Summary
提案されたプロトコルには、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、 in vitro および in vivoで細胞によって放出される膜小胞の不均一な集団です。それらの遍在と生物学的情報のキャリアとしての重要な役割は、それらを興味深い研究対象にし、それらの分離のために信頼できる反復的なプロトコルを必要とします。しかし、彼らの研究に関連する多くの技術的障害(適切な取得など)がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です。この研究は、差動遠心分離に基づいて腫瘍細胞株の培養上清から小型EVを単離するためのプロトコル(MISEV 2018命名法による)を提示します。このプロトコルには、EVの隔離中にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。EVのエンドトキシン汚染は、その後の実験を著しく妨げたり、真の生物学的効果を覆い隠したりすることさえあります。一方、見落とされたエンドトキシンの存在は、誤った結論につながる可能性があります。単球はエンドトキシン残基に特に敏感な集団を構成するため、単球を含む免疫系の細胞に言及する場合、これは特に重要です。したがって、特に単球、マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞、樹状細胞などのエンドトキシン感受性細胞を扱う場合は、エンドトキシン汚染についてEVをスクリーニングすることを強くお勧めします。
Introduction
MISEV 2018命名法によると、細胞外小胞(EV)は、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす細胞分泌膜小胞のさまざまなサブタイプを表す総称です1,2。さらに、EVは、さまざまな疾患の新規バイオマーカー、治療薬、ドラッグデリバリービークルとして有望視されています。しかし、買収に関連する多くの技術的障害がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です3。そのような課題の1つは、多くの場合無視されてきたエンドトキシンフリーEVの分離です。最も一般的なエンドトキシンの1つはリポ多糖(LPS)であり、これはグラム陰性細菌細胞壁の主成分であり、さまざまな細胞による多数の炎症性サイトカインの放出により急性炎症反応を引き起こす可能性があります4,5。LPSは、LPS結合タンパク質に結合し、続いて骨髄系細胞上のCD14/TLR4/MD2複合体との相互作用によって応答を誘導します。この相互作用は、MyD88およびTRIF依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、それが次に核因子κB(NFkB)を誘発する。NFkBの核への転座は、サイトカイン6の産生を開始する。単球およびマクロファージはLPSに対して非常に感受性が高く、LPSへの曝露は炎症性サイトカインおよびケモカイン(例えば、IL-6、IL-12、CXCL8、およびTNF-α)の放出をもたらす7,8。CD14構造は、同様の親和性を持つ異なるLPS種の結合を可能にし、他のトール様受容体(TLR)(TLR1、2、3、4、6、7、および9)の共受容体として機能します6。単球/マクロファージに対するEVの効果について実施されている研究の数は、依然として増加しています9,10,11。特に単球、その亜集団、および他の免疫細胞の機能を研究する観点から、エンドトキシンの存在、さらにはEVにおけるそれらのマスクされた存在さえも非常に重要です12。エンドトキシンによるEVの見過ごされた汚染は、誤解を招く結論につながり、それらの真の生物学的活性を隠す可能性があります。言い換えれば、単球細胞を扱うには、エンドトキシン汚染がないことに自信が必要です13。エンドトキシンの潜在的な供給源は、水、商業的に入手した培地および血清、培地成分および添加剤、実験用ガラス器具、およびプラスチック製品であり得る5、14、15。
したがって、この研究は、低エンドトキシン含有EVの分離のためのプロトコルを開発することを目的としていました。このプロトコルは、EVからエンドトキシンを除去する代わりに、EVの分離中にエンドトキシン汚染を回避する方法に関する簡単なヒントを提供します。これまで、ナノメディシンで使用される操作されたナノ粒子などからエンドトキシンを除去する方法について多くのプロトコルが提示されてきました。しかし、それらのどれもEVのような生物学的構造には有用ではありません。ナノ粒子の効果的な脱パイロジェン化は、エタノールまたは酢酸のすすぎ、175°Cでの3時間の加熱、γ照射、またはトリトンX-100処理によって行うことができます。ただし、これらの手順はEV16,17の破壊につながります。
