Summary
We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.
Abstract
Fluorescerende genetisch gecodeerde calciumindicatoren hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van neurale dynamica van het niveau van individuele neuronen tot hele hersencircuits. Neurale reacties kunnen echter variëren als gevolg van eerdere ervaring, interne toestanden of stochastische factoren, waardoor de behoefte aan methoden ontstaat die de neurale functie bij veel individuen tegelijk kunnen beoordelen. Terwijl de meeste opnametechnieken een enkel dier tegelijk onderzoeken, beschrijven we het gebruik van breedveldmicroscopie om neuronale opnames op te schalen naar tientallen Caenorhabditis elegans of andere organismen op submillimeterschaal tegelijk. Open-source hardware en software bieden grote flexibiliteit bij het programmeren van volledig geautomatiseerde experimenten die de intensiteit en timing van verschillende soorten stimulus regelen, waaronder chemische, optische, mechanische, thermische en elektromagnetische stimuli. In het bijzonder bieden microfluïdische stroomapparaten nauwkeurige, herhaalbare en kwantitatieve controle van chemosensorische stimuli met een tijdsresolutie van minder dan een seconde. De NeuroTracker semi-geautomatiseerde data-analysepijplijn extraheert vervolgens individuele en populatiebrede neurale reacties om functionele veranderingen in neurale prikkelbaarheid en dynamiek te ontdekken. Dit artikel presenteert voorbeelden van het meten van neuronale aanpassing, temporele remming en stimulus crosstalk. Deze technieken verhogen de precisie en herhaalbaarheid van stimulatie, maken de verkenning van populatievariabiliteit mogelijk en zijn generaliseerbaar naar andere dynamische fluorescerende signalen in kleine biosystemen van cellen en organoïden tot hele organismen en planten.
Introduction
Calciumbeeldvormingstechnieken hebben de niet-invasieve registratie van in vivo neurale dynamiek in realtime mogelijk gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in doelcellen 1,2,3. Deze sensoren gebruiken meestal een groen fluorescerend eiwit (GFP), zoals de GFP-calmodulin-M13 peptide (GCaMP) familie, om de fluorescentie-intensiteit te verhogen bij neuronale activering en verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Calciumbeeldvorming is vooral krachtig geweest in de nematode C. elegans voor het onderzoeken hoe neuronen en neurale circuits functioneren in levende, zich gedragende dieren 4,5,6,7,8,9,10, omdat hun transparante aard betekent dat er geen chirurgisch proces nodig is voor optische toegang, en celspecifieke genpromotors richten zich op expressie naar de cellen van belang. Deze technieken maken vaak gebruik van microfluïdische apparaten, die nauwkeurig gecontroleerde omgevingen bieden om biologische, chemische en fysische verschijnselen op kleine fysieke schaal te bestuderen11,12. Microfluïdische apparaten zijn er in overvloed voor het meten van neurale activiteit, met nieuwe ontwerpen die voortdurend in ontwikkeling zijn, en ze worden gemakkelijk vervaardigd in het onderzoekslaboratorium. Veel ontwerpen vangen echter één dier tegelijk, waardoor de experimentele doorvoer 7,9,13 wordt beperkt. Neurale reacties variëren vaak aanzienlijk tussen dieren als gevolg van verschillen in eerdere ervaring, interne toestanden zoals stress of honger, of stochastische factoren zoals genexpressieniveaus. Deze verschillen creëren een behoefte aan methoden die tegelijkertijd veel dieren kunnen stimuleren en observeren en informatie van individuen kunnen extraheren4.
Bovendien worden bepaalde neuromodulerende verschijnselen alleen duidelijk onder specifieke stimulatieomstandigheden, zoals temporele remming14, die verwijst naar de korte onderdrukking van reacties wanneer stimulatie snel achter elkaar plaatsvindt. Elektrofysiologische systemen kunnen voor dit doel neurale activiteit over een brede stimulusruimte sturen, waarbij bijvoorbeeld de elektrische pulsstroom, spanning, frequentie, golfvorm, duty cycle en timing van periodieke stimulustreinen worden gemoduleerd. Indirecte stimulatie door natuurlijk gedetecteerde stimuli of optogenetische systemen zou baat hebben bij een vergelijkbare breedte van controlemechanismen. Momenteel worden veel natuurlijke stimuli gepresenteerd op een eenvoudige "aan-uit" manier, zoals geurpresentatie en -verwijdering, met behulp van commerciële systemen die traag zijn geweest om flexibiliteit toe te voegen. Goedkope microcontrollers kunnen nu echter de levering van verschillende soorten stimuli automatiseren op een manier die kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. In combinatie met microfluïdica hebben deze systemen het doel bereikt van verhoogde experimentele doorvoer en flexibiliteit, waardoor neurale reacties op een verscheidenheid aan nauwkeurige stimuli tegelijkertijd kunnen worden gemeten bij veel dieren 4,6. Multimodale stimulatie kan worden gebruikt om het neuronale circuit verder te ondervragen, bijvoorbeeld door veranderingen in neurale prikkelbaarheid te volgen bij consistent stimuleren voor, tijdens en na een orthogonale verstoring zoals blootstelling aan geneesmiddelen4. De voordelen van goedkope, open microscopiesystemen zijn duidelijk voor het bevorderen van wetenschappelijk onderzoek, maar in de praktijk kan de behoefte aan onderdeelinkoop, constructie en prestatievalidatie de adoptie van deze technieken belemmeren.
