Summary
骨格筋機能は、孤立した筋線維の収縮性を定量化することによって評価することができ、従来は面倒で低スループットのアプローチを使用していました。ここでは、ヒドロゲル包埋筋線維の収縮性を定量化するための光学ベースのハイスループット法について説明します。このアプローチは、薬物スクリーニングや治療薬開発に応用されています。
Abstract
in vitro細胞培養は、細胞プロセスを評価し、治療戦略をテストするための強力なツールです。骨格筋の場合、最も一般的なアプローチは、筋原性前駆細胞を未成熟筋管に分化させるか、単離された個々の筋線維の短期間のex vivo培養のいずれかです。in vitroに対するex vivo培養の主な利点は、複雑な細胞構造と収縮特性の保持です。ここでは、マウスからの無傷の屈筋指筋線維の単離とその後のex vivo培養のための実験プロトコルについて詳しく説明します。このプロトコルでは、筋線維は、線維を固定化し、それらの収縮機能を維持するために、フィブリンベースおよび基底膜マトリックスヒドロゲルに埋め込まれる。次に、光学ベースのハイスループット収縮性システムを使用して筋線維収縮機能を評価する方法について説明します。埋め込まれた筋線維は電気的に刺激されて収縮を誘発し、その後、サルコメア短縮や収縮速度などの機能特性が光学ベースの定量化を使用して評価されます。筋繊維培養をこのシステムと組み合わせることで、収縮機能に対する薬理学的物質の効果のハイスループット試験と遺伝性筋障害のex vivo研究が可能になります。最後に、このプロトコルは、生細胞顕微鏡を使用して筋線維の動的細胞プロセスを研究するためにも適用できます。
Introduction
in vitro細胞培養技術の進歩により、十分に制御された条件下で哺乳類組織を使用しながら、組織再生能力、病態生理学的細胞メカニズム、およびその後の治療戦略を研究するための新しい可能性が開かれました1,2,3。体外培養システムの使用は、筋肉研究分野で十分に確立されています4,5。一般に、筋原性前駆細胞からの体外分化型未熟筋管細胞が用いられる2、6、7、8。より成熟した筋線維9を生成するための分化プロトコルにおいて進歩が見られたが、それらの未熟さは依然として、in vivo設定1,10への所見の翻訳を制限する。筋肉生物学分野の中心的な問題の1つは、体外分化型筋管細胞が、天然の筋肉組織で観察される複雑な細胞内構造、細胞シグナル伝達プロセス、および細胞外相互作用を完全に象徴できず、重要なことに、筋線維によって生成される収縮力を再現できないことです1,2,10,11,12 .さらに、分化プロセス中の筋管細胞の非協調的な収縮は、しばしば培養皿からの自発的な剥離をもたらし、in vitro分化筋管の収縮評価を困難にし、定性的または半定量的評価に限定しています8,11,12,13。これらの制限は、特に筋肉の収縮性が主要な実験結果である場合、動物を用いた定期的なin vivo実験を必要とすることがよくあります1。
体外分化型筋管細胞の培養に代わるものは、単離された成熟筋線維のex vivo培養である1,14。ex vivo培養中に、発生的に成熟した筋肉組織が体外に切り出され、続いて実験室条件で培養するための単一細胞単離が行われます1,14。単離された成熟筋線維は、天然組織内で観察される複雑な細胞構造を維持し14,15、この方法は、明確に定義され制御可能な培養環境において、遺伝子操作や薬物スクリーニングなどの直接介入の可能性を開きます。骨格筋線維の分離と生体外培養に関する最初の報告の1つは、1930年代にさかのぼります。しかしながら、このプロトコールからの生存繊維の収率は低かった16。単離手順および培養条件の継続的な最適化により、生存可能で機能的な筋線維の量の有意な改善が今や可能である14、15、17、18、19。培養条件におけるそのような改善の1つは、培養皿15、18、20上の単離筋線維の接着を促進するために培養皿を細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることを含む。ラミニンは筋肉の細胞外マトリックス内で最も豊富な要素の1つであるため、通常、ラミニンコーティングが使用されます20,21。培養皿のコーティングと組み合わせた単離手順の最適化により、筋肉研究分野は、培養中の無傷の細胞構造と収縮機能を備えた単離された生存筋線維を短期間維持することができました1,15,18,22。