提示されたプロトコルは、単球に対するEVの影響に関する以前の研究とは異なり、EV中のエンドトキシン不純物の回避に焦点を当てた先駆的な研究です9。 提案された原則を実験室診療に適用することは、信頼できる研究結果を得るのに役立つ可能性があり、これは、診療所での治療薬としてのEVの潜在的な使用を検討する際に重要になる可能性があります12。
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Protocol
1.超遠心チューブの準備
- 滅菌済みの使い捨てチューブを使用してください。これが不可能な場合は、滅菌パスツールピペットまたは他の使い捨てアプリケーターを使用して洗剤で洗浄した後、超遠心チューブを再利用してください。超遠心チューブは、1種類の遠心分離材料(細胞培養上清/血清/血漿)と種(ヒト/マウスなど)専用にする必要があることを忘れないでください。
- 洗剤洗浄後、超遠心チューブを脱イオンされたLPSフリーの水で3回すすぎます。
注意: 低品質の水は使用しないでください。 - 超遠心チューブを乾燥させてから、70%エタノールで満たします。一晩消毒するためにチューブを70%エタノールで残します。エタノールを取り除き、チューブを再度乾燥させます。
- チューブとキャップを滅菌パッケージに入れ、しっかりと閉じます。プラズマまたはガス(エチレンオキシド)滅菌方法18、19を使用する。滅菌包装に封入された超遠心チューブは乾燥した場所に保管し、使用期限前に使用してください。
注意: リン酸緩衝生理食塩水(PBS)およびEVの分離に使用される水のLPSレベルの毎月のモニタリングを実行します。モニタリングには、チューブも含める必要があります(たとえば、超遠心チューブに室温[RT]で一晩保管されている水[洗浄制御]をテストすることによって)。
2. EV枯渇型低エンドトキシンウシ胎児血清(EE-FBS)の調製
- 超低エンドトキシンFBS(市販; 材料表を参照;<0.1 EU / mL)を必ず使用してください。
- 超低エンドトキシンFBSのボトルを水浴に入れ、56°Cで30分間インキュベートします。この手順は、補体系を無効にするために必要です。
- 不活化したFBSを超遠心チューブにピペットで移し、100,000 x g で4°Cで4時間遠心分離します。 上清を滅菌済みの50 mLチューブに集め、キャップの汚染やチューブのリングの濡れを防ぐために、チューブあたり45 mLを超えないようにします。
- このようにして調製したEE-FBS血清を-20°Cで保存する。 EE-FBS中のLPSの濃度を確認してください(ステップ6)。LPS濃度は、超遠心前と同じレベルである必要があります。
3. 細胞培養
- この研究では、4.5 g / Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびゲンタマイシン(50 μL / mL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でSW480およびSW620細胞株を、それに応じて10%EE-FBSを添加し、無菌技術を使用して75 cm2培養フラスコで培養しました。フラスコあたり約4.5 x 10 6セルと6.5 x 106セルをSW480とSW620にそれぞれ播種します。
- 細胞が完全なコンフルエントに達したら、週に2回(フラスコあたり~10 mL)、上清を収集し(SW480およびSW620の場合はフラスコあたりそれぞれ~13.5 x 10 6および20 x 106細胞)、分割します。細胞の生存率が99%以上であり、細胞が5%CO2雰囲気中で37°Cで培養されていることを確認してください。
- 細胞培養液の上清を、適切に標識された15 mLチューブに回収します。採取した上清を500 x g でRTで5分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。
- 上清を注意深く回収し、破片を吸引しないようにし、ラベル付きチューブに入れ、3,200 x g で4°Cで12分間遠心分離します。
- 2番目の遠心分離ステップから上清を滅菌済みの標識された50 mLチューブに収集します。チューブの端を濡らさないでください。上清の量が45mLを超えないこと、およびチューブが垂直に保たれていることを確認してください。
- チューブのキャップを滅菌透明フィルムで包み、上清を-80°Cの垂直位置に保管します。
