser Technik und die Mechanismen, die an jeder Art von Aufzeichnung, insbesondere der Analyse, beteiligt sind, nicht vollständig beschreiben. Für weiteres theoretisches Lernen werden einige Bücher und Rezensionen über die Patch-Clamp-Technik empfohlen 10,43,44,45,46.

Jede Lösung, die bei der Patch-Clamp-Methode verwendet wird, hat einen bestimmten Zweck. Daher müssen seine spezifischen Zusammensetzungen und Kriterien bei der Vorbereitung rigoros berücksichtigt werden. Zum Beispiel sollte die Zusammensetzung der inneren Lösung entsprechend dem Ziel des Experiments bestimmt werden, da sie je nach Art des zu messenden Stroms variiert. Die hier erwähnte chloridbasierte Lösung, in der Cl- (15 mM) die physiologische Konzentration des Zellzytoplasmas47 nachahmt, wird verwendet, um aktive und passive neuronale Eigenschaften oder Reaktionen auf synaptischen Input zu untersuchen. Es ist wichtig zu betonen, dass der Chloridgehalt in der inneren Lösung das Chloridgleichgewichtspotential auf einem optimalen Niveau für die Zellaufzeichnung hält (in der erwähnten Lösung ECL liegt er bei etwa -59 mV). Die intrazelluläre Chloridkonzentration kann abgeschätzt werden, indem das Umkehrpotenzial für GABA-induzierten Strom (EGABA) bewertet wird, wobei davon ausgegangen wird, dass der gesamte Strom durchden GABA-A-Rezeptor von Cl-21,48 übertragen wird. Für die Untersuchung von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen muss berücksichtigt werden, dass die intrazelluläre Cl-Konzentration für ARH-Kisspeptin höher ist als für AVPV/PeN-Kisspeptin-Zellen 21. Diese Eigenschaft muss bei der Planung eines Experiments berücksichtigt werden. Es wird empfohlen, die Osmolarität der inneren Lösung für Aufnahmen um mindestens 5 % niedriger zu sein als die von aCSF, um einen Verlust der Versiegelung aufgrund möglicher Schwellungen und/oder Zellschwächung zu vermeiden33,47. Wenn es notwendig ist, der inneren Lösung eine intrazelluläre Verbindung zuzusetzen, die als Zellmarker verwendet werden kann, wie z. B. Biocytin oder ein intrazellulärer Farbstoff (z. B. Alexa Fluor 594), können die K+-Spiegel gesenkt werden, so dass die Osmolarität konstant aufrechterhalten werden kann 20,47,49,50.

Eine schnelle Dissektion des Gehirns und die Aufrechterhaltung einer niedrigen Temperatur (0-2 °C) während des Schneidens mit einer geeigneten Schneidelösung sind von entscheidender Bedeutung. Die Schneidelösungen können je nach Art der zu bewertenden Zelle und/oder Gehirnregion unterschiedlichsein 33,47. Die aCSF-Lösung, die zur Gewinnung der Hirnschnitte verwendet wird (d. h. die Schneidlösung), hat in der Regel eine andere Zusammensetzung als die aCSF für Aufzeichnungen (zum Vergleich siehe Tabelle 2 und Tabelle 3). Die Kationenkonzentrationen (Ca 2+ und Mg2+) können angepasst werden, um die Erregbarkeit von Neuronen zu modifizieren, was sich auch auf die Feuerschwelle und die Freisetzung von Neurotransmitternauswirken kann 47. Medien mit niedrigem Ca 2+ und hohem Mg2+ werden häufig zur Minimierung möglicher exzitotoxischer Prozesse verwendet (weitere Informationen finden Sie unter51). Darüber hinaus können Medien mit niedrigem Ca 2+ und hohem Mg2+ die Aktivität hypothalamischer Neuronen stimulieren52. In Bezug auf den aCSF für Aufnahmen sind einige Eigenschaften ähnlich. Das Puffersystem basiert auf NaHCO3, hohe NaCl-Konzentrationen (im Allgemeinen >100 mM) und niedrige KCl-Konzentrationen (im Allgemeinen <5 mM), relative Konzentrationen von Ca 2+ und Mg2+ (häufig wird 2:1 verwendet) liegen in der Regel bei etwa 2 mM, und die Glukosespiegel können zwischen 1 und 10 mMliegen 47. Neben Variationen der Osmolarität, des pH-Werts oder der Temperaturänderungen der Lösungen (digital gesteuert auf 30-32 °C) ist es wichtig zu betonen, dass während des Versuchsprotokolls andere Probleme auftreten können, die das Experiment erheblich beeinträchtigen. Elektrophysiologische Messungen müssen während der Aufzeichnungen stabil sein, und alle Abweichungen müssen kritisch bewertet werden. Zum Beispiel erklären SR-Veränderungen den zellulären Zugang im Ganzzellmodus und haben erhebliche Auswirkungen auf gemessene Ströme und Potenziale. Darüber hinaus ist es wichtig zu betonen, dass eine relevante Einschränkung im Zusammenhang mit der Patch-Clamp-Methodik, die berücksichtigt werden muss, die mechanische Überstimulation der Zelle durch übermäßige Saug-/Druckprotokolle ist, die morphologische und funktionelle Veränderungen hervorrufen können53. Diese Verzerrung ist in Protokollen, in denen die Absaugung über den Mund und nicht über ein Gerät erfolgt, das die angewendete Saugintensität präzise steuern kann, oft schwer zu kontrollieren. Darüber hinaus können gewebebezogene Probleme, die mit einem hohen Prozentsatz der Zellmortalität gipfeln, aufgrund unzureichender Präparation, Hypoxie oder des Gesundheitszustands der Maus auftreten, den ein Forscher durch Beobachtung nicht identifizieren kann.