Dit protocol is bedoeld om een aantal van deze technische uitdagingen te verlichten. Terwijl eerdere protocollen zich richtten op het gebruik van microfluïdische apparaten en basisstimulatie 9,15,17, beschrijven we hier de constructie en het gebruik van een flexibel, geautomatiseerd, multimodaal stimulusafgiftesysteem voor neurale beeldvorming in C. elegans of andere kleine organismen met behulp van eerder beschreven microfluïdische apparaten4. Het open-source systeem is geprogrammeerd via eenvoudige tekstbestanden om de experimenten te definiëren, en het NeuroTracker data-analyseprogramma extraheert semi-automatisch de neurale activiteitsgegevens uit de microscoopvideo's. We demonstreren dit systeem met voorbeelden van het beoordelen van temporele remming, ontremming en stimulus crosstalk met behulp van het chemosensorische neuron AWA, dat depolariseert als reactie op verschillende voedselgeuren of als reactie op licht bij het tot expressie brengen van optogenetische lichtgevoelige ionkanalen 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Neurale beeldvormingsapparatuur
OPMERKING: Zie Lawler en Albrecht15 voor gedetailleerde instructies over het bouwen van het beeldvormings- en stimulatiesysteem, dat de timing van de microscoopverlichting, beeldacquisitie en stimulusafgifte regelt (figuur 1). Een goedkope Arduino Nano-stimulusregelaar bedient de vloeistofkleppen via digitale signalen naar een klepregelaar en regelt de optogenetische verlichting via analoge spanningssignalen naar een LED-controller. Andere prikkels, zoals trilmotoren en thermische verwarmers, kunnen worden aangestuurd met behulp van digitale of analoge signalen. De stimuluscontroller synchroniseert de stimulatie en beeldopname via camerasignalen, zoals gespecificeerd door de open-source Micro-Manager microscoopbesturingssoftware (μManager)16. Zie de Tabel met materialen voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia, apparatuur en organismen die in dit protocol worden gebruikt.
- Stel de neurale beeldvormingsapparatuur in, waaronder een epifluorescentiemicroscoop met GFP-optica, een sCMOS-camera met een digitaal blootstellingsuitgangssignaal en een stimuluscontroller15.
- Sluit de stimulusregelaar aan op de gewenste systemen via digitale of analoge signalen. Voor de onderstaande voorbeelden worden de volgende systemen gebruikt:
- Gebruik een klepregelaar voor chemische stimulatie. Sluit de klepregelaar aan op fluidic solenoïde of knijpventielen (figuur 1)15.
- Gebruik een 615 nm rode LED en controller voor optogenetische stimulatie, gemonteerd boven het microscoopstadium.
- Stel de computer in met de microscoopbesturingssoftware, maak een configuratievoorinstelling met apparatuurinstellingen en zorg voor een goede werking van de stimulusregeling15.
2. Fabricage van microfluïdische apparaten
OPMERKING: Zie Lagoy et al.17 voor gedetailleerde informatie over het verkrijgen of fabriceren van de hoofdmallen en de productie, het gebruik en de reiniging van de microfluïdische apparaten. Deze stappen worden hieronder samengevat.
- Verkrijg of fabriceer een mastermal met behulp van het meegeleverde microfluïdische ontwerpbestand (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. Voor jongvolwassen C. elegans, zorg ervoor dat de kanaalhoogte 55-70 μm is.
- Combineer de PDMS-basis en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10:1 en meng grondig met transferpipetten.
- Ontgast gedurende 30-60 minuten in een vacuüm exsiccator totdat de bubbels verdwijnen.
- Plaats de hoofdvorm in een grote petrischaal (150 mm diameter) en giet het ontgaste PDMS tot een diepte van 4-5 mm (~ 100 g). Inspecteer en verwijder stof of bubbels met een transferpipet.
- Bak op 65 °C op een vlakke ovenplank gedurende 3 uur tot een nacht.
- Eenmaal uitgehard, gebruik een scalpel om het PDMS uit de mal te snijden en een recht scheermesje om de apparaten te scheiden.
- Pons inlaat- en uitlaatgaten met een dermale pons van 1 mm en reinig ze met dH 2O, ethanol en opnieuw met dH2O. Droog het apparaat in een luchtstroom (zie figuur 2A).
- Reinig beide zijden van het PDMS-apparaat met plakband en verwijder stof of vuil.
- Bereid de glasglaasjes voor om het microfluïdische apparaat te voltooien zoals beschreven17. Boor inlaatgaten in de bovenste dia met behulp van een diamantbit en maak de onderste dia hydrofoob door blootstelling aan TFOCS-dampen of door waterafstotende glasbehandeling toe te passen (figuur 2B).
- Monteer de sandwich van het glazen PDMS-apparaat in een klem (figuur 2C).
3. Voorbereiding van dieren
- Verkrijg of creëer dieren met genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in de neuronen van belang.
OPMERKING: Bijvoorbeeld lijn NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) drukt GCaMP en het roodlichtgevoelige kationkanaal Chrimson uit in het AWA-sensorische neuronenpaar6. Beide transgenen zijn geïntegreerd in het genoom voor stabiele expressie in elk dier. - Plaats een dag voor het experiment ten minste 20 L4 larvale stadium C. elegans per experiment op een nematodengroeimedium (NGM) agarplaat bezaaid met een OP50 E. coli-gazon. Wanneer dit op 20 °C wordt gehouden, worden de wilde dieren de volgende dag in het jongvolwassen stadium gesynchroniseerd.
OPMERKING: Kies voor arraytransgenen dieren met behulp van een fluorescentiestereoscoop om transgenexpressie bij de gekozen dieren te garanderen.
4. Bereiding van de oplossing
- Bereid 1x S Basale buffer (100 mM NaCl en 0,05 M KPO4, pH 6,0) uit een 10x stockoplossing.