注: マイコプラズマ属の毎月の制御を実行します。新鮮な培養上清中のLPS汚染(ステップ6)。上清中のエンドトキシン濃度が0.05EU/mLを超える場合は、どの段階で汚染が発生した可能性があるかを確認し、最初から処理をやり直してください。 マイコプラズマ属菌による培養細胞の汚染の場合。が検出された場合、そのような上清からのEVの分離を中止する必要があります。
4. 細胞培養上清からのEVの単離
- 0.22 μmのシリンジフィルターと適切な容量のシリンジを準備します。培養上清(90 mL)を入れたチューブを2本用意します。
- シリンジに上清を入れ、フィルターをニードルアダプターに取り付けます。フィルター付きの充填シリンジを50 mLチューブの上に置きます。プランジャーフランジを押して、~90mLのろ液を採取します。
- ろ液(7 mL)を超遠心チューブにピペットで移し(適切なバランスのために各チューブに同じ容量をピペットで移します)、100,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
注:EVペレット化の効率は、EV20の回収を改善するために最適化する必要がある多くの要因(ロータータイプ、そのkファクター、移動経路の長さ、媒体の粘度など)に依存します。 - 滅菌パスツールピペットを使用して上清を廃棄します。ろ過された長いピペットチップを使用して残りのペレットを収集し、2つの超遠心チューブにプールします。ろ過されたエンドトキシンフリーのPBSで最大7mLまで満たして、EVをすすぎます。
- PBS再懸濁ペレットを100,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。 滅菌パスツールピペットを使用して上清を完全に除去し、200 μLのろ過されたエンドトキシンフリーPBSを両方のチューブに加えて、EVを再懸濁します。EVペレットをそっとピペットでピペットで留めて、すべてのEVを回収します。
- EV懸濁液を滅菌済みの1.5 mL試験管に移します(可能であれば、低タンパク質結合チューブを使用してください)。ナノ粒子追跡分析(NTA)およびその他の目的(タンパク質濃度測定など)用の希釈液を調製するために、10 μLのEV懸濁液を保持します。
- メーカーの指示に従って、NTAによる測定のために、フィルタリングされたPBS(1:1,000)でEVを希釈します。キャップを滅菌透明フィルムで包んでEVチューブを固定します。EVは-80°Cで保管してください。
5. ウェスタンブロッティングによる特異的マーカーの検出
- サンプル中のタンパク質レベルを決定し(例えば、ブラッドフォードアッセイによって)、ローディングバッファーでサンプル(20 μg)を調製します。5 μLのサンプルバッファー(4x)と2 μLのサンプル還元剤(10x)を総容量20 μLに混合して、ローディングバッファーを調製します。 サンプルを70°Cで10分間インキュベートします。
- SDS(10%〜14%)でポリアクリルアミドゲルを調製し、20μgのEVを各ウェルにロードします。
- ランニングバッファー(トリス30 g、グリシン144 g、1 Lあたり10% SDS)を使用して、150 Vで45分間電気泳動を実行します。
- トウビンバッファー(トリス1.51 g、グリシン7.2 g、0.5 Lあたり10%メタノール)を25 Vで1時間使用したトランスファーマシンで、ゲルからポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜へのタンパク質のセミドライ転写を実行します。
- TBSTバッファー中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングするために、メンブレンをTBSTバッファー(1 mLのトゥイーン、100 mLのトリス緩衝生理食塩水(TBS 10x)/1 L)に入れ、RTのロッカーで1時間インキュベートします。
- 希釈(1:1,000)抗体、抗CD91 (クローン#D8O1A)または抗Alix 1(クローン#3A9)を1 %BSAで加え、ロッカー上でメンブレンと4°Cで一晩インキュベートします。抗体を除去し、メンブレンを10 mLの1x TBSTで10分間洗浄します。
- メンブレン上の一次抗体に応じて、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス(希釈:1:2,000)二次抗体を加え、RTのロッカー上で1時間インキュベートします。 抗体を除去し、メンブレンを10 mLの1x TBSTで10分間洗浄します。
- 基質とルミノールを1:1の比率で混合し、1mL溶液を得た。メンブレンに溶液を注ぎます。メンブレンをイメージングシステムの測定チャンバーにすぐに置き、化学発光モジュールを選択して、スクリーン上でタンパク質バンドを視覚化します。