力および収縮能力を測定するために筋野内で使用される最も従来のアプローチは、長さドライバモータと力トランスデューサ23、24との間に個々の筋線維を取り付けることである。一般に、これらのモーター駆動のセットアップに使用される筋繊維は、急速凍結または新鮮な組織のいずれかから解剖され、続いて透過処理または「スキニング」が行われ、これにより外部カルシウム活性化が可能になり、さまざまなカルシウム濃度を使用して筋線維収縮を誘導します24。この方法は筋線維収縮測定のゴールドスタンダードですが、一度に測定できるのは1つの筋線維のみであり、この手法は面倒で時間のかかる手順になります25。さらに、筋線維の単離および皮剥ぎ手順は、興奮収縮結合に関与する様々な構造(すなわち、カルシウム放出およびその後の筋小胞体への再取り込み)を破壊し、それによって弛緩動態およびこのプロセスに影響を与える可能性のある疾患の研究を可能にしない26,27.皮を剥がした繊維製剤の代替物は、機械的解剖を使用して無傷の筋線維を分離することであり、そこでは収縮力は電気的活性化に応答して測定することができる28。ただし、このアプローチは技術的に困難で非常に時間がかかるため、スループットの低い測定になります。最後に、皮を剥いだ製剤と無傷の製剤の両方で、収縮測定中に筋細胞が細胞外環境から完全に除去され24、筋線維収縮に対する細胞外マトリックス組成/剛性の影響の調査が不可能になります24。その結果、筋線維と細胞外マトリックスとの間の接続を再現しながら、単離された無傷の筋線維の筋線維収縮性測定をハイスループットな方法で可能にするための代替方法の開発が必要です。
最近、ハイスループット筋線維収縮性測定のための新しい光学ベースのアプローチが開発されました29。この光学ベースのシステムは、サルコメアの周期性を測定し、高速イメージングを使用して収縮中のサルコメアの長さを評価します。このシステム内では、光学系が移動している間、細胞は培養皿内の所定の位置に留まり、それによって、複数の細胞29の測定の間に必要とされる時間が最小化される。このハイスループットの光学ベースのアプローチを使用する主な利点は、天然組織と同様の培養条件を開発できることです。天然のインビボ条件を模倣するために使用されるアプローチは、ヒドロゲル30中に細胞を埋め込むことである。典型的には、ヒドロゲルはその体積および形状を維持することができる粘弾性材料であり、ヒドロゲルは固体および液体材料の両方の特性を有する31。固体部分は、互いに架橋されたポリマー鎖で構成され、ネット30,31に似た構造を作成します。ヒドロゲルの材料特性は、筋肉30、31のマトリックス沈着を模倣するように同調することができる。したがって、ハイスループットの光学ベースのシステムとヒドロゲルに埋め込まれた細胞の組み合わせは、筋繊維の機能に対する細胞外マトリックス組成および機械的特性の影響を評価するための新しい可能性を開く。
この論文の全体的な目的は、1)天然の組織環境を模倣した条件での筋繊維の酵素的単離および ex vivo 培養の方法論を説明し、2)ハイスループットアプローチを使用して筋線維の収縮性を評価することです。酵素消化を用いて、指屈筋(FDB)筋から多数の単一筋線維を容易に単離するための詳細な方法論について述べる。さらに、筋肉の本来の環境を模倣し、筋線維の生存率と収縮性を改善するために、単離された筋繊維をフィブリンベースのヒドロゲルに埋め込む技術について説明します。次に、この最近開発されたシステムを使用して 、in vitro で生きた筋線維収縮を測定するハイスループット方法の概要を説明します。 この埋め込み手順の追加の利点は、収縮中の繊維の固定化であり、これらの測定の信号対雑音比を改善する可能性があります。このゲル包埋法は、単一ポリマーおよび複合ゲルカプセル化手順の両方に適用可能であり、筋線維収縮性に対する細胞外マトリックス組成の影響の評価を容易にします。
Protocol
生体外収縮研究では、死後組織は、オランダの動物研究法の許可により、欧州理事会指令(2010/63 / EU)に従って、他の承認された研究プロジェクトおよび/またはVU大学の余剰繁殖のために犠牲にされた動物から取得されました。
1.材料の準備
- 摩砕用のピペットを準備します(使用するまでフローキャビネット内の70%エタノールに保管します)。2つのP1,000チップの端をカットして、異なる穴サイズを作成します。穴がピペットを塞ぐことなく筋肉が通過するのに十分な大きさであることを確認してください。カットの端を炎に通して滑らかになるようにします。
- 他の箇所32に記載されているようにシルガード皿を準備し、隔離中に足と筋肉を固定するために事前に70%エタノールで滅菌します。
