Summary
Здесь мы опишем протокол, в котором подробно описывается, как проводить сонодинамическую терапию на модели глиобластомы мыши in vivo с использованием сфокусированного ультразвука под контролем магнитного резонанса.
Abstract
Сонодинамическая терапия (СДТ) - это применение сфокусированного ультразвука (ФУЗ), которое позволяет использовать соносенсибилизирующий агент для повышения чувствительности опухоли во время ультразвуковой обработки. К сожалению, современные клинические методы лечения глиобластомы (ГБМ) отсутствуют, что приводит к низким показателям долгосрочной выживаемости среди пациентов. СДТ является перспективным методом лечения ГБМ эффективным, неинвазивным и специфичным для опухоли способом. Соносенсибилизаторы преимущественно проникают в опухолевые клетки по сравнению с окружающей паренхимой головного мозга. Применение ФУЗ в присутствии соносенсибилизирующего агента приводит к образованию реакционноспособных окислительных форм, приводящих к апоптозу. Несмотря на то, что ранее в доклинических исследованиях было показано, что эта терапия эффективна, существует недостаток установленных стандартизированных параметров. Стандартизированные методы необходимы для оптимизации этой терапевтической стратегии для доклинического и клинического использования. В этой статье мы подробно описываем протокол выполнения SDT на доклинической модели грызунов GBM с использованием ФУЗИ под магнитно-резонансным контролем (ФУЗ с магнитно-резонансным наведением). МРТ ФУЗИ является важной особенностью этого протокола, поскольку она позволяет целенаправленно воздействовать на опухоль головного мозга без необходимости инвазивных операций (например, трепанации черепа). Настольное устройство, используемое здесь, может сфокусироваться на определенном месте в трех измерениях, щелкнув мишень на изображении МРТ, что делает выбор цели простым процессом. Этот протокол предоставит исследователям стандартизированный доклинический метод МРТ ФУЗ SDT с дополнительной гибкостью для изменения и оптимизации параметров трансляционных исследований.
Introduction
Глиобластома (ГБМ) — это форма высокоагрессивного рака головного мозга, которая встречается 3,21 на 100 000 человек и является наиболее распространенной злокачественной опухолью головногомозга. Текущий стандарт лечения включает хирургическую резекцию, лучевую терапию и химиотерапию2. Из-за инвазивного и инфильтративного характера опухоли полная резекция опухоли встречается редко. Остаточная ткань на краях опухоли приводит к высокой частоте рецидивов опухоли и низкой выживаемости менее 6% через 5 лет1.
В связи с таким прогнозом исследователи изучают новые терапевтические возможности для борьбы с этим смертельным заболеванием. Сонодинамическая терапия (СДТ) — это неинвазивное лечение, которое сочетает в себе низкоинтенсивный сфокусированный ультразвук (ФУЗ) и соносенсибилизирующие агенты для создания цитотоксического эффекта в клетках-мишенях3. Например, соносенсибилизаторы на основе порфирина, такие как 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК), преимущественно поглощаются опухолевыми клетками и увеличивают продукцию реактивных окислительных форм (АФК) до повреждающего уровня при воздействии сфокусированного ультразвука. Повышенная экспрессия АФК в клетках может повреждать клеточные структуры и запускать апоптоз. Поскольку 5-АЛК преимущественно поглощается опухолевыми клетками, здоровая ткань в области лечения не повреждается 3,4. Предварительные исследования in vitro показали, что многие раковые клетки лизируются при лечении SDT, хотя скорость гибели клеток зависит от клеточной линии. Предварительные исследования in vivo дают аналогичные результаты, подтверждающие, что СДТ может вызывать апоптоз5.
Этот протокол направлен на описание эффективных методов и параметров СДТ-лечения моделей грызунов с внутричерепно имплантированными клетками GBM с использованием настольной исследовательской платформы FUS. Исследователи могут использовать этот протокол для выполнения и оптимизации SDT для трансляционных исследований FUS.
Protocol
Все исследования на животных были одобрены и проведены в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Джонса Хопкинса. Атимические обнаженные самки мышей (возраст 10 недель) были получены из коммерческих источников (см. таблицу материалов). Были соблюдены все правила биобезопасности уровня 2 (BSL-2), включая использование масок, перчаток и халатов.
1. Имплантация опухолей и биолюминесцентная визуализация
- На начальном этапе исследования проводят внутричерепную имплантацию опухоли в соответствии с ранее опубликованным отчетом6.
Примечание: В этом исследовании 100 000 человеческих ксенотрансплантатов M59 GBM в 4 мкл клеточной суспензии были использованы для имплантации на глубину 3,0 мм в череп. - Перед началом лечения неинвазивно определите размер опухоли у каждой мыши с помощью системы люминесцентной визуализации in vivo (см. таблицу материалов) в соответствии с ранее опубликованным отчетом7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это было сделано в день лечения, через 7 дней после первоначальной имплантации опухоли. - Используя количественную оценку визуализации, разделите мышей на сопоставимые подгруппы для лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В это исследование были включены две подгруппы: (1) нелеченные мыши-опухоленосители (n = 4) и (2) мыши-опухоленосители, проходившие СДТ (n = 4). Статистически значимой разницы в размерах опухоли до лечения между двумя группами не наблюдалось (p > 0,05).
2. Организация дня лечения
- Извлеките гидрохлорид 5-ALA (см. Таблицу материалов) из морозильной камеры и взвесьте 200 мг/кг мышиного веса 5-ALA (например, для мыши весом 25 г взвесьте 5 мг). Делайте это только при естественном освещении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все оборудование перед использованием. - Растворите общее количество 5-АЛК в фосфатно-солевом буфере (PBS) таким образом, чтобы каждому животному вводили раствор 5-АЛК в дозе 60 мг/мл с правильной весовой дозировкой (например, для мыши весом 25 г растворите 5 мг 5-АЛК в 83,33 мкл PBS).
- Каждому животному в группе тестирования SDT вводят необходимое количество раствора 5-АЛК животному внутрибрюшинно (рассчитанно на шагах 2.1 и 2.2).
- Оставьте животных в клетках на 3 часа для метаболизма 5-АЛК.
3. Подготовка реквизитов для экспериментов
- Наполните резервуар деионизированной (DI) водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимой воды зависит от количества мышей, использованных в исследовании. - Подсоедините входные и выходные трубки к ультразвуковому дегазатору (см. Таблицу материалов) и подключите дегазатор к источнику питания (1 = ВКЛ, 0 = ВЫКЛ).
- Поместите другой конец трубок для входа и выхода в резервуар для воды DI.
- Включите дегазатор и работайте в течение 45 минут.
- Залейте только что дегазированную воду до верха герметичного герметичного контейнера, который будет использоваться во время исследования.
- Налейте ультразвуковой гель (см. Таблицу материалов) в коническую пробирку, а затем поместите в центрифугу и вращайте при 160 x g в течение 5 минут, чтобы удалить воздух из геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо достаточное количество геля, чтобы сформировать ложку геля на голове каждого животного.
4. Настройка системы MRgFUS
- Подключите систему MRgFUS (см. Таблицу материалов), используя электрическую схему, как показано на рисунке 1 (нижняя панель).
- Подключите все необходимые компоненты (настольный компьютер, монитор, платформу MRgFUS, осциллограф, усилитель) к источнику питания.
- Подсоедините все кабели в правильных местах.
- Подключите нужный преобразователь к платформе MRgFUS через BNC и коаксиальные кабели, а затем подключите соответствующий блок согласования импеданса к нужным проводам.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовался преобразователь с частотой 515 кГц.
- Включите все устройства.
- В операционной системе настольного компьютера откройте приложение AUREUS, которое уже интегрировано в системное программное обеспечение FUS.
- Выберите Подключить все оборудование, чтобы подключить оборудование к системе и убедиться, что компоненты взаимодействуют с программным обеспечением.
- Выберите используемый датчик, выбрав раскрывающееся меню и выбрав нужный датчик.
5. Инициализация
- Открутите нижний винт от фантома и заполните полость деионизированной и дегазированной водой до ее переполнения, а затем снова замените винт.
- Вставьте фантом в соответствующее место для МРТ-кровати (см. рисунок 2), а затем поместите МРТ-кровать в подставку МРТ в соответствующий слот.
- Поместите подставку для МРТ в соответствующее место в МРТ-сканере (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте подставку таким образом, чтобы фантомная МРТ-кровать могла скользить в отверстие МРТ без каких-либо препятствий для получения высококачественного изображения фантома. Отметьте это место, чтобы его можно было легко воспроизвести в будущем.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как это место будет найдено, оно не будет изменено до конца лечения. Поэтому убедитесь, что это подходящее место для размещения животного на МРТ, иначе всю регистрацию нужно будет повторить. - Сделайте МРТ-снимок фантома, используя настройки, указанные в таблице 1.
- Снимите подставку с отверстия магнита, но держите ее на сканере. Извлеките МРТ-кровать с фантомом из подставки, а затем поместите кровать с фантомом в систему MRgFUS, вставив штифт снизу в правильный паз.
- Вставьте наконечник приводки в магнитные пазы на кронштейне датчика так, чтобы он был направлен вниз к фантому (см. рисунок 2).
- В программном обеспечении выберите « Выбрать новое исходное положение», а затем выберите «Режим толчковой подачи », чтобы начать управляемый поиск с фокусировкой. После переключения режима толчковой подачи используйте клавиши влево, вправо, вверх, вниз, вверх и вниз, чтобы вручную перемещать рычаг датчика влево, вправо, вперед, назад, вверх и вниз соответственно.
- Отрегулируйте указатель вручную во всех трех измерениях до тех пор, пока кончик указателя не коснется середины крестообразного узора, лежащего в верхней части фантома (см. рисунок 2).
- Загрузите фантомные снимки МРТ на компьютер и поместите их в папку в выбранном каталоге, а затем загрузите изображения МРТ в программное обеспечение, выбрав Загрузить фантомные изображения. Осевые фантомные срезы заполнят экран с правой стороны. Прокручивайте эти срезы с помощью полосы прокрутки мыши. Отрегулируйте яркость, щелкнув и удерживая изображение, а затем переместив мышь вверх или вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо из файлов в папке не является несжатым файлом DICOM, то программное обеспечение не сможет прочитать и импортировать их, поэтому удалите все другие файлы из этой папки. - Прокрутите до любого изображения фантома, где есть четкий круг с тремя темными отверстиями в каждом. Нажмите на середину фантома, и появится красный кружок. Щёлкните и перетащите окружность до тех пор, пока она не станет одинаковой по диаметру и не выровняется с окружностью фантома (см. рисунок 2).
- Координаты этой позиции называются «исходной позицией»; Сохраните его , нажав кнопку Set L/R, A/P и S/I.
- Нажмите кнопку « Режим толчковой подачи выкл.», извлеките наконечник приводки из кронштейна датчика и выберите «Выйти из режима поиска фокусировки». Подтвердите исходное положение, чтобы завершить последовательность инициализации.
6. Подготовка животных к СДТ
- Обезболивайте мышь с помощью газовой смеси изофлуран-О2 в индукционной камере. Установите скорость потока газа на 1,0 мл/мин, а испаритель на 2,0% для индукции анестезии, обычно требующей 3-5 минут в камере (см. Таблицу материалов).
- Оцените животное на предмет адекватного седативного эффекта, ущипнув палец ноги. Наносите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы избежать сухости роговицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте глубину анестезии на протяжении всей процедуры. - Введите мыши 40 мкл гадолиниевого контрастного вещества через хвостовую вену (см. таблицу материалов).
- Удалите все волосы, препятствующие коже головы над черепом, с помощью крема для удаления волос и электронной бритвы.
- Закрепите животное на кровати МРТ, выполнив следующие действия (см. рисунок 3).
- Подсоедините входную трубку кровати МРТ (Рисунок 3А) к источнику изофлурана для анестезии и установите скорость потока газа на 1,0 мл/мин и испаритель на 2,0% для индукции анестезии. Подсоедините выпускную трубку к канистре с угольным фильтром для абсорбции анестезии.
- Поместите часть носового обтекателя в паз, как показано на рисунке 3B. Проденьте прикусную планку через отверстия прикусной планки как в носовом конусе, так и в конце кровати, как показано на рисунке, при этом конец накуски нависает над открытым отверстием в МРТ-кровати.
- Положите животное на кушетку для МРТ так, чтобы его уши были выровнены со стереотаксическими отверстиями в ушных планках, и зафиксируйте его зубами через накладку на прикус, чтобы удержать ее на месте. Сдвиньте носовой конус вперед так, чтобы он оказался над мордой животного, чтобы обеспечить постоянный поток анестезии.
- Проденьте ушные стержни через отверстия с обеих сторон кровати для МРТ и поднимите голову животного до тех пор, пока обе ушные планки не войдут в ушные каналы мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не надавливайте слишком сильно, так как это может повредить барабанные перепонки животного. - Следите за тем, чтобы животное находилось в удобном положении. Затем с помощью плоской отвертки вкрутите винты, совместимые с МРТ, чтобы зафиксировать обе ушные дуги, носовой конус и прикусную планку. Это зафиксирует животное на месте и предотвратит любое движение головы до тех пор, пока животное не будет извлечено из лежанки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что после этого шага положение животного на кровати МРТ не нарушено. Если животное двигается, то всю настройку (шаг 6.5) нужно будет повторить, независимо от того, как далеко продвинулся протокол. - Пока животное ждет, положите кровать для МРТ на теплую грелку, чтобы поддерживать температуру тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте и поддерживайте температуру тела на протяжении всей процедуры.
- Изофлуран непрерывно подается животному через трубки, прикрепленные к носовым конусам на протяжении всего лечения, когда лежанка животного закреплена на системе FUS, с помощью приспособлений, предусмотренных на платформе.
7. Процедуры МРТ
- Возьмите МРТ-кровать со стереотаксически зафиксированным животным и поместите ее в подставку для МРТ, предварительно подключенную к МРТ-сканеру (см. Таблицу материалов), прикрепив отверстие для кровати МРТ на его конце к штифту на подставке для МРТ, как показано на рисунке 3. Прикрепите входную и выходную анестезиологические трубки к соответствующим трубкам в аппарате МРТ.
- Вставьте подставку для МРТ с животным в отверстие для МРТ, убедившись, что положение осталось таким же, как и там, где был помещен фантом.
- Выполните локализатор, чтобы увидеть расположение мозга животного, а затем МРТ-сканирование с учетом контрастного вещества, охватывающее весь мозг, используя настройки МРТ из таблицы 2.
- Экспортируйте МРТ-снимок в виде набора несжатых файлов DICOM, по одному для каждого среза.
8. Лечение фокусированным ультразвуком (Рисунок 4)
- Извлеките животное из люльки для МРТ после завершения сканирования и поместите его на платформу, вставив переднюю часть кровати в соответствующий колышек в задней части платформы, а спинку кровати — в соответствующий колышек.
- Подсоедините входную трубку кровати МРТ к источнику изофлурана для анестезии и установите скорость потока газа 1,0 мл/мин и испаритель 2,0% для поддержания анестезии. Подсоедините выпускную трубку к канистре с угольным фильтром для абсорбции анестезии.
- Перенесите набор DICOM-файлов на компьютер и поместите их в папку в основном рабочем каталоге текущего исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требования к файлам см. в шаге 5.9. - В программном обеспечении перейдите на главную страницу инициализации и включите режим толчковой подачи, щелкнув «Управляемый поиск фокуса», а затем нажмите «Режим толчковой подачи».
- Нанесите каплю центрифугированного ультразвукового геля на голову животного с достаточным количеством геля, чтобы покрыть всю кожу головы над черепом.
- Залейте дизонированную и дегазированную воду в водяную баню до 80%, а затем установите водяную баню на соответствующие колонны на платформе.
- Опускайте водяную баню, наполненную дизонированной водой, до тех пор, пока нижняя мембрана не коснется ультразвукового геля на голове животного, образуя соединительную поверхность между водой и гелем. Убедитесь, что гель для ультразвука покрывает всю голову животного до водяной бани и что в геле для ультразвука между водяной баней и кожей головы мыши нет пузырьков воздуха.
- Погрузите ультразвуковой датчик в водяную баню, убедившись, что на поверхности датчика не образуются пузырьки воздуха.
- Опустите рычаг датчика с помощью режима толчковой подачи вниз к частично погруженному преобразователю и соедините его с датчиком, совместив магнитные пазы друг с другом, в то время как поверхность преобразователя остается погруженной.
- Отключите режим толчковой подачи, а затем выйдите из режима сфокусированного поиска, как это было сделано на этапе инициализации. Убедитесь, что вы подтвердили исходное положение, как и раньше.
- Перейдите на вкладку «Лечение», а затем загрузите файлы МРТ с учетом Т1-контраста, щелкнув значок папки в верхней части экрана. Выберите папку, содержащую файлы DICOM, которые были загружены на компьютер ранее, и откройте их. На этом шаге все файлы DICOM должны автоматически загрузиться в правую верхнюю панель.