6. リムルスアメーバ細胞溶解物試験(LAL)によるエンドトキシンレベルの測定
- メーカーの推奨に従って、エンドトキシンレベルの発色LAL測定を実行します。簡単に説明すると、エンドトキシンとリムルスアメーバ細胞溶解物(LAL)との相互作用に基づく方法を使用してください。この方法の検出限界は0.005 EU/mLです。
注:LALアッセイは、その制限にもかかわらず、現在、科学または医学で使用されるさまざまな種類の溶液やその他の製品中のエンドトキシン汚染を検出および定量するための標準的な方法です8。このキットの制限要因は、再構成されたアメーバ細胞ライセート溶液の安定性であり、再構成直後に凍結した場合、-20°Cで1週間のみ安定です。 - EVやその他のサンプルの10倍希釈と血清の50倍希釈を使用してください。さらなる実験には、EE-FBS、DMEM、PBS、RPMI (<0.005 EU/mL)、LPSフリーの培養上清などの低エンドトキシン試薬のみを使用してください。
7. EVサンプル中の原核生物16S rRNA遺伝子の検出
- EVサンプルからDNAを分離します。試薬と分離部位を無菌に保つようにしてください。DNAの濃度と品質を測定します(例えば、分光光度計を使用)。
- 前述のようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う21.エチジウムブロマイドまたはSYBRグリーンを含む1.5%アガロースゲルを調製し、PCR産物を紫外線(UV)で可視化します。
- サンプルと重量マーカーの電気泳動をTRIS-アセテート-EDTAバッファーで75 Vで45分間実行します。イメージングシステムを使用してDNAバンドを視覚化します。
8. ヒト単球モデルにおける刺激有効LPS濃度の決定
- L-グルタミン、グルコース、および2%EE-FBSを添加したRPMI 1640で2 x 106 単球/mLの単球懸濁液を調製します。96ウェル組織培養プレート22のウェルあたり50μLの懸濁液を加える。
- 適切な量のLPSまたは培地を添加して、細胞懸濁液の総容量100 μL中に0 pg/mL(対照)、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、および100 ng/mLの最終濃度を得ます。各LPS濃度を3倍にします。
- 細胞を37°C、5%CO2で18時間培養した。上清を集める。
- 上清を2,000 x gで5分間スピンダウンします。上清を新しいチューブに移します。採取した上清中のTNF 8,23およびIL-10 23濃度をサイトメトリービーズアレイ(CBA)ヒトサイトカインキットを用いて測定し、製造元の手順に従って、フローサイトメーターを用いて測定する。
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Representative Results
このプロトコルの前提条件または必須のステップは、試薬からエンドトキシン汚染の可能性を排除することです。FBS、DMEM、RPMI、PBS、さらには超遠心チューブなど、使用するすべての試薬は、エンドトキシンフリー(<0.005 EU/mL)でなければなりません。エンドトキシン汚染のない体制を維持することは容易ではなく、例えば、細胞培養用の通常/標準血清がその豊富な供給源(0.364 EU/mL; 表1を参照)となり得る。
このプロトコルは、エンドトキシン含有量の低いEVを分離するために開発されましたが、分離されたEVの特性評価は重要です。この研究では、EVは2つの結腸直腸癌細胞株、SW480とSW620から単離されました。EVマーカーCD9およびAlixの発現をウェスタンブロットにより確認した(図1A)。SW480およびSW620セルから単離されたEVの平均サイズに差はなかった(それぞれ134nmおよび128.2nm;図1B)。さらに、これらの細胞株間で単離されたEVの濃度に差はありませんでした(図1C)。NTAによって測定されたEVサイズの例示的な分布を図1Dに示す。超遠心の時間は、Cvjetkovic et al.20の結果に従って最適化されました。簡単に言えば、2つの固定角度ローター(70TiとT-1270)間の遠心走行パラメータを変換するための数式が使用されました。T-1270ローターで100,000 x gで120分間回転させることによる小型EVの枯渇の有効性は、70Tiローターを118,000 x gで155分間使用した場合よりもわずかに低かった。しかし、それはまだ効果的なRNAとタンパク質のペレット化の範囲にありました。計算は実験データ(表S1)によって確認され、遠心分離の延長時間(4時間対2時間)は、ペレット化された、または上清中にまだ存在するEVの数に有意な影響を与えなかった。