注意: シルガードディッシュは、脱イオン水と70%エタノールで徹底的に洗浄した後、再利用できます。 - 単離手順の前に、解剖培地、フィブリン培養培地、および筋肉消化培地( 表1を参照)の溶液を調製してください。
注意: 筋肉消化培地は、0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌する必要があります。調製したすべての溶液は、標準的な細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2で、使用前に少なくとも30分間平衡化する必要があります。 - 筋肉消化後、ヒドロゲルをキャストするために次の溶液を調製します:セルミックスとマトリックスミックス( 表2を参照)。セルミックスとマトリックスミックスを1:1の比率で組み合わせて、最終的なフィブリン濃度を2.5 mg/mLにします。
注意: 氷上でマトリックスを準備し、予冷したピペットチップを使用して、基底膜マトリックスの早期重合を防ぎます。ここで使用したトロンビン:フィブリノーゲン比1:10(フィブリノーゲンmgあたりの単位)は、重合時間30分に最適化されています。ゲルが30分以内に重合する場合は、より低いトロンビン濃度を使用する必要があります。詳細については、ディスカッションを参照してください。
2. FDB筋解離
- 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。後肢を70%アルコールで消毒します。
- 足首の上の下肢を切り取ります。足の背側の皮膚をつま先に向かって切り開きます。
注意: 後で必要になった場合に下肢の筋肉や脛骨が損傷するのを防ぐために、足首関節で下肢の後肢を切り取ります。 - つま先に向かって皮膚を慎重にはがします。筋肉を傷つけないように注意してください。FDBは、足の腹側にある最も表面的な筋肉です。
- 解剖した足を、37°Cで予熱した解剖培地10mLを入れたシルガード皿に入れます。 つま先にまだ付着している皮膚を通して足を固定し、足首を超えて下肢を固定します。
- 筋肉の上の結合組織を慎重に取り除きます。かかとで腱を切り、その腱で筋肉を持ち上げます。
- 結合組織を通して筋肉の横と下を切断します。つま先の腱が露出するまで切り続けます。
- 3つの腱の長さの半分が露出したら、腱を切り、足から筋肉を解放します。オプション:4番目の外側腱とその筋線維を切り取ります。
- 筋肉から結合組織を取り除き、予熱した解剖培地を含むチューブに移します。
3.FDB筋肉消化
- 表1に従って筋肉消化培地を調製する。
- 血清学的ピペットを用いてFDB筋肉を筋肉消化培地に移す。組織培養インキュベーター内で37°C、5%CO2 で80分間インキュベートします。
注:この時間は、コラゲナーゼバッチごとに最適化する必要があります。筋肉がほつれ始め、肥大して見えると消化が完了します。消化時間の最適化については、説明を参照してください。 - 消化後、3 mLの解剖培地を含む15 mLチューブに筋肉を移し、30分間インキュベートしてから摩砕します。
4. FDB筋粉砕と重力沈降
- 事前に準備した粉砕チップ(ステップ1.1)を使用して、筋肉をピペッティングして、最大サイズから最小サイズに筋肉を粉砕します。このステップに5分以上かかる場合は、筋肉をインキュベーターに5分間入れて休ませます。
- 筋繊維がほとんど腱から外れ、腱がP200の先端を通過できるようになるまで粉砕します。腱を取り除きます。
- 解離したFDBファイバーを10 mLの解剖培地を含む15 mLチューブに加え、ファイバーをインキュベーター内で20分間沈降させます。形成されたペレットを観察します。
- オプション:上部から10mLの培地を取り出し、手順4.3を繰り返します。このステップは、過剰な破片および関連する単核細胞の除去を容易にする。
5. FDBファイバー埋め込み
- 繊維ペレットの上部からすべての培地を慎重に取り除きます。FDB筋肉あたり875 μLの細胞ミックスに細胞を再懸濁します(氷上)。
注:1つのFDB筋は、24ウェルプレートの7ウェルに十分な繊維を生成します。この密度は、実験の必要性に応じて調整することができる。以下のゲル容量(250 μL)は、24ウェルフォーマット用に最適化されていますが、他のフォーマットに合わせてスケーリングできます。 - 125 μLの細胞混合物を単一の微量遠心チューブに分注します。
- 1ウェルずつ、125 μLのマトリックスミックスを細胞懸濁液アリコートに加え、気泡が形成されないように慎重に上下にピペッティングして混合します。
- すぐに最終ミックスをウェルに移します。
注意: 必ず混合物をウェルの中央にピペットで入れてください。各ウェルについて、ステップ5.3とステップ5.4を繰り返します。 - ゲルをインキュベーター内で30〜45分間固化させる。固化後、培養液をウェルに慎重に加えます。
注:高速ピペッティングにより、ヒドロゲルをウェルから剥離させることができます。この時点から、繊維を刺激して測定することができます。しかし、私たちの経験では、繊維を24時間培養条件に調整させることで、繊維の収縮性が向上する可能性があります。 - より長い培養の場合は、2日ごとに半分交換して培地を補充します。これを行うには、培養液の半分を取り除き、等量の新鮮な培地と交換します。
6. 光学ベースの収縮測定
- 光学ベースの収縮測定システム(材料表を参照)、蛍光ランプ、電気セルペーサー、およびコンピューターの電源を入れます。電気刺激装置を1.0 Hz、10.0 V、および5.00 msのパルス持続時間に設定して、孤立した筋線維を刺激します。
- プレートを測定システムに挿入します。ペーサーをペーシングインサートに接続し、培養プレートに挿入します。
- IonWizardプログラムを開き、ファイル(画面左上)をクリックして新しいファイルを開きます |新規。
- プログラムが正しい実験、骨格サルコメアにあるかどうかを確認するには、[新規]をクリックします。実験を収集します。テストを変更するには、目的のテストをクリックし、[追加] を押します。骨格サルコメア実験では、Sarc 20x、平均ライン、シングルFFT、250 Hzサンプリングレート、および10秒の取得時間の設定を適用します。
注意: 実験設定は、実験の前に準備する必要があります。設定は、実験のニーズに合わせて調整できます。 - 測定システムの温度を 25°Cに調整します。ツールバーの下にある 開いているセルファインダー をクリックし、新しい画面がポップアップするのを待ちます。この画面の右上で、 プレートタイプ と アクティブウェルを選択します。
注:測定は25°Cで行われ、速けいれんFDB筋線維の収縮速度を低下させ、収縮イベントのアンダーサンプリングを防ぎます。 - フォーカススライダーバーを調整して、ファイバーに焦点を合わせます。または、このフォーカス機能にはWキーとSキーを使用します。
- ペーシングを有効にして電気刺激を開始します。繊維がけいれんし始めるのを観察します。
注意: 繊維がけいれんしていない場合は、すべてのワイヤーが接続され、ペーサーが完全に水没していることを確認してください。この後も動きがない場合は、粉砕中の過剰消化または過度の損傷のために繊維が反応しない可能性があります。 - サルコメアが垂直に走るように、測定領域をファイバーの端に焦点を合わせます。サルコメアに焦点が合っていることを確認してください。サルコメアに焦点が合っている場合は、ツールバーに単一のピークが表示されます。収縮中、サルコメアが短くなるにつれて、このピークは右に移動します。
注意: 紫色の測定領域は、実験を開始する前に調整できます。適切な測定を確実にするために、~20個のサルコメアを含めます。このピークが収縮中に形状を変える場合、これは収縮中にサルコメアが不明瞭または焦点が合っていないことを示している可能性があり、ノイズが発生します。 - ツールバーの [開始 ] をクリックして実験を開始します。 Q キーを押して測定を開始し、プログラムが10個の収縮過渡現象を測定するのを待ちます。4つ以上のトランジェントにノイズがないように見える場合は、 Z キーを押して測定を受け入れます。トランジェントのノイズが多すぎる場合は、 X キーを押して測定を拒否します。
- 条件ごとに10本の繊維から20本の繊維を測定します。以前に測定された繊維の位置は保持されます。
- オプション:化合物を追加すると、この時点で繊維を再測定できます。
- 実験が終了したら、下部ツールバーの 停止 ボタンを押してセルファインダーウィンドウを閉じます。ファイルを保存し、新しいファイルを開始します。
- データを分析するには、プログラム「サイトソルバーデスクトップ」を開きます。 インポートをクリックし、分析するファイルを選択します。
- プログラムが分析を終了したら、青、赤、灰色のピークを探します。青いピークは、プログラムによって受け入れられるトランジェントです。赤いピークはプログラムによって拒否されたトランジェントであり、灰色のピークはユーザーによって拒否されたトランジェントです。