- Затем на вкладке «Режим ультразвука » выберите подходящий режим лечения, выбрав « Импульс » или «Непрерывная волна». Если включен режим серийной съемки, на вкладке «Настройки ультразвуковой обработки » введите длину пакета, период всплеска и количество периодов. Эти параметры будут соответствовать каждому месту ультразвукового воздействия. Если вы находитесь в режиме непрерывной волны, введите только продолжительность ультразвукового излучения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался режим непрерывной волны продолжительностью 120 с. - Нажмите на значок цели в верхней середине страницы и выберите правильные места на правильном срезе МРТ, куда должна быть направлена фокальная область ФУЗ. Светло-красный квадрат с красным кругом будет присутствовать там, где вы щелкнули. Можно выбрать более одного варианта.
- Слева от МРТ-изображения находится таблица, которая будет заполнена 3D-координатами выбранных фокальных областей. В последнем столбце таблицы введите уровень мощности, подлежащий ультразвуковой обработке в каждой фокальной точке, который можно рассчитать отдельно для каждого преобразователя, используемого для получения желаемых уровней давления или интенсивности. Нажмите на каждую фокальную точку в таблице для подтверждения, в результате чего координаты будут выделены, а соответствующая фокальная область на изображении станет синей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к техническому описанию датчика, чтобы определить, как перевести уровень мощности, введенный в таблицу, в давление или интенсивность, поскольку эти значения зависят от датчика. - После того, как все фокусные области будут удовлетворены, выберите «Тест движения». Это побудит программное обеспечение переместить датчик ко всем фокусным точкам, чтобы убедиться, что движения возможны. После подтверждения программное обеспечение отобразит Тест движения завершен. При возникновении ошибки отрегулируйте фокальные области так, чтобы они могли соответствовать 3D-осям двигателей преобразователей.
- Когда все будет готово, выберите «Начать ультразвуковую обработку », чтобы начать протокол ультразвуковой обработки, перемещая датчик и применяя правильные параметры FUS в каждой выбранной фокальной области.
- После завершения ультразвуковой обработки отсоедините датчик от кронштейна, снимите водяную баню с платформы и сотрите ультразвуковой гель с кожи головы животного.
- Открутите прикусную и ушную планки, извлеките животное из МРТ-кровати, а затем положите животное на теплую прокладку до тех пор, пока животное не очнется от наркоза. В этот момент верните животное в клетку.
- Для последующих животных повторите тот же протокол, начиная с раздела 6.
- После того, как желаемые животные будут обработаны, очистите все поверхности, к которым прикасаются животные, 70% этанолом (см. Таблицу материалов).
- Выйдите из программного обеспечения, а затем выключите и выключите каждую единицу оборудования.
9. Этапы после обработки
- Повторите протокол системы визуализации in vivo (IVIS) из раздела 1 для измерения биолюминесценции через 24 часа после лечения. Чтобы проанализировать эффективность лечения, сравните записи биолюминесценции до и после лечения, чтобы определить скорость роста как для получавших, так и для необработанных групп.
- Выполните последующее МРТ-сканирование, используя те же настройки, что и на шаге 6.4. Используя сканирование с контрастным усилением, сравните среднюю интенсивность в оттенках серого области опухоли или рассчитайте общий объем, который покрывает контрастное вещество, чтобы определить различия в объеме опухоли до и после лечения.
Representative Results
Размер опухоли уменьшается у животных, получавших SDT через 24 часа после лечения.
В день обработки СДТ исходный средний сигнал биолюминесценции для контрольной и лечебной групп (N = 4 каждая) составлял 2,0 х 10 6 ± 3,1 х 10 6 и 2,3 х 10 6 ± 1,3 х 10 6/с/см2/ср соответственно. Средние значения биолюминесценции, соответствующие размерам опухоли до лечения между двумя группами, не были статистически значимыми (р = 0,89). Средний сигнал биолюминесценции в группе лечения составил 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 ч после SDT, в то время как биолюминесцентный сигнал в контрольной группе был увеличен до 5,5 x 10 6± 8,2 x 10 6/с/см2/ср. Как показано на рисунке 5, это соответствует темпам роста 83,4% ± 78% и 172% ± 34% соответственно при экспоненциальном росте (p = 0,08). Из четырех животных, получавших лечение, три имели более низкие темпы роста после лечения по сравнению с контрольной группой. В группе лечения был один выброс, который показал сопоставимый рост с контрольной группой, искажая отклонения.
Кроме того, животные подвергались последующей МР-визуализации с контрастированием на следующий день после лечения для сравнения опухоли до и после лечения. Средняя интенсивность контрастного вещества в оттенках серого в опухолях проводилась для каждого среза МРТ для каждого животного, чтобы измерить, сколько контрастного вещества попало в опухоли после лечения, в качестве оценки размера опухоли. До лечения средняя интенсивность опухоли в оттенках серого между контрольной и пролеченной группами была одинаковой. В среднем эта интенсивность оттенков серого увеличилась в контрольной группе до большей величины, чем в пролеченных группах, хотя это не было значимым (p = 0,47). Эти данные можно увидеть в таблице 2. Высокая вариабельность этих результатов, возможно, связана с тем, что МРТ была сделана только через 24 ч после лечения, когда терапевтический потенциал СДТ только начинает проявляться. Тем не менее, на рисунке 6 показан пример повреждений, вызванных SDT.
Рисунок 1: Настройка системы FUS. (Наверх) Система MRgFUS с маркированными компонентами. (Спереди) 1. Платформа. 2. Осевой моторизованный рычаг датчика. 3. Преобразователь FUS. 4. Водяная баня. 5. Койка для МРТ. 6. Монитор. 7. Коробка согласования импеданса преобразователя. 8. Коробка усилителя мощности. 9. Генератор функций. 10. Функция генератора канала 1 порта BNC. 11. Настольный компьютер. (Внизу) Система MRgFUS со схемой подключения с цветовой кодировкой со следующими соединениями. (Назад) 1. Шнуры питания. 2. Монитор HDMI на настольный HDMI. 3. Порт B USB B на настольный USB A. 4. Осциллограф LAN Ethernet на настольный Ethernet. 5. Интерфейс движения Ethernet к настольному Ethernet. 6. Осциллограф вспомогательный вход/выход BNC на вход AWG BNC. 7. Осциллограф канал 1 (фронтальный) BNC на SYNC BNC. 8. Согласующий выход BNC на ВЧ вход коаксиальный. 9. Коаксиальный РЧ-выход к согласующей коробке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фантомная регистрация. (A) Настройка системы и программного обеспечения во время фантомной регистрации. (B) Снимок экрана фантомной регистрации, где красный кружок - выбранная окружность осевого сечения. (C) Фантом, размещенный на кровати МРТ, вид сверху. (D) Вид фантома сбоку, где красная линия находится в осевом срезе, соответствующем окружности в C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Размещение животных. (A) Кровать и колыбель для МРТ с маркировкой различных частей: 1. Люлька для МРТ. 2. Стереотаксическая МРТ-кровать. 3. Ушные планки. 4. Прикусная планка. 5. Носовой конус. 6. Отверстие для колышка кровати МРТ. 7. Изофлурановые наркозные трубки. (B) Иллюстрация, показывающая размещение мыши на кровати МРТ и размещение на подставке с радиочастотной катушкой (оранжевая) (иллюстрация изменена с использованием шаблона Biorender 2022). (C) Иллюстрация, показывающая размещение мыши на кровати МРТ во время лечения ФУЗИ (иллюстрация изменена с использованием шаблона Biorender 2022). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Выбор фокусной точки. Пример выбора точки ультразвука у одного животного. Каждый столбец представляет собой Т1-взвешенный срез МРТ после контрастирования, где каждый срез составляет 0,5 мм в проксимальном (срез 1) направлении к дистальному (срез 5). Граница опухоли была сегментирована вручную и очерчена красным цветом (строка 1), а соответствующие места ультразвуковой обработки (строка 2) представлены светло-зеленым квадратом (фокусный максимум центр) и синим кругом (половина фокальной окружности). Каждая локация подвергалась ультразвуковой обработке в течение 2 минут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Темп роста после СДТ. Скорость роста опухолей ГБМ от до 24 ч после лечения СДТ у пролеченных и нелеченных (контрольных) животных с внутричерепными опухолями М59 на основе измеренной люминесценции. Столбцы погрешности показывают стандартное отклонение. Для определения значимости был проведен двухвыборочный Т-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Повреждение, вызванное SDT. Т1-взвешенные МРТ-снимки до и после контрастирования на животной модели с репрезентативным аксиальным срезом, показывающим поражение в опухоли, созданной с помощью SDT. (Слева) Магнитно-резонансная томография, сделанная перед лечением SDT, опухоль выделена красным цветом. (Средний) Выбор фокальной точки FUS, где максимальное давление представлено светло-голубыми кружками, а области половинного максимального давления представлены синими кругами. (Справа) МРТ-сканирование после SDT, где опухоль обведена красным цветом. Показаны поражения, созданные SDT, и шприцевое отверстие для имплантации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Последовательность | Т1 |
| Время повторения | 3000 мс |
| Время эха | 30 мс |
| Толщина среза | 0,5 мм |
| Количество срезов | 25 |
| Расстояние между пикселями | 0,187 x 0,187 мм |
| Матрица приобретения | 133 х 133 |
| Средние | 4 |
Таблица 1: Настройки МРТ.
