Summary
Aqui, descrevemos um protocolo que detalha como realizar a terapia sonodinâmica em um modelo de glioblastoma in vivo de camundongo usando ultrassom focado guiado por ressonância magnética.
Abstract
A terapia sonodinâmica (TAS) é uma aplicação do ultrassom focalizado (FUS) que permite que um agente sonossensibilizante estimule tumores para aumentar a sensibilidade durante a sonicação. Infelizmente, os tratamentos clínicos atuais para glioblastoma (GBM) estão faltando, levando a baixas taxas de sobrevida em longo prazo entre os pacientes. A TFD é um método promissor para o tratamento da GBM de forma eficaz, não invasiva e tumor-específica. Os sonosensibilizadores entram preferencialmente nas células tumorais em comparação com o parênquima cerebral circundante. A aplicação de USF na presença de um agente sonossensibilizante gera espécies oxidativas reativas, resultando em apoptose. Embora essa terapia tenha se mostrado eficaz anteriormente em estudos pré-clínicos, há uma falta de parâmetros padronizados estabelecidos. Métodos padronizados são necessários para otimizar essa estratégia terapêutica para uso pré-clínico e clínico. Neste trabalho, detalhamos o protocolo para a realização da TFD em um modelo pré-clínico de roedores GBM utilizando USF guiado por ressonância magnética (MRgFUS). MRgFUS é uma característica importante deste protocolo, pois permite o direcionamento específico de um tumor cerebral sem a necessidade de cirurgias invasivas (por exemplo, craniotomia). O dispositivo de bancada usado aqui pode se concentrar em um local específico em três dimensões clicando em um alvo em uma imagem de ressonância magnética, tornando a seleção do alvo um processo simples. Este protocolo fornecerá aos pesquisadores um método pré-clínico padronizado para MRgFUS SDT, com a flexibilidade adicional para alterar e otimizar parâmetros para pesquisa translacional.
Introduction
O glioblastoma (GBM) é uma forma de câncer cerebral altamente agressivo que tem uma incidência de 3,21 por 100.000 pessoas e é o tumor cerebral maligno mais comum1. O tratamento atual inclui ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia2. Devido à natureza invasiva e infiltrativa do tumor, a ressecção completa do tumor é rara. O tecido residual nas margens do tumor resulta em alta taxa de recidiva tumoral e baixa sobrevida inferior a 6% após 5anos1.
Devido a esse prognóstico, os pesquisadores estão explorando novas opções terapêuticas para combater essa doença mortal. A terapia sonodinâmica (TAS) é um tratamento não invasivo que combina ultrassom focalizado (FUS) de baixa intensidade e agentes sonossensibilizantes para produzir um efeito citotóxico em células-alvo3. Como exemplo, sonossensibilizadores à base de porfirina, como o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), são preferencialmente absorvidos por células tumorais e aumentam a produção de espécies oxidativas reativas (EROs) a níveis prejudiciais quando expostos ao ultrassom focado. Níveis superexpressos de ERO nas células podem danificar estruturas celulares e desencadear apoptose. Como o 5-ALA é preferencialmente absorvido por células tumorais, o tecido normal da região de tratamento permanece ileso 3,4. Estudos preliminares in vitro revelaram que muitas células cancerosas são lisadas pelo tratamento SDT, embora a taxa de morte celular seja dependente da linhagem celular. Estudos preliminares in vivo mostram resultados semelhantes, confirmando que a TSF pode desencadear apoptose5.
Este protocolo tem como objetivo descrever técnicas e parâmetros eficazes para o tratamento da TPD de modelos de roedores com células GBM implantadas intracranialmente utilizando uma plataforma de pesquisa FUS de bancada. Os pesquisadores podem usar esse protocolo para realizar e otimizar a TFS para pesquisa translacional de USF.
Protocol
Todos os estudos em animais foram aprovados e conduzidos de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC). Camundongos fêmeas atímicas nuas (idade: 10 semanas) foram obtidas de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todas as normas de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2) foram seguidas, incluindo o uso de máscaras, luvas e aventais.
1. Implantes tumorais e imagens por bioluminescência
- Durante a fase inicial do estudo, realizar implante de tumor intracraniano, seguindo relato previamentepublicado6.