注:不合格基準は解析ソフトウェアで調整できます。一般に、値は最大導関数限界を超えると棄却され、過渡現象はカーブフィットR2 値<0.95に基づいて棄却されます。 - エクスポートをクリックします。次のボックスにチェックを入れます:平均化された過渡データとExcelへのエクスポート。
- 終了したら、すべてのマシンの電源を切ります。培養プレートを取り出し、廃棄する。ペーサー電極を脱イオン水と70%エタノールで洗浄します。
Representative Results
このプロトコルを用いて、単一のFDB筋線維を単離し、ヒドロゲルに包埋した。筋郭清手順の概要を 図1に示します。FDB筋は無傷の腱で露出し、筋膜から緩んでいます。筋肉の腱を固定点として維持することで、分離手順中の筋線維への潜在的な損傷を最小限に抑えることができます。余分な結合組織をトリミングして、破片や二次細胞タイプの増殖を減らすことができます。筋肉が切除され、十分に洗浄されると、筋肉はコラゲナーゼを使用して酵素的に消化され、単離された細胞をヒドロゲルに埋め込む前に、粉砕によって単一の筋繊維が放出されます。FDB筋線維の単離は、比較的短い筋線維を提供し、それは容易に操作されるという利点を有する。FDB筋繊維は、そのサイズにより、もつれによる損傷なしに安全にピペッティングすることができ、ヒドロゲル内に容易に埋め込むことができます。単一の筋線維は培養プレートにあまり接着しないため、繊維をヒドロゲルに埋め込むことで、細胞培養および収縮測定中に繊維が確実に留まります。さらに、基底膜マトリックスをフィブリンゲルに添加すると、筋線維とマトリックスとの間の相互作用が可能になり、天然 のin vivo 環境を模倣する。単離された単一筋線維は、単離後数日間培養で操作および維持することができる。 図2では、ヒドロゲルマトリックスに埋め込まれた単離FDB繊維の例が示されている。健康な繊維には目に見えるサルコメアがあり、まっすぐに伸びていますが(青い矢印)、湾曲した繊維は通常損傷しているか生存不能であるため(黄色の矢印)、測定から除外する必要があります。過収縮した繊維は、マトリックス内で暗いボール状のオブジェクトとして表示されます(赤い矢印)。分離手順が成功した場合、健康な繊維の割合は~75%になるはずです。過収縮繊維の割合が高いほど、通常、分離手順中の損傷を示します。筋繊維の膜は、筋肉の過剰消化または摩砕中の繊維の損傷のいずれかによって損傷を受ける可能性があります。トリチュレーション損傷は、主に筋肉の消化が不十分で、簡単にはバラバラにならない場合に発生します。
繊維の機能性と生存率は、光学ベースのハイスループット収縮測定システムを利用した筋線維の収縮測定を通じて評価されました。システムは、サルコメアの長さ、サルコメアの短縮率、収縮速度、緩和速度など、いくつかのパラメータを出力します。収縮測定システムを使用して、筋線維ごとにサルコメア収縮を測定することができます。 図3 は、測定システムを用いて測定された筋線維収縮の例を示す。単一の収縮過渡現象から、ベースラインでのサルコメア長、収縮持続時間、最大収縮時のサルコメア長、および緩和持続時間のパラメータが得られます(図3A)。これらのパラメータは、サルコメアの短縮、収縮、および緩和速度のパーセンテージを計算するために使用されます。平均速度値は、必要に応じて、持続時間と絶対短縮値から計算することもできます。有効な収縮測定は、直線的なベースライン、それに続くピークへのディップ、およびベースラインへの復帰を特徴としています(図3A)。ノイズ、焦点の合っていないサルコメア、またはファイバーの異常な動きが測定過渡に影響を与える可能性があり(図3B、C)、これらの測定値は手動で破棄するか、分析プログラムによって拒否されます。このアプローチでは、サルコメアの明確な視覚化が収縮を測定するために重要です。したがって、サルコメアの視認性を低下させるものはすべてノイズを引き起こす可能性があります。これは、収縮中に焦点面の外側にサルコメアが移動した場合に発生する可能性があります。一連の収縮が速度または深さが異なる測定値もデータセットから除外する必要があります。
このシステムで得られた単一筋線維の収縮データは、異なる培養条件を比較するために使用できます。このシステムの有効性を 図4に示します。ここでは、2D(ラミニンコート培養プレート)と3D(フィブリンヒドロゲル)の両方の培養フォーマットでFDB筋線維の収縮を測定しました。ゲルに繊維を埋め込むことで、横方向の動きやその他の動きのアーチファクトが測定に影響を与えるのを防ぎ、3Dで使用可能な測定の割合が高くなりました(図4A)。繊維を埋め込むことは、2D培養繊維と比較して、サルコメア短縮または最大収縮速度の値のいずれにも有意な影響を及ぼさなかった(図4B)。さまざまなマトリックスがFDB筋線維の収縮にどのように影響するかを説明するために、このフィブリンヒドロゲルを純粋な基底膜マトリックス(4 mg/mL)と比較しました(図4C)。純粋な基底膜マトリックスで観察された収縮性の低下は、ゲルの剛性または細胞-マトリックス相互作用の増加によるものと考えられます。最大7 mg / mLのフィブリン濃度もテストされており、収縮速度と短縮に有意な影響はありません(未発表データ)。このフィブリンベースのヒドロゲルの使用は、収縮パラメータとの干渉を最小限に抑えることを保証します。
図1:FDB筋郭清手順の概要。 (A)後肢を足首より上で切断し(赤破線)、(B)青色破線に沿って足の上部に沿って切断して皮膚を切除する。(C)足は足首とつま先の皮膚を通して固定されています。(D)露出した筋肉とその周囲の結合組織の顕微鏡図。筋膜は、血管系が走る白い不透明な層として見えます。(E)筋膜を筋肉から取り除き、赤い破線に沿って腱を切断します。(F)FDB筋は、筋肉の下および横で持ち上げて切断することにより、下にある組織から分離されます。(G)つま先の腱がはっきりと見えるようになったら、FDBを赤い破線に沿って緩めます。(h)FDBは腱によって固定されており、第4外側腱とその繊維は赤い破線に沿って切断することによって除去することができる。余分な筋膜を取り除くことができます。 (I)洗浄後、FDB筋をコラゲナーゼ溶液に移す。スケールバー = (D-I) 2 mm。略語:FDB =屈筋指ブレビス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:24時間培養後のヒドロゲルに埋め込まれたFDB筋線維の顕微鏡像。 青い矢印:生存可能なFDB筋線維の例。黄色の矢印:ねじれたFDB筋線維の例。ねじれた筋線維は生存率を低下させ、収縮を損なう可能性があるため、測定から除外する必要があります。赤い矢印:過収縮FDB筋線維の例。過度の過収縮は、摩砕があまりにも激しく行われた場合、またはコラゲナーゼの過剰消化または非平衡化培地の使用によって引き起こされる可能性があります。スケールバー = 100 μm。略語:FDB =屈筋指ブレビス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:光学ベースのハイスループット収縮システムを使用して測定されたファイバー収縮過渡現象の例 。 (A)通常の収縮過渡の例。この過渡現象は、下部のツールバーに示されている紫色の四角で囲まれたサルコメアから得られます。過渡現象は、ベースラインでのサルコメアの長さ(緑)、収縮時間(青)、最大収縮時のサルコメアの長さ(紫)、および緩和時間(赤)のコンポーネントで構成されます。速度や収縮率などのパラメータは、これらの値から計算されます。(B)不十分な収縮過渡の例。これらの測定は、ノイズのためにサルコメア信号が拾われなかった場合に発生します(赤い矢印を参照)。(C)移動アーチファクトを持つ収縮過渡の例(緑色の矢印を参照)。運動アーチファクトは、収縮中に筋線維が焦点の外に移動するときに発生します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:光学ベースのハイスループット収縮システムを使用して、2D条件と3D条件、および異なるヒドロゲルを比較したときに得られた代表的なデータ 。 (A)30回の測定に基づく2D培養および3D培養におけるデータ分析プログラムによって検出された許容および拒否された収縮測定値の割合。(B)24時間培養後の3匹のマウスから分離した2D培養筋線維と3D培養筋線維の最大収縮速度の比較。(C)24時間培養後の3匹のマウスから分離した2D培養筋線維と3D培養筋線維におけるサルコメア短縮の比較。(D)24時間培養後の3匹のマウスから分離された純粋な基底膜マトリックス(マトリゲル)包埋筋線維とフィブリンヒドロゲル包埋筋線維の最大収縮速度の比較。(E)24時間培養後の3匹のマウスから分離された純粋な基底膜マトリックス(マトリゲル)包埋筋線維とフィブリンヒドロゲル包埋筋線維のサルコメア短縮の比較。データはスチューデントのt検定を使用して分析され、SD±平均として示されています。