- Bereid 1 mM tetramisole buffer door 1 M bouillon te verdunnen in 1x S Basal. Gebruik deze verlammende buffer om alle prikkels voor te bereiden. Een experiment gebruikt meestal ongeveer 150 ml.
- Voeg 0,1-1 μg/ml fluoresceïne toe aan de "controle" bufferreservoirs om de stroming te visualiseren.
- Creëer stimulusoplossingen door seriële verdunning tot de gewenste eindconcentratie. Maak bijvoorbeeld een 10−7 verdunning van diacetyl lokstof door eerst een 10−3 voorraad te maken.
OPMERKING: Een kleine hoeveelheid fluoresceïne (0,1-1 μg / ml) kan aan de stimulus- of bufferoplossing worden toegevoegd om de timing van de stimulus te controleren, maar de concentratie moet minimaal zijn om artefacten in neurale fluorescentie te voorkomen.
5. Voorbereiding van microfluïdische apparaten
OPMERKING: Zie Reilly et al.9 voor een videoprotocol met de reservoirgeneratie, apparaatinstellingen en het laden van de dieren. Zie ook Lagoy et al.17 voor een geschreven protocol met veel nuttige tips.
- Bereid drie of meer vloeistofreservoirs voor. Bevestig voor elk een spuitreservoir van 30 ml of 60 ml, een aanzuigspuit van 3 ml en een naaldstomp op een drieweg Luer-klep (figuur 2D). Sluit de naald aan op microbore buizen die aan het uiteinde zijn voorzien van een metalen buis. Label de reservoirs, monteer ze op een rek dat aan een ringstandaard is bevestigd en vul ze met de bijbehorende buffer of stimulusvloeistoffen (figuur 2E).
- Ontgast het geassembleerde microfluïdische apparaat in een vacuüm exsiccator gedurende ~ 1 uur.
- Vul en verwijder de luchtbellen uit de reservoirslang met behulp van de primingspuit. Vul de uitstroomslangen met buffer.
- Verwijder het microfluïdische apparaat uit het vacuüm en plaats snel de uitlaatslang en injecteer de vloeistof door het apparaat totdat er een druppel uit één inlaat komt.
- Gebruik bij deze inlaat een "drop-to-drop" -aansluiting17 om de overeenkomstige vloeistofinlaatbuis in te brengen (figuur 2F). Zorg ervoor dat er vloeistofdruppels aanwezig zijn op zowel de inlaatslang als het poortgat van het apparaat om te voorkomen dat er een bel wordt geïntroduceerd.
- Injecteer meer vloeistof uit de uitlaat, sluit de volgende inlaatbuis aan en herhaal dit totdat alle inlaten zijn gevuld. Plaats een stevige blokkeringspen bij ongebruikte inlaten en de wormlaadpoort.
- Start de stroming door de in- en uitlaatkleppen van Luer te openen. Inspecteer het apparaat op lekken bij de inlaten en de glazen basis. Inspecteer het apparaat op eventuele bellen in de stroomkanalen of inlaten met behulp van de microscoopbeeldopnamesoftware in de live-modus.
OPMERKING: Als er bubbels aanwezig zijn, wacht dan tot ze in het PDMS-materiaal zijn opgenomen.
6. Laden van dieren
OPMERKING: Zie Lagoy et al.17.
- Breng jongvolwassen dieren over op een niet-gezaaide NGM-agarplaat met behulp van een draadvormige "pick".
- Overspoel de plaat met ongeveer 5 ml 1x S Basale buffer zodat de dieren zwemmen.
- Zuig de wormen op in een laadspuit (1 ml of 3 ml spuit met aangehechte slang die is voorgevuld met 1x S Basal).
- Beweeg met behulp van een stereoscoop het uiteinde van de slang met één hand onder het vloeistofoppervlak naar elk gewenst dier en trek het in de slang met behulp van de spuit in de andere hand.
- Trek de wormen alleen in de slang, niet in de spuit.
OPMERKING: De slang bevat meestal slechts ongeveer 100 μL. De dieren kunnen in een lokaal gebied worden verdreven en vervolgens met een klein volume weer in de buis worden getrokken.
- Sluit de uitlaatleiding, verwijder de wormlaadpen en sluit de wormlaadspuit aan op het apparaat met behulp van een drop-to-drop-verbinding.
- Laat de dieren voorzichtig in de arena stromen, stel een bufferstroom in en laat tot 1 uur immobilisatie door tetramisol toe.
OPMERKING: Zorg er tijdens de immobilisatieperiode voor dat alleen buffervloeistof de arena binnenkomt. De stimulus- en controlereservoirs kunnen tijdens deze periode worden uitgeschakeld, maar open ze en controleer de juiste stroom voordat de stimulatieproeven worden uitgevoerd.
7. Geautomatiseerde stimulatie en neuronale opname
- Maak een tekstbestand met stimulusdefinities met de naam "User Defined Acquisition Settings.txt" met een teksteditor (bijv. Kladblok) met de stimulatie-instellingen voor de geautomatiseerde beeldacquisitie (zie voorbeelden in afbeelding 3). De instellingen zijn verdeeld in twee secties:
- Microscoop acquisitie instellingen: Definieer het experimenttype (Single-Stimulus of Multi-Pattern), de belichtings- en excitatietiming, de duur en intervallen van de studie en sla de map op.
- Stimulatie instellingen: Definieer de parameters voor stimuluscontrole. Een "stimulatiecommando" specificeert de acties die plaatsvinden bij bepaalde videoframes met de syntaxis
, waarbij de lettercodes A = klep1, B = klep2, C = klep3, L = LED-licht zijn; Bovendien zijn hoofdletters = aan en kleine letters = uit. De LED-intensiteit wordt ingesteld met de lettercode "i" en een waarde van 0 (uit) tot 255 (maximale helderheid).