単球応答を引き起こしたLPSのレベルを評価した。この目的のために、ヒト単球を連続濃度のLPS(0 pg/mL、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、および100 ng/mL)で培養しました。一晩培養後、培養上清中のIL-10およびTNFのレベルを測定した。この研究では、単球でIL-10とTNFの分泌を可能にするLPSの最低用量は50 pg / mLであり、これは0.5 EU / mLに相当します(図2)。
最後に、最後のステップは、上記のように分離されたEVのLPSレベルのテストに関連していました。EVサンプルのLPS汚染は約0.5 EU/mL(50 pg/mL; 図3)両方の細胞株(SW480およびSW620ではそれぞれ45.80 ± 20.39 pg / mLおよび48.75 ± 7.412 pg / mL)。これは、1 μLのEV(約109 EVs)に含まれるエンドトキシンが0.05 pg未満であり、100 μLの単球懸濁液(単球1個あたり104 EVの比率)に添加すると100倍に希釈されることを意味します(LPSの最終濃度は約0.5 pg / mLです)。
さらに、16S rRNA遺伝子21についてEVの純度をPCRでテストし、SW480およびSW620細胞株から分離されたEVに細菌汚染がないことが確認されました(補足図1)。
図1:単離されたEVの特性評価 。 (A)SW480およびSW620細胞株から単離されたEVのタンパク質マーカーのウェスタンブロット分析。(B)NTAを用いて、SW480およびSW620細胞株から単離されたEVのサイズ(nm)を測定した。(C)NTAを使用して、SW480およびSW620細胞株(EV / mL)から単離されたEVの濃度を測定しました。(D)NTAによって測定されたEVサイズの例示的な分布(青い数字は曲線上の特定の点での粒子サイズを示す)。BおよびCのデータは、SD±平均値として表されます(n = 10)。統計解析にはt検定を用いた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる用量のLPSで刺激した単球によるIL-10およびTNF分泌。 単球によるサイトカインの分泌は、対照単球(MO)と比較して、示されているようにLPS用量で刺激した後に決定されました:10 pg / mL、50 pg / mL、100 pg / mL、1 ng / mL、および100 ng / mL。データは平均±SDとして表されます(n = 4)。マン・ホイットニーU検定を用いた。培養上清中のTNFおよびIL-10濃度は、サイトメトリービーズアレイ(CBA)法により測定した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:発色LAL試験による単離されたEVサンプル中のLPSレベルの測定。 SW480およびSW620細胞株から得られたEVサンプル中のLPS含有量(pg/mL)。データは、SD±平均値(n = 6)として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| S.No。 | 見本 | エンドトキシンレベル [EU/mL] | エンドトキシンレベル [PG/mL] | ||
| 1 | ティッカー | <0.005 | <0.5% | ||
| 2 | RPMI1640 | <0.005 | <0.5% | ||
| 3 | FBS超低エンドトキシン | <0.005 | <0.5% | ||
| 4 | 4時間遠心分離後のFBS超低エンドトキシン(EE-FBS) | <0.005 | <0.5% | ||
| 5 | 通常のFBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | フィルタリングされたPBS | <0.005 | <0.5% | ||
| 7 | 2時間遠心分離後のSW480細胞の培養上清 | <0.005 | <0.5% | ||
| 8 | 2時間遠心分離後のSW620細胞からの培養上清 | <0.005 | <0.5% | ||
| 9 | 洗浄制御(超遠心管に貯留された水) | <0.005 | <0.5% | ||
表1:発色LAL試験により測定した各種試薬および試料中のLPSレベル。 測定値は、EU/mLおよびpg/mLとして表示されます。サンプルには、DMEM、RPMI、EE-FBS、FBS、ろ過されたPBS、および洗浄コントロール(超遠心チューブからの水)が含まれていました。