| Контроль | Группа СДТ | P-значение | |
| Предварительная обработка | 7,49 х 10 3 ± 2,2 х 103 | 7,48 х 10 3 ± 1 х 103 | 0.99 |
| Последующая обработка | 8,79 х 103 ± 7,7 х 102 | 7,95 х 10 3 ± 1,1 х 103 | 0.33 |
| Разница в процентах | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
Таблица 2: Постконтрастное усиление Т1-взвешенной шкалы серого МРТ.
Discussion
Для пациентов с ГБМ необходимы новые терапевтические и эффективные методы лечения. В этом протоколе описан доклинический ФУЗ-опосредованный метод лечения ГБМ, который в настоящее время проходит обширные исследования для клинического перевода. Несмотря на то, что СДТ обладает огромным потенциалом, в доклинических условиях еще многое предстоит понять и оптимизировать.
Одним из наиболее важных компонентов этого протокола является использование ФУЗИ под контролем МРТ для нацеливания на опухоль для достижения максимальной эффективности. С помощью фантома можно создать 3D координатное пространство, где каждому пикселю осевых срезов МРТ может быть присвоена координата. Затем простая процедура выбора места ультразвукового излучения на МР-изображении сообщает датчику, куда следует нацелиться. Используемая доклиническая система ФУЗ очень универсальна и применима при нацеливании на участки специфической патологии, такой как опухоль, включая более глубоко расположенные опухоли, на которые было бы трудно нацелиться без подтверждения визуализации. Использование гадолиния в качестве контрастного вещества обеспечивает четкую визуализацию опухоли, что позволяет пользователю принимать обоснованные решения при выборе мишеней. Преимущество SDT перед многими другими методами лечения заключается в том, что это опухолеспецифичная терапия. Низкоинтенсивное ФУЗИ должно воздействовать только на опухолевую ткань, оставляя здоровую паренхиму мозга относительно нетронутой 3,8.
Результаты этого эксперимента подчеркивают, как преимущества этого протокола могут привести к терапевтическим результатам, аналогичным другим выводам в литературе по СДТ. На рисунке 5 показано, что уже через 24 ч после дня лечения наблюдалось замедление роста опухоли в группе пациентов, получавших лечение. Несмотря на то, что при таком небольшом размере выборки значимость может быть незначительной, она может привести к большему количеству животных. Эта задержка роста опухоли аналогична той, что была показана в новаторской работе по этой теме Wu et al. (2019), в которой было продемонстрировано замедление роста опухоли с течением времени у животных, получавших лечение, а также увеличение времени выживания9.
При разработке этого протокола учитывались штамм животного, тип опухоли и выбор соносенсибилизирующего агента. Атимические голые мыши были выбраны для этого протокола по нескольким причинам. Во-первых, нюдистскую мышь легче обрабатывать ультразвуком, так как отсутствие волос предотвращает затухание. Кроме того, отсутствие иммунной системы позволяет имплантировать ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), чтобы модель опухоли была более приближена к клинической ситуации. Недостатком использования атимической модели является то, что иммунная система не может быть охарактеризована, поэтому любой иммунный ответ, генерируемый SDT, не будет измеряться вэтих исследованиях. Выбранная линия опухоли является агрессивной и быстрорастущей линией PDX. Время лечения очень важно, потому что установление опухоли должно быть проверено, но опухолевая нагрузка не должна заполнять полушарие черепа. Для разных клеточных линий требуется разное время инкубации для получения опухоли оптимального размера для доклинических экспериментов. В этом протоколе 5-АЛК использовалась в качестве соносенсибилизатора из-за ее преимущественного поглощения при опухолях GBM, что было подтверждено in vitro для этой клеточной линии в предыдущих экспериментах (неопубликованные данные). Другие соносенсибилизаторы могут быть заменены и протестированы, чтобы определить соединение, наиболее подходящее по эффективности и безопасности. Наконец, лечение было начато через 3 ч после инъекции 5-АЛК, так как предыдущая литература показала, что это оптимальное время при такой дозировке инъекции5.