OPMERKING: De LED-intensiteitswaarde van 0 tot 255 stelt de analoge uitgangsspanning in van 0 V tot 5 V. De huidige controller die hier wordt gebruikt, heeft een lineaire intensiteitsschaling en andere moeten worden gekalibreerd met een lichtvermogensmeter.- Voor een single-stimulus-experiment met slechts één herhaalde stimulatieopdracht gebruikt u de indeling in figuur 3A.
- Voor een multipatroonexperiment met meerdere stimulatieopdrachten gebruikt u de indeling in afbeelding 3B. Neem een "patroonreeks" van cijfers op die de volgorde van de stimuluspatronen vertegenwoordigt. Voer voor elk patroon een stimulatieopdracht in op een afzonderlijke regel.
OPMERKING: Een pseudorandomsequentie of m-sequentie kan nuttig zijn om de afhankelijkheid van de stimulusgeschiedenis te onderzoeken.
- Voer de microscoopbesturingssoftware uit. Controleer of alle vloeistofinlaten open zijn, de stroming naar wens is binnen de arena (zie figuur 2H) en de neuronen van belang in focus zijn binnen het live-venster.
- Sluit het live venster en voer het script "MultiPattern_RunScript.bsh" uit in de software.
OPMERKING: Het is nuttig om een testexperiment uit te voeren zonder dieren om de juiste doorstroming en stimulatie te verifiëren. Het vervangen van een andere fluoresceïneconcentratie voor elke stimulusvloeistof kan helpen bij het visualiseren en documenteren van nieuwe stimuluspatronen. - Demonteer na het experimenteren het microfluïdische apparaat en spoel alle oppervlakken, slangen en reservoirs af met water.
OPMERKING: Alle componenten kunnen tientallen keren worden hergebruikt als ze schoon worden gehouden. Zorg ervoor dat reservoirs, slangen en microfluïdische apparaten nat of volledig gedroogd in een luchtstroom worden gehouden om zoutkristallisatie te voorkomen, die kan verstoppen en moeilijk te verwijderen is. De apparaten kunnen in ethanol worden bewaard om te steriliseren, maar moeten volledig worden gedroogd voordat ze opnieuw worden gebruikt (>1 uur bij 65 °C)17.
8. Data-analyse met NeuroTracker
OPMERKING: NeuroTracker 4,18,19 is een ImageJ/FIJI20 software plugin voor het volgen van de fluorescentie-intensiteit van meerdere neuronen en dieren, zelfs als ze bewegen tijdens proeven. Deze plug-in slaat gegevens op als tekstbestanden met de positie van elk neuron en de achtergrondgecorrigeerde fluorescentie-intensiteit (F). De fluorescentiegegevens worden genormaliseerd naar de basislijnfluorescentie (F 0), bijvoorbeeld het gemiddelde van enkele seconden voorafgaand aan stimulatie, als Δ F / F 0 = (F -F 0) / F 0, die kan worden gemiddeld over populaties.
- Installeer NeuroTracker-scripts volgens de instructies (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- Voer NeuroTracker uit door op Plug-ins | Traceren | Neurotracker.
- Selecteer de map met de . TIF-videobestanden die moeten worden gevolgd en selecteer de gewenste instellingen.
OPMERKING: Als alleen een subset van de videobestanden moet worden bijgehouden, selecteert u het numerieke bereik van de bestanden die u wilt analyseren bij de prompt. Standaard trackinginstellingen zijn geschikt voor niet-beweeglijke dieren met een resolutie van 250 pix/mm. Pas de parameters proportioneel aan voor andere resoluties. Raadpleeg de gebruikershandleiding19 voor meer informatie over de instellingen. - Stel de intensiteitsdrempel zo in dat de neuronen zichtbaar zijn voor selectie (figuur 4).
- Open de vensters Helderheid/contrast (B/C) en Drempel met behulp van de afbeelding | Pas het menu aan.
- Pas in het B /C-venster de schuifregelaars Minimum en Maximum aan totdat de neuronen duidelijk te onderscheiden zijn (Figuur 4A).
- Schakel in het venster Drempel de optie Donkere achtergrond en Bereik niet opnieuw instellen in.
- Schuif de frameschuifregelaar om de beweging en intensiteitsveranderingen van het neuron te observeren en noteer dieren die moeten worden uitgesloten van tracking, bijvoorbeeld vanwege overlap met andere dieren.
- Identificeer de neuronen voor tracking.
- Pas voor elk dier het drempelniveau zodanig aan dat het rode drempelgebied boven het neuron zichtbaar is in elk frame voor, tijdens en na stimulatie.
- Klik op het neuron om de positie en het drempelniveau vast te leggen.
- Herhaal de drempelaanpassing en selectie voor elk dier en neuron om te volgen. Zie figuur 4C voor een goed voorbeeld van het drempelniveau en figuur 4D,E voor voorbeelden van over- en onderdrempel. Eerder geselecteerde neuronen worden aangegeven door een klein vakje.
- Wanneer alle neuronen zijn geselecteerd, drukt u op de spatiebalk om te beginnen met volgen.
OPMERKING: Voor aanvullende NeuroTracker-voorbeelden, zie eerdere referenties 4,19. - Controleer het volgproces voor elk dier en breng de nodige correcties aan.
- Als NeuroTracker pauzeert, is het neuron kwijt. Klik opnieuw op het neuron en pas het drempelniveau indien nodig aan.
- Als het integratievak naar een ander dier of een niet-neuronale structuur in de buurt springt, drukt u op de spatiebalk om te pauzeren, verplaatst u de schuifregelaar terug naar het eerste foutieve frame en klikt u opnieuw op de juiste neuronlocatie.
9. Dataverkenning en visualisatie
OPMERKING: Het MATLAB-analysescript wordt gebruikt voor gegevensverwerking en visualisatie en om samenvattende PDF's voor elke analyse te genereren.
- Voer het bestand "NeuroTrackerSummary_pdf.m" uit in MATLAB en selecteer de map met de tekstbestanden van de NeuroTracker-gegevens.
- Wacht tot er een samenvattende PDF is geproduceerd, zodat het trackingproces kan worden geverifieerd (figuur 5). Dieren worden geïdentificeerd door een getal (figuur 5A) en de neurale reacties van elk dier en elk onderzoek kunnen worden bekeken om de populatievariabiliteit te beoordelen (figuur 5B).
- Gebruik de functie "databrowse.m" om de neurale gegevens te verkennen, bijvoorbeeld groeperen op proefnummer (figuur 5C), op diernummer (figuur 5D), op stimulatiepatroon of op een andere categorie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We presenteren verschillende voorbeelden van stimuluspatronen die verschillende neurale verschijnselen beoordelen, waaronder temporele remming, aanpassing en ontremming. Temporele remming is de kortstondige onderdrukking van een neurale respons op een tweede stimuluspresentatie die kort na de eerste presentatie optreedt14. Om dit fenomeen te testen, werden in een paarpulsexperiment acht patronen gepresenteerd die bestonden uit twee 1 s odorantpulsen gescheiden door een interval variërend van 0 s tot 20 s (figuur 6B; zie figuur 3B voor het overeenkomstige stimuluscontrolebestand). De arena was opgezet met een enkele stimulusvloeistof (1,1 μM diacetyl), buffer en regelstroomslang, waarbij de ongebruikte inlaatpoort werd geblokkeerd met een vaste pin (figuur 6A). Door klep 1 in te schakelen, komt de regelvloeistof in de ctrl1-inlaat en verschuift de vloeistofstromen zodanig dat de stimulus de arena binnenkomt; wanneer klep 1 is uitgeschakeld, komt de regelvloeistof in de ctrl2-inlaat en stroomt de buffer door de arena (zie figuur 2G,H). Terwijl de eerste 1 s geurpuls een gelijke responsgrootte opwekte in de diacetyl-detecterende AWA-neuronen, varieerden de reacties op de tweede puls met het interstimulusinterval (figuur 6D). Voor pulsintervallen van minder dan 10 s was de tweede respons zwakker, wat het fenomeen van de temporele remming aantoont. Met behulp van deze experimentele opstelling bleek de verstoring van de dyneïnecomponent CHE-3 temporele remming te voorkomen, wat axonaal transport in dit fenomeen impliceert5.
Adaptatie is de geleidelijke afname van neurale reacties op herhaalde presentaties van dezelfde stimulus. Dit fenomeen kan worden veroorzaakt door verschillende processen, zoals actieve remming, die snel kan worden omgekeerd, of andere processen die langzaam omkeren. Een experiment om snelle reversibiliteit te beoordelen is een "catch" -proef, waarbij één stimulus wordt herhaald om aanpassing vast te stellen, gevolgd door een "afwijkende" of nieuwe stimulus en vervolgens een terugkeer naar de oorspronkelijke stimulus. Ontremming wordt waargenomen als de neurale reacties toenemen na de nieuwe "ontremmende" stimulus. Figuur 7 toont een voorbeeld met behulp van twee geurstoffen, diacetyl en 2-methylpyrazine (2-MP), gedetecteerd door de AWA chemosensorische neuronen via verschillende receptoren4. Twee stimulusreservoirs en slangen werden verbonden met het microfluïdische apparaat, met een extra drieweg knijpklep om te bepalen welke stimulus de arena binnenkomt (figuur 7A). De stimuluspatronen werden gedefinieerd om chemische pulsen gedurende 4 s te presenteren via klep 1 voor alle 30 onderzoeken en om te kiezen tussen stimulus S1 of S2 via klep 3, die werd ingeschakeld na de 25e proef en uit na de 26e (figuur 7B). Deze opstelling zorgde ervoor dat de verschillende prikkelvloeistoffen voldoende tijd hadden om door het microfluïdische apparaat te stromen voordat ze aan de dieren werden gepresenteerd. Aanpassing werd waargenomen aan de diacetylstimulus, maar de presentatie van de nieuwe 2-MP-stimulus veroorzaakte geen sterk ontremmingseffect (figuur 7C).
Optogenetische stimulatie maakt gebruik van licht om neuronen te activeren via lichtgevoelige ionkanalen. Hoewel het handig is om te gebruiken, omzeilt optogenetische activering sensorische receptoren en sommige regulerende routes, dus sommige neurale verschijnselen kunnen verschillen in vergelijking met activering door natuurlijke stimuli. Om deze verschillen te testen, zijn multimodale experimenten nuttig voor het presenteren van verschillende soorten stimulatie binnen een enkel experiment. Neuronen die de channelrhodopsine-variant Chrimson tot expressie brengen, worden geactiveerd door blootstelling aan rood licht5. Om te beoordelen of de AWA-neuronen zich op dezelfde manier aanpassen aan chemische en optogenetische stimulatie, werd de NZ1091-stam die zowel Chrimson als GCaMP tot expressie bracht in de AWA-neuronen gedurende 14-28 uur op een plaat met de cofactor all-trans-retinal (ATR, 100 μM) gehandhaafd. Een rode LED van 615 nm verlichtte de microfluïdische arena van bovenaf (figuur 8A) en een reeks multimodale stimuluspatronen werd gegenereerd door 5 s-pulsen van diacetyl, rood licht of beide binnen dezelfde proef te geven (figuur 8B). Chemische stimulatie alleen veroorzaakte aanpassing, terwijl optische stimulatie alleen dat niet deed (figuur 8C). Het gecombineerde multimodale stimuluspatroon toonde echter aan dat optogenetische responsen gevoelig waren voor chemisch geïnduceerde aanpassing (figuur 8C,D). Deze experimenten suggereren dat aanpassing wordt geïnitieerd op sensorische receptoren of dendritische processen, maar de effecten ervan verspreiden zich door het neuron.