各データポイントは1つの筋繊維です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:筋肉を解剖するために用いられる解剖培地、単離された筋線維を培養するために用いられるフィブリン培養培地、および単離された筋肉を酵素的に消化するために用いられる筋肉消化培地の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ヒドロゲルをキャストするために使用されたセルミックスおよびヒドロゲルをキャストするために使用されたマトリックスミックスの組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、FDB筋線維の酵素的単離と培養を3D培養形式で実行し、その後、光学ベースの収縮測定システムを使用して収縮測定を行うためのプロトコルについて詳しく説明します。このプロトコルには、1)単一の筋肉から多くの無傷の筋線維を簡単かつタイムリーに分離するなど、多くの利点があります。2)調整可能なヒドロゲルマトリックスへの筋線維の埋め込み;3)光学ベースのシステムを使用したハイスループット収縮性測定の性能。4)介入後に同じ筋線維の繰り返し測定を行う能力。単一の生きた筋線維の単離は、それらの収縮機能を保持する成熟した筋細胞を提供する。マウスFDBから得られた筋線維は比較的小さいため、単離時に容易に操作され、まっすぐな形状を維持し、下流の収縮測定を可能にします。このシステムは、主に心筋細胞の収縮を研究するために開発されたが、骨格筋線維は、容易に区別可能なサルコメアパターニングを有する同じ収縮機構を含み、したがって、このシステムを用いて測定することもできる29。単一細胞収縮測定と生体 外 筋線維培養の結合は、電気的活性化に応答して成熟筋線維の健康と機能を評価するための強力なツールです。
解離した筋線維を使用することの制限は、線維に加えられる外力(すなわち、受動的伸張)の欠如であり、その結果、 in vivoで見られるものと比較して安静時サルコメア長が短くなる。2.4〜2.5μmのサルコメア長は最適な力の生成を保証しますが、静止サルコメアの長さは大きく変化する可能性があります33。FDBの in vivo 静止サルコメア長はまだ記載されていませんが、私たち自身の未発表データは平均2.2μmの長さを示唆しています。現在の結果は、培養24時間後の無負荷FDB繊維の平均休止サルコメア長~1.95 μmを示しています(図3)。この静止サルコメアの長さが低いと力の生成は低くなりますが、~1.95 μmの長さでも最大力34の>90%が生成されます。そのため、これらのサルコメアの長さは、異なる遺伝子モデル間または薬物治療後の線維機能の違いを決定するのに十分であるはずです。さらに、ヒドロゲルへの繊維の埋め込みは、浮遊する2D培養繊維と比較して接着のための多くの追加ポイントを提供し、時間の経過に伴うさらなるサルコメアの短縮を制限します。
この筋線維分離プロトコルの利点の1つは、長指伸筋(EDL)などの他の筋肉と比較して、比較的小さな筋線維で構成される簡単に解剖できる速筋を使用することです。サイズが小さいため、筋肉の分離は摩砕ベースの分離により適しており、それによって筋線維へのピペットまたはタングルによる損傷の可能性が減少します。FDB筋の細胞外マトリックスはコラゲナーゼで容易に酵素的に消化できるため、数百本の筋線維を短時間で単離することができます。ただし、消化不良は筋繊維の損傷につながる可能性があります。筋線維の過剰消化は、筋肉を粉砕するときに筋肉がほぼ瞬時にバラバラになったとき、または細胞播種手順中に細胞体積の大部分が過収縮したときに認識できます。筋肉の過剰消化を防ぐために、消化時間はコラゲナーゼバッチごとに最適化する必要があります。これをテストするには、2つのFDB筋肉を5分の互い違いの消化時間で並行して消化する必要があります。生存筋線維の収量が最も高い消化時間を選択する必要があります。次に、この最適化を2回目に実行し、消化時間に5分間の分離を行う必要があります。最高の生存筋線維を生み出す消化時間は、コラゲナーゼの現在のバッチの最適な消化時間として使用する必要があります。コラゲナーゼのバッチ間の変動を制限する別の方法は、原液1ミリリットルあたりの活性単位を直接計算し、後続のコラゲナーゼバッチを同じ量に再構成することです。最後に、消化時間は、例えば、細胞外マトリックス沈着の増加を示す老化または罹患動物を研究する場合など、異なるマウス系統間で最適化する必要があるかもしれない35,36。