Параметры ФУ, выбранные в этом протоколе (10 Вт/см2 в течение 2 мин при 515 кГц в каждом целевом месте), были определены на основе обзора предыдущей литературы и первоначальных экспериментов 4,9. Была выбрана сетка точек ультразвукового воздействия, охватывающая всю опухоль, чтобы создать эффект АФК по всей опухоли. Интенсивность, используемая здесь, выше, чем в других публикациях, но в течение короткого промежутка времени не ожидается, что это приведет к каким-либо неблагоприятным эффектам, связанным с температурой, поскольку интенсивность до 25 Вт/см2 была успешно использована в мышиной модели без существенных побочных эффектов11. Важно отметить, что в литературе не было опубликовано ни одного стандартизированного или оптимизированного набора параметров FUS. Таким образом, конкретные значения, которые здесь сообщаются, могут быть скорректированы для определения оптимального набора параметров, что приведет к максимальному уменьшению опухолевой ткани при сохранении безопасности. Кроме того, поскольку разные клеточные линии имеют разный уровень васкуляризации и гипоксии, это лечение может нуждаться в корректировке. Мы показали общее снижение роста опухоли (рис. 5) в течение 24 ч после лечения SDT, хотя параметры должны быть оптимизированы и необходимо протестировать больше животных, чтобы определить максимальный эффект этого лечения. Результаты МРТ после лечения не показывают появления поражений, созданных ФУЗ-терапией в здоровых тканях, с эффектом, локализованным в опухолевой ткани (рис. 6). Существует также возможность комбинировать СДТ с другими методами ФУЗ, такими как временная пермеабилизация гематоэнцефалического барьера, для максимального поглощения 5-АЛК в опухоли12. Этот протокол может быть дополнительно дополнен выполнением различных методов гистологии для проверки безопасности и эффективности на структурном уровне. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) может быть выполнено для проверки структурных или опухолевых повреждений13, в то время как окрашивание терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) может быть выполнено для проверки клеточного апоптоза14. Несмотря на это, этот протокол представляет собой безопасное и специфичное для опухоли лечение, при котором изменения заметны даже через 24 часа после лечения, что очевидно при сравнении скорости роста опухолей, получавших SDT, и нелеченных опухолей, а также при сравнении срезов опухоли до и после ультразвуковой обработки.
В любом протоколе всегда есть недостатки или ограничения, которые необходимо взвесить. Основным ограничением текущего протокола являются временные и финансовые затраты. Между тем, одним из преимуществ этого протокола является его автоматизированное сфокусированное наведение. Чтобы выполнить эту целенаправленную процедуру, необходимо сделать МРТ-сканирование для каждого отдельного животного, чтобы убедиться, что цель опухоли правильная, что может быть трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, в зависимости от желаемого количества фокусных точек, количество времени для выполнения этого протокола может составлять часы даже для нескольких животных, что приводит к низкому количеству экспериментальных животных. Несмотря на эти недостатки, этот целевой неинвазивный протокол остается приемлемым по сравнению с вариантами открытой хирургии.
В заключение, этот протокол показал способность лечения SDT снижать рост опухоли в головном мозге в течение 24 часов после лечения, сохраняя при этом здоровую нервную ткань в доклинической мышиной модели. Для того, чтобы сделать это лечение клинически целесообразным, необходимы исследования эффективности СДТ и оптимизация различных параметров для увеличения продукции АФК. Необходимо изучить новые возможности использования СДТ в качестве неинвазивной терапевтической модели.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов. Амир Манбачи преподает и консультирует компании BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, а также является изобретателем ряда запатентованных технологий FUS. Бетти Тайлер финансирует исследования от NIH и является совладелицей компании Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. также лицензировала один из ее патентов, и она является акционером Peabody Pharmaceuticals (*включая акции или опционы).
Acknowledgments
Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), премии Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов ASME (DARPA) (#: N660012024075) и Программы клинических исследований (KL2) Института клинических и трансляционных исследований Джонса Хопкинса (ICTR), администрируемой Национальным центром развития трансляционных наук (NCATS) Национальных институтов здравоохранения (NIH). Клетки были приобретены и предоставлены Фондом медицинского образования и исследований Майо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