Figuur 1: Schema van de neurale calciumopname- en stimulatieapparatuur. De microscoopbeeldopname, fluorescentie-excitatielicht en stimulatie worden bestuurd door een computer en een open-source Arduino-microcontroller. De chemische stimulatie in de microfluïdische arena schakelt tussen buffer B en stimulus S-oplossingen via regelvloeistofstroom C. De optionele systeemelementen worden aangegeven met een sterretje (*), zoals extra kleppen en optische of andere stimulatiemodaliteiten. De fluorescentiemicroscoopbeelden worden gebruikt om de neurale activiteit te meten via calciumtransiënten, bijvoorbeeld met behulp van de calciumindicator GCaMP. De stippellijnen vertegenwoordigen de elektrische verbindingen (digitaal of analoog), de gebogen lijnen zijn de vloeiende buizen en de rechte massieve pijlen zijn de optische lichtpaden. Afkorting: LED = light-emitting diode. Dit cijfer is aangepast van Lawler en Albrecht15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Montage en installatie van microfluïdische apparaten. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een (A) pdms-apparaat met micropatronen dat is ingeklemd tussen een (B) geboord glazen blad en een hydrofobe glazen basis en (C) geklemd. (D) De reservoirs zijn boven het apparaat geplaatst met een (E) buizenrekstandaard. De slangen van de reservoirs worden rechtstreeks op het apparaat aangesloten of via bediende kleppen voor vloeistofregeling. Het apparaat bevindt zich boven het objectief op de microscoop. (F) Close-upbeeld van het microfluïdische apparaat met alle slangen bevestigd in de inlaten, de wormlaadpoort en de uitlaat. (G) Schema van de microfluïdische inrichting van 20 mm x 20 mm. De zwarte lijnen vertegenwoordigen de 55-70 μm hoge vloeistofkanalen. Deze geometrie is ontworpen om een nauwkeurige spatiotemporale controle mogelijk te maken met een stimulusfront loodrecht op de stroming, terwijl de dieren binnen de arena en het gezichtsveld van de microscoop blijven. De bufferstroom en één stimulusstroom (of optioneel Stim2, indien gebruikt) stromen continu, terwijl slechts één regelvloeistofinlaat tegelijk stroomt en verschuift welke vloeistof de arena binnenkomt. (H) Wanneer klep 1 wordt geactiveerd, stroomt de regelvloeistof van de normaal gesloten poort naar de inlaat van de besturing1 en wordt de stimulus ingeschakeld en stroomt deze door de arena. Wanneer klep 1 is uitgeschakeld, stroomt er vloeistof van de normaal open poort naar de control2-inlaat en komt de buffer de arena binnen. De juiste stroombalans wordt getoond, met fluoresceïnekleurstof die wordt gebruikt als de stimulusvloeistof. Merk op dat een deel van de vloeistof die de arena binnenkomt het ook omzeilt via de bovenste en onderste gebogen kanalen. Deze stromen moeten smal zijn en een gelijke breedte hebben in de bovenste en onderste kanalen. De reservoirhoogtes kunnen naar behoefte worden aangepast. Afkortingen: PDMS = polydimethylsiloxaan; WL = wormbelasting; Buf = buffer; Stim1 = eerste Stimulus; Stim2 = tweede stimulus; NC = normaal gesloten; NEE = normaal open. Dit cijfer is aangepast van Lawler en Albrecht15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld stimulusdefinitiebestanden. (A) Voorbeeld van een enkelvoudig herhalend stimulusexperiment: een lichtpuls van 5 s bij intensiteit 200 van 2 s tot 7 s (frame 20 tot 70). (B) Voorbeeld van een multi-patroon stimulusexperiment met acht verschillende stimuluspatronen, overeenkomend met figuur 6. Twee chemische pulsen van 1 s worden gepresenteerd met een interval van 0 s tot 20 s ertussen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Selectie van neuronen en drempelniveaus in NeuroTracker . (A) Volledig microscoopgezichtsveld, met de helderheid en het contrast aangepast om de AWA-neuronen duidelijk te zien. (B) Vergrote weergave van het kopgebied van een dier met de integratiebox waaruit de fluorescentie-intensiteit wordt berekend en de achtergrond annulus voor achtergrondaftrek. (C) Geïntegreerde intensiteitsgrafiek met een robuuste neurale respons. (D) Een goede drempelselectie resulteert in een rood drempelgebied dat zich boven de parameter Min. Size en onder de parameter Max Size voor elk frame in de afbeeldingsstapel bevindt en geen nabijgelegen gebieden bevat, zoals darmautofluorescentie (zie paneel B). (E) Een te hoge drempel kan goed lijken wanneer het neuron actief is, maar wanneer het inactief is, kan het neuron verloren gaan. Het is daarom belangrijk om zowel het pre-stimulatie- als het poststimulatieframe te controleren bij het selecteren van een drempel. (F) Een te laag ingestelde drempel kan andere niet-neuronale structuren benadrukken. Over- of onderdrempelselectie kan ertoe leiden dat NeuroTracker het neuron verliest en pauzeert voor feedback van gebruikers om de drempel en neuronpositie te corrigeren. Afkorting: B&C = helderheid en contrast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeld data-analyse. Neurale reacties van 15 dieren blootgesteld aan 10 herhalingen van een 5 s duur optogenetische stimulatie eenmaal per minuut. (A) Beknopte afbeelding van de gevolgde dieren en de beweging van de neuronen binnen het onderzoek (rode vakken). Dier 2 bewoog tijdens de proef. (B) De individuele reacties van dieren in de loop van de tijd vertonen een relatief consistente reactie op stimulatie van rood licht. (C) Uitvoer van gegevensverkenning met behulp van de databrowse-functie . De traceringen zijn gegroepeerd op proefherhaling (hierboven) en gemiddelden worden hieronder weergegeven voor door de gebruiker te selecteren onderzoeken. (D) Gegevens gegroepeerd op individueel diernummer en gemiddeld over herhaalde proeven. Deze dataset toont minimale inter-dierlijke variabiliteit, wat een gemiddelde respons over de hele populatie rechtvaardigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Paired-pulse experiment met een variabel interstimulusinterval om de temporele remming te beoordelen . (A) Microfluïdische inlaataansluitingen van apparaten. De ongebruikte inlaat wordt geblokkeerd met een massieve pin (X). Het regelvloeistofreservoir en de klep1 zijn aangesloten op de c1- en c2-inlaten, hier weggelaten voor de duidelijkheid. (B) Stimulustiming voor acht patronen. De pulsen zijn 1 s lang en gescheiden door 0-20 s. De opeenvolging van patronen is hieronder weergegeven; Elk patroon werd zes of zeven keer gepresenteerd. (C) AWA neurale activiteit van 50 proeven en negen dieren. Een heatmap van reacties gesorteerd op stimulatiepatroon wordt hierboven weergegeven; De gemiddelde neurale activiteit voor elk patroon (n = 56-63 reacties) wordt hieronder weergegeven. Temporele remming treedt op gedurende ~ 10 s na de eerste puls. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Catch trial experiment om ontremming te beoordelen . (A) Microfluïdische inlaataansluitingen van apparaten. Een drieweg knijpklep zorgt ervoor dat alleen stimulus S1 in rust kan passeren en alleen S2 kan passeren wanneer deze wordt geactiveerd. (B) Diagram van de drie patroonsequenties die worden gebruikt om de herhaalde diacetylgeurpulsen af te geven, met de nieuwe stimulus 2-methylpyrazine gepresenteerd op zijn plaats tijdens de 26e studie. (C) Gemiddelde AWA neurale activiteitsreacties bij 20 dieren. Afkortingen: DA = diacetyl; 2-MP = 2-methylpyrazine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Multimodaal stimulatievoorbeeld . (A) Inlaataansluitingen van microfluïdische apparaten, waarbij een ongebruikte inlaat wordt geblokkeerd met een massieve pen. Een rode LED verlicht de arena van bovenaf. (B) Patronen voor optische, chemische of multimodale stimulatie. (C) Gemiddelde AWA neurale activiteit (n = 11 dieren) voor 30 herhaalde onderzoeken met gepaarde optogenetische en chemosensorische (bovenste), alleen optogenetische (midden) en alleen chemosensorische (onderste) stimulatie. (D) Piek neurale responsgemiddelde voor elke studie voor optogenetische pulsen boven en chemische pulsen onder. De optogenetische pulsen veroorzaken niet direct aanpassing, maar hun reacties zijn gevoelig voor chemosensorische aanpassing. Afkortingen: DA = diacetyl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een open-access microscopiesysteem voor de beoordeling van neurale activiteitsverschijnselen met behulp van de temporeel nauwkeurige levering van verschillende stimuluspatronen. Het microfluïdische platform levert herhaalbare stimuli terwijl het tientallen dieren in het gezichtsveld van de microscoop houdt. Weinig commerciële microscopiesoftwarepakketten maken het eenvoudig programmeren van verschillende stimulustimingpatronen mogelijk, en degenen die dat wel doen, vereisen vaak de handmatige invoer van elk patroon of eigen bestandsindelingen. Experimenten daarentegen worden in dit systeem gedefinieerd door tekstbestanden, die door de computer kunnen worden gegenereerd en leesbaar zijn door analysesoftware. Hier demonstreren we het nut van het gebruik van variabele stimuluspatronen voor het beoordelen van neuronale verschijnselen zoals temporele remming, aanpassing en overspraak tijdens multimodale stimulatie. De pijplijn voor gegevensanalyse reduceert grote microscopievideobestanden tot neurale activiteitsgegevens die kunnen worden gevisualiseerd en geanalyseerd op populatievariabiliteit (figuur 5B), veranderingen in de loop van de tijd (figuur 7C en figuur 8C, D) en veranderingen na verstoring (figuur 7C).