生存可能な単離筋線維をピペッティングする可能性は、様々な培養条件でFDB筋線維を培養する可能性を開きます。そのような選択肢の1つは、天然の組織培養環境を模倣するためにヒドロゲル中でこれらの繊維を培養することである。この埋め込みプロトコルにより、収縮測定中に繊維が所定の位置に留まり、ゲルが固まる前に繊維がプレートの底に沈降できるように最適化されています。ただし、このプロトコルは、トロンビンとフィブリノーゲンのストックの違いに対応するために調整する必要があるかもしれません。トロンビン活性が高すぎると、ゲルが時期尚早に固まり、繊維が顕微鏡の焦点面の外側の高い場所に浮遊したままになることがあります。このような場合は、トロンビン:フィブリノーゲン比を調整する必要があります。これは、ますます低いトロンビン濃度で繊維をメッキし、重合にかかる時間に注意することによってテストできます。通常、これは30分より早く発生しないようにする必要があります。しかしながら、トロンビン濃度が低すぎると、重合プロセスを損なう可能性もある。繊維が正しい焦点面にあることを確認する別の方法は、最初に2Dプロトコルを使用して繊維を播種し、次に培養プレートに付着した後に繊維の上にヒドロゲルの層を追加することです。ただし、繊維から培地を除去すると、乾燥に敏感であるため、過収縮を引き起こす可能性があることに注意する必要があります。また、ヒドロゲルが培養プレートに完全に付着するかどうかも不明であり、より簡単に緩む可能性があります。したがって、この包埋手順は、繊維を生存可能に保ち、収縮測定のために所定の位置に保持するために好ましい。
このプロトコルを使用すると、成熟筋線維の収縮ダイナミクスを ex vivo で研究することができ、健康なマウスと筋肉疾患の遺伝子変異を持つマウスの両方に適用できます。同様に、培養条件や化合物の添加が筋繊維機能にどのように影響するかをテストすることができます。光学ベースのシステムを使用して得られた収縮データは、生きている単一筋線維の収縮能力の指標を与え、この能力の変化は繊維の健康と相関させることができます。しかし、これらのデータだけでは、これらの変化がアクチン-ミオシンの架橋または筋肉収縮のカルシウム放出段階で起こるかどうかを判断するには十分ではありません。このプロトコルではカルシウムシグナルを測定する方法については記載していないが、このセットアップは、収縮筋細胞29における富良系カルシウム一過性を測定することもできる。このシステムの欠点は、FDB筋が速筋型IIa/IIx筋線維のみを含み、このサイズの遅筋型I型線維を含む筋肉がまだ記載されていないことである37。これにより、この方法を使用して繊維タイプ固有の機能を研究することができなくなります。ここで提案するプロトコルは、EDLやヒラメ筋などの他の筋肉に適応して、繊維の種類の違いを研究する可能性があります。サイズが大きいため、このプロトコルはこれらの筋肉に対してさらに最適化する必要があります。長い繊維は重力沈降ステップ中に絡まる傾向があり、ピペッティングで操作すると破裂し、歩留まりが低下します。ピペッティングとは相容れないため、長い繊維はゲル包埋技術との互換性も低くなります。これらの繊維の測定は2D培養形式で行うことができますが、繊維はそのサイズのために収縮中にさらに動き回り、信号対雑音比に影響を与える可能性があります。このシステムの別の制限は、他の無傷の筋線維調製物28を使用して得ることができるそれらの力測定などの、収縮測定と並行して力測定を行うことができないことである。しかしながら、この制限は、筋線維によって生成される力を推定することによって回避することができる。筋線維の発生力は、収縮状態および弛緩状態の間の筋線維の形状およびマトリックスのヤング率がわかっている場合に推定できます25。それにもかかわらず、この光学ベースのシステムは、筋肉収縮機能を研究するための使いやすくハイスループットなアプローチを提供し、遺伝性筋疾患および治療的介入を研究するためのさまざまな新しい可能性を開きます。
Disclosures
著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、Sylvia Bogaards、Sanna Luijcx、Valentijn Jansen、Michiel Helmes、Emmy Mandersの技術的専門知識に感謝の意を表したい。この研究は、筋ジストロフィー協会(開発賞MDA603238をTJKに)、オランダ心臓血管同盟(TJKにタレントグラント)、および国立保健医療研究評議会(NHMRC、オーストラリア;フェローシップAPP1121651 MYに)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
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