Der Hauptvorteil der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik ist die Möglichkeit, Neuronen in bestimmten Gehirnregionen von Interesse präzise aufzuzeichnen. Diese Technik hat enorm von der Schaffung genetisch veränderter Tiere profitiert. Unsere Gruppe arbeitet typischerweise mit einem Mausmodell, das die hrGFP unter dem Kiss1-Genpromotor exprimiert, oder mit einem anderen, das die Cre-Rekombinase unter dem Kiss1-Genpromotor und GFP unter der Cre-bedingten Expression exprimiert. Heutzutage gibt es jedoch viele validierte Tiermodelle23,26,36. Darüber hinaus stellt das Fehlen der Blut-Hirn-Schranke und die Tatsache, dass die extrazelluläre und intrazelluläre Umgebung leicht kontrolliert und manipuliert werden kann, Vorteile dieser Methode dar; Sie stellen jedoch nicht unbedingt einen physiologischen Zustand dar. Unter den Einschränkungen dieser Technik im Vergleich zu In-vivo-Präparaten oder anderen Aufzeichnungsarten, die darauf abzielen, die zytoplasmatische Ionenkonzentration zu erhalten, wie z. B. On-Cell- oder Perforated-Patch-Aufzeichnungen, ist es wichtig zu erwähnen, dass die Invasivität der Ganzzellkonfiguration eine Dialyse des Zytoplasmainhalts verursacht54. Die Dialyse kann zur Unterbrechung molekularer Aspekte führen, die für die Entwicklung oder Expression einiger Phänomene erforderlich sind. Bei der Aufzeichnung aus Schichten muss berücksichtigt werden, dass die meisten Projektionen der Neuronen geschnitten sind. Daher liegt es außerhalb des Anwendungsbereichs der Technik, zu bewerten, wie stark sich diese Störung auf die beobachteten Effekte oder einen physiologischen Zustand auswirkt. Wie bereits erwähnt, werden in der Regel koronale Hirnschnitte von 200-300 μm durchgeführt, um die Aktivität der hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen 17,19,20,21,34 zu untersuchen. Die Beschränkung der Verwendung eines dickeren Hirnschnittabschnitts zur Untersuchung von Kisspeptin-Zellen und unterschiedlichen Schnittwinkeln, die eine spezifische AVPV/PeN- oder ARH-Konnektivität aufrechterhalten55, muss weiter untersucht werden. Darüber hinaus basieren mehrere Studien auf dem Medikament EC50 (falls bekannt) oder auf veröffentlichten Daten, die zeigen, dass eine bestimmte Konzentration bei der Aktivierung der Feuerrate oder der Änderung des [Ca2+]i-Spiegels wirksam ist, indem die Wirkung eines Hormons/Medikaments, synthetisch oder nicht, auf den RMP eines Neurons getestet wird. Man sollte sich jedoch der Zusammensetzung/Spezifität des in den Experimenten zu verwendenden Arzneimittels bewusst sein, da es möglich ist, dass gereinigte synthetische Drogen im Vergleich zu anderen ähnlichen Arzneimitteln antagonistische Wirkungen haben können28. Wie bereits25 gezeigt wurde, induziert das gereinigte pGH zwar keinen Einfluss auf die Aktivität der hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen, das hGH lieferte jedoch umstrittene Daten (siehe Abbildung 3). Ähnliche Ergebnisse zeigten sich bei der Beurteilung der Insulinwirkung auf die ARH28. Daher sollte bei der Planung eines Experiments und der Interpretation der erzielten Ergebnisse die Arzneimittelspezifität berücksichtigt werden.

Die Patch-Clamp-Technik ist ein hervorragendes Werkzeug, um Daten über die elektrische Aktivität von Neuronen zu erhalten, und hat wesentlich zum Wissen mehrerer neuronaler Populationen, wie z.B. der Kisspeptin-Neuronen, beigetragen. Die meisten der hier gemachten Angaben werden im Allgemeinen für Aufnahmen von hypothalamischen Neuronen verwendet, wie wir bereits berichtet haben 25,50,56,57,58,59,60. Wichtig ist, dass man für die Aufzeichnung anderer neuronaler Populationen neben Kisspeptin-Neuronen die elektrophysiologischen Messungen kennen oder bestimmen muss, die bei der Identifizierung von Zelltypen helfen können, wie z. B. Zellkapazität, SR, Eingangswiderstand, Zellfeuermuster und andere Parameter. Diese Eigenschaften variieren zwischen verschiedenen Gehirnzellen, Gehirnkernen und physiologischen oder induzierten Bedingungen, wie z. B. zirkulierenden Sexualsteroidspiegeln 16,19,20,21,61, die die kritische Analyse der Ergebnisse erheblich beeinträchtigen können. Darüber hinaus ist es notwendig, die möglichen Variablen zu verstehen, die bei der Gewebepräparation eine Rolle spielen, und die damit verbundenen Vorteile und Einschränkungen, um mit dieser Technik zu arbeiten. Alle hier beschriebenen Schritte müssen mit Bedacht durchgeführt werden, da jede Änderung der am Protokoll beteiligten Variablen die Ergebnisse drastisch beeinträchtigen kann.

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Disclosures

Es müssen keine Interessenkonflikte deklariert werden.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der São Paulo Research Foundation [FAPESP-Fördernummern: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); und von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Hypothalamische Kisspeptin-Neurone als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen
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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

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