Een belangrijk voordeel van automatisering is de reproduceerbaarheid van stimulatie tussen proefherhalingen en tussen experimenten, en het microfluïdische arenaformaat maakt ten minste een 20-voudige toename van de doorvoer mogelijk in vergelijking met eerdere methoden met één dier 7,9,13. Het onderwerpen van een populatie dieren aan dezelfde stimulus en omgevingsomstandigheden zorgt ervoor dat de gegevens vergelijkbaar zijn en vermijdt mogelijke dagelijkse variaties in de bereiding van de oplossing, temperatuur, dierlijke bronnen of andere factoren. Een beperking van deze aanpak is echter de microscopie met lage vergroting en lage resolutie die alle dieren in het gezichtsveld houdt. Per dier mag slechts één neuron worden gecontroleerd om trackingfouten te minimaliseren, hoewel neuronen gescheiden door ten minste 50 μm in principe kunnen worden onderscheiden. Bilaterale neuronparen kunnen samen worden afgebeeld als de reacties naar verwachting symmetrisch zijn. Het is belangrijk om eerst te identificeren welke specifieke neuronen betrokken zijn bij een neuraal proces van belang, zoals door beeldvorming van de hele hersenen7, en vervolgens GCaMP alleen tot expressie te brengen in de relevante neuronen voor een verhoogde doorvoer.
Neuronale calciumresponsen variëren per dier als gevolg van expressieniveaus van verslaggevers of andere interindividuele verschillen. Genormaliseerde AWA GCaMP-responsen variëren bijvoorbeeld tweevoudig in piekgrootte, zelfs bij isogene dieren van het wilde type met de calciumreporter stabiel geïntegreerd in het genoom4. Sommige stimuli vertonen variabele reacties in de hele populatie (bijv. Butylacetaat4), wat wijst op variabele receptorexpressie. In de praktijk moeten ten minste 20 individuele dieren worden beoordeeld om de populatievariabiliteit te bepalen. Het wordt aanbevolen om gebruik te maken van individuele diergegevens om de statistische kracht te vergroten bij het bepalen van responsveranderingen, zoals door de statistische vergelijking van individuele neurale responsen die voor en na een verstoring zijn gepaard.
Met grote datasets en geautomatiseerde experimenten is het belangrijk om de juiste experimentfunctie, tracking en datareductie te valideren en te verifiëren, vooral voor stappen zonder toezicht. Stromingspatronen moeten worden geverifieerd met fluorescerende oplossingen (zoals in figuur 2H) door geen bellen of controlevloeistof te observeren die de arena binnenkomt in de opgenomen video's. Datasets moeten worden gevalideerd door bijvoorbeeld elke beweging van dieren te noteren (zoals in figuur 5A) en soepele neurale reacties te verifiëren (zoals in figuur 4C en figuur 5B). Problematische gegevens moeten worden uitgesloten. Het is ook belangrijk om de gegevensgroepering te verifiëren voordat u het gemiddelde neemt met behulp van de functie "databrowse" om ervoor te zorgen dat de gemiddelde respons individuele reacties weerspiegelt.
Het open-source stimulatiecontrolesysteem is gemakkelijk uit te breiden naar andere stimuli via digitale of analoge signalen of seriële communicatieopdrachten. Graduele stimuli zijn meestal regelbaar door analoge spanning (0-5 V) ingangen, zoals LED-lichtintensiteit of zenuwstimulator pulsmagnitude. Aan-uit-stimuli worden meestal geregeld met digitale (TTL) signalen, zoals elektrische stimulatortiming. Deze digitale signalen kunnen ook relaisschakelaars bedienen om andere elektrische systemen te activeren, zoals trillingsmotoren voor mechanosensorische stimulatie. Andere apparatuur maakt gebruik van seriële communicatie, zoals via een USB-verbinding, waarbij specifieke tekenopdrachten worden verzonden om acties te definiëren. Dosis-responsexperimenten kunnen bijvoorbeeld automatisch verschillende chemische concentraties presenteren met behulp van een USB-gestuurde rotatieklep5 of multi-well plaatsysteem6. Deze commando's kunnen worden toegevoegd aan de open-source microscoopbesturingsscripts die met specifieke proefnummers moeten worden verzonden. Tijdsvertragingen kunnen op dezelfde manier worden opgenomen; Als u bijvoorbeeld het testen 1 uur wilt pauzeren tussen twee 30-proefstimulatie-aanvallen, zou men een 60-proefexperiment specificeren en een enkele regel code toevoegen om 1 uur te pauzeren wanneer het proefnummer 31 bereikt.
De experimentele complexiteit is vrijwel onbegrensd en kan zelfs veranderen tijdens een experiment op basis van live feedback in een "closed-loop" systeem. De stimulatie kan bijvoorbeeld in realtime variëren op basis van de neurale activiteit, het gedrag van dieren of een andere kwantificeerbare parameter. We hebben onlangs een dergelijk systeem gebruikt om de sensorische neurale reacties bij slapende versus wakkere dieren te beoordelen door stimulatie en neurale opname te activeren na een gedragsverandering 8,15. De motion tracking-functie van NeuroTracker maakt de analyse van neurale activiteit bij vrij bewegende dieren mogelijk voor correlatie met gedragsoutput. Het volgen van individuele bewegende dieren vereist echter veel aandacht, zoals wanneer ze paden kruisen, en het wordt daarom aanbevolen om minder dieren per arena te laden (ongeveer vijf) om deze interacties te minimaliseren.
Over het algemeen verhogen deze technieken de precisie van stimulatie en de experimentele doorvoer bij het verkennen van populatievariabiliteit en specifieke neurale verschijnselen. Naast het meten van neuronale activiteit, zijn deze methoden generaliseerbaar naar andere biosystemen, waaronder planten, die ook communiceren via calciumsignalen 21, neurale celcultuur en hersenorganoïden 22, evenals naar andere dynamische fluorescerende signalen, zoals sensoren voor synaptische activiteit, neurotransmitterafgifte23 en transcriptie 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We bedanken Fox Avery voor het testen van deze protocollen en het beoordelen van het manuscript en Eric Hall voor programmeerhulp. Financiering voor de hierin gepresenteerde methoden werd gedeeltelijk verstrekt door de National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T.