附則表1 SW480およびSW620細胞株およびPBSからの培養上清の2時間または4時間の遠心分離後のペレットおよび上清中のEV濃度(EV/mL)およびサイズ(nm)測定の代表例。測定は国税庁が行った。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1: 以下のサンプルにおける汎原核生物16S rRNA遺伝子増幅のPCR結果、左から:分子量ラダー(MW、100-1000 bp)、NC陰性対照、SW480およびSW620由来のEV、およびPC(陽性対照-細菌DNA) このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここ数年、EVを適切に分離する方法がますます重要になり、たとえば、信頼性の高いオミクスおよび機能データを取得するという文脈で、EVのさらなる信頼性の高い分析が可能になりました24。これまでの研究経験から、分離方法の種類だけでなく、この手順中の他の条件も重要かもしれないようです。EV枯渇FBSの使用は、必要性として広く認識されています25,26;しかし、EVのエンドトキシン汚染の監視はしばしば無視されています。
それにもかかわらず、EVの隔離に使用されるすべての方法は、手順のすべての段階で厳格な無菌処理と品質管理のための基準を開発する必要があります。これは、EVのさらなる下流アプリケーションのために特に重要です。提案されたプロトコルは、エンドトキシン感受性である単球やマクロファージなどのエンドトキシン感受性細胞での以前の経験の結果です。単球のマーカーであるCD14は、ピコモル濃度でLPSに結合することができます。得られた結果は、単球が50 pg / mL(0.5 EU / mL)のLPSで刺激した後、TNFとIL-10を分泌することを示しています。しかし、Yangらは、0.1 EU/mL(10 pg/mL)のエンドトキシンでさえ強力な反応(炎症性 IL1B 遺伝子のアップレギュレーション)を誘発する可能性があると報告しています27。さらに、Chaiwutらは、単球におけるTNFおよびIL-6の細胞内産生が、それぞれ2.5 pg/mLまたは5 pg/mLのさらに低い濃度のLPSによって誘導される可能性があることを実証した23。Alvarezらは、単球活性化率(計算値)が5pg/mLなどの低濃度のLPSの後に上昇することを確認した28。したがって、分離プロトコルのあらゆる可能な段階でEVのエンドトキシン汚染を制限することは、LPS感受性細胞で実施されるさらなる実験にとって非常に重要です。現在、超遠心分離はEV分離に最も広く使用されている方法です。しかし、私たちの知る限り、この方法で分離されたEVのLPS汚染に関する研究はありません。したがって、上記のプロトコルは、培養上清から外部EV汚染のない低エンドトキシンEVを得ることに焦点を当てています。
上記のように、エンドトキシン汚染は様々な原因を有し得る。第一に、エンドトキシンはタフな反対であり、ガラスまたはプラスチック製品の滅菌のすべての方法がその除去または分解に効果的であるとは限らないことを強調すべきである。たとえば、標準的なオートクレーブ手順では、エンドトキシンの高い熱安定性のためにLPSを除去できません27。また、広範囲に洗浄しても、エンドトキシンを完全に除去することはできません。血漿またはETO(エチレンオキシド)滅菌18,19などの実験室診療により多くの脱パイロジェニック方法を適用することにより、エンドトキシン汚染を制限することができる。次に、恒久的な監視と汚染の可能性の防止が重要です。提示された結果は、培養サプリメントに血清などの超低エンドトキシン試薬を使用することの重要性を示しています。さらに、すべての試薬(PBS、DMEM、RPMIなど)やプラスチック製品(チューブなど)のエンドトキシン汚染を日常的に管理することを強くお勧めします。また、エンドトキシンの蓄積を防ぐために、EV単離前に培養上清を事前にチェックする必要があります。上記のように、LALアッセイによるエンドトキシンレベルの標準的な測定に代わる興味深い代替手段は、細菌の16s rRNA遺伝子のPCR増幅である。EV中のLPSの許容性(単球刺激を誘発しない)エンドトキシンレベルの決定は非常に重要です。培養条件(適用したEVの単球濃度およびLPSによる汚染、EVの濃度;図3)、EVで刺激された単球に影響を与えるエンドトキシンの最終濃度は0.5 pg / mL以下です(EVは通常100〜1,000倍に希釈されます)。この用量は、単球によるTNFの産生を誘導できる最小有効用量(2.5 pg / mL)としてChaiwutらによって仮定されたものの5倍低い23。Chaiwutらの研究では、サイトカイン産生はフローサイトメトリーを使用して決定され、定量化せずにMFI(平均蛍光強度)シフトとして提示されました。さらに、非常に低用量のLPSによる単球刺激を、LPS23の追加供給源となり得る10%FBSを添加した培地中で行った。これは、単球刺激に用いたLPSの有効投与量が高かったことを示唆している可能性があります。したがって、提示された結果と文献データを考慮すると、EV中の最大50 pg / mL(0.5 EU / mL)のエンドトキシンの濃度は許容可能であり、単球の活性化の原因ではないようです。このプロトコルを最適化するための次のステップは、LALまたは細胞ベースのアッセイでは検出されないレベルまで、エンドトキシン汚染をさらに低減することです。最近では、低エンドトキシン回収率(LER)と呼ばれるマスクされたエンドトキシン汚染を検出するために生物学的モデルを使用することの重要性が強く推奨されています8。
したがって、このプロトコルは、他の研究ではまだ対処されていない、可能な限り低いエンドトキシン含有量のEVの分離に必要なすべての側面を収集するため、この点で革新的です。
各方法と同様に、このプロトコルにはいくつかの制限があります。第一に、提案されたプロトコルはエンドトキシン汚染を減少させるが、それを排除するものではない。第二に、達成された純度が他の免疫細胞にとって十分であるかどうかは不明である。したがって、各プロトコルは、さらなるアプリケーションに適合させる必要があります。このようなプロトコルを確立することで、偶発的な汚染よりもEVの生物学的に活性なコンポーネントに対応する結果を得ることができます。最後に、いくつかのエンドトキシン検査キットと低エンドトキシン血清を購入する必要があるため、この手順は通常よりも高価です。有望な代替案として、Bussolatiは、接線方向の流れろ過によるEV分離のための新しい洗練された方法を提示しました。この方法では、内毒性の低いEVの取得が可能になります(0.1-0.7 EU/mL; 10-70 pg/mL)29。これまで、この新しい方法はEVの絶縁に一般的に使用されておらず、接線流ろ過(TFF)システムの形で特殊な機器が必要です。最近、Gałuszkaらは、ポリミキシンB30を使用して、大気汚染物質(EVのサイズで膜構造のない粒子状物質)からエンドトキシンを除去する別の方法を提案しました。しかし、細胞由来小胞に対するこのプロトコルの有用性は、特に in vivo 実験を考える場合、生物学的モデルを通じて検証する必要があります。ポリミキシンBおよびデオキシコール酸ナトリウム(エンドトキシン除去にも適用可能)は、神経毒性および腎毒性として以前に説明されている31。他の可能性は、エンドトキシンに選択的に結合するポリ(ε-リジン)との親和性カラムです。この方法は迅速かつ効率的ですが、タンパク質サンプル/溶液専用です。したがって、EVなどの複雑な構造に適用するには、検証が必要です32。さらに、これらのカラムは初期エンドトキシンレベルが高いサンプルを対象としており、比較的少量のLPSを除去する効果は不明であり、検証が必要です。LPS枯渇カラムで精製した後のLPSの最終的な予想濃度は、免疫細胞検査には高すぎる可能性があります(たとえば、<5 EU/mL)。
要約すると、このプロトコルは、EV分離のすべてのステップでの厳密な無菌技術、超低エンドトキシン試薬の使用、すべての手順ステップでのエンドトキシン不純物の監視、滅菌方法の変更など、実験室での実践にいくつかの原則を適用することにより、エンドトキシン汚染を回避する方法を提案しました。さらに、提示されたプロトコルは、分離手順のすべてのステップでエンドトキシンレベルを制御する方法に関するヒントを提供します。EVに含まれるLPSは免疫細胞の機能に影響を与えるため、これらの細胞を用いて実施するアッセイでは誤った結果が生じる可能性があります。
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Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反として構築できる商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、ポーランド国立科学センター、助成金番号2019/33 / B / NZ5 / 00647によってサポートされました。ヤギェウォ大学医科大学分子医学微生物学部のTomasz Gosiewski教授とAgnieszka Krawczyk教授が、EVの細菌DNAの検出に貴重な支援をしてくださったことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