NOTA: Neste estudo, 100.000 células M59 humanas de xenoenxerto GBM em 4 μL de suspensão celular foram usadas para implantação a uma profundidade de 3,0 mm no crânio. - Antes do tratamento, quantificar o tamanho do tumor em cada camundongo de forma não invasiva usando um sistema de imagem por luminescência in vivo (ver Tabela de Materiais) seguindo um relatório publicado anteriormente7.
OBS: Isso foi feito na data do tratamento, 7 dias após o implante tumoral inicial. - Usando a quantificação de imagem, divida os camundongos em subgrupos comparáveis para o tratamento.
NOTA: Neste estudo, dois subgrupos foram incluídos: (1) camundongos portadores de tumor não tratados (n = 4) e (2) camundongos portadores de tumor submetidos à TFS (n = 4). Não houve diferença estatisticamente significante no tamanho do tumor pré-tratamento entre os dois grupos (p > 0,05).
2. Configuração do dia do tratamento
- Remova o cloridrato de 5-ALA (ver Tabela de Materiais) do congelador e pese 200 mg/kg de peso de 5-ALA (por exemplo, para um rato de 25 g, pesar 5 mg.). Faça-o apenas com luz ambiente.
OBS: Estéril todo o equipamento antes do uso. - Dissolver a quantidade total de 5-ALA em solução salina tamponada com fosfato (PBS), de modo que cada animal receba uma solução de 60 mg/mL de 5-ALA com a dosagem de peso correta (por exemplo, para um camundongo de 25 g, dissolver 5 mg de 5-ALA em 83,33 μL de PBS).
- Para cada animal do grupo de ensaio SDT, injectar a quantidade adequada de solução de 5-ALA no animal por via intraperitoneal (calculada nos passos 2.1 e 2.2).
- Deixar os animais em suas gaiolas por 3 h para metabolizar o 5-ALA.
3. Preparação dos requisitos para experimentos
- Encha um reservatório com água deionizada (DI).
NOTA: A quantidade de água necessária é baseada no número de ratos usados no estudo. - Conecte os tubos de entrada e saída de fluxo ao desgaseificador ultrassônico (consulte Tabela de materiais) e conecte o desgaseificador à alimentação (1 = ON, 0 = OFF).
- Coloque a outra extremidade dos tubos de entrada e saída de fluxo no reservatório de água DI.
- Ligue o desgaseificador e aguarde 45 min.
- Encha a água recém-desgaseificada até o topo de um recipiente hermético e selado para ser usado durante o estudo.
- Despeje o gel de ultrassom (ver Tabela de Materiais) em um tubo cônico e, em seguida, coloque em uma centrífuga e gire a 160 x g por 5 minutos para remover qualquer ar do gel.
NOTA: É necessário gel suficiente para formar um boneco de gel na cabeça de cada animal.
4. Configuração do sistema MRgFUS
- Conecte o sistema MRgFUS (consulte Tabela de Materiais) usando o diagrama de fiação como visto na Figura 1 (painel inferior).
- Conecte todos os componentes necessários (computador desktop, monitor, plataforma MRgFUS, osciloscópio, amplificador) à alimentação.
- Conecte todos os cabos aos locais corretos.
- Conecte o transdutor desejado à plataforma MRgFUS através dos cabos BNC e coaxiais e, em seguida, conecte a caixa de correspondência de impedância correspondente aos fios corretos.
OBS: Um transdutor de 515 kHz foi utilizado para o presente estudo.
- Ligue todos os dispositivos.
- No sistema operacional do computador desktop, abra o aplicativo AUREUS, que já está integrado ao software do sistema FUS.
- Selecione Conectar todo o hardware para conectar o hardware ao sistema e verifique se os componentes estão se comunicando com o software.
- Selecione o transdutor usado selecionando o menu suspenso e escolhendo o transdutor desejado.
5. Inicialização
- Desparafuse o parafuso inferior do simulador e preencha a cavidade com água deionizada e desgaseificada até transbordar e, em seguida, substitua o parafuso novamente.
- Insira o simulador em seu local correspondente no leito de RM (ver Figura 2) e, em seguida, coloque o leito de RM no berço da RM em seu slot correspondente.
- Coloque o suporte de ressonância magnética em sua localização correspondente no scanner de ressonância magnética (consulte a Tabela de materiais). Ajuste o berço para que o leito de RM fantasma possa deslizar para dentro do furo da RM sem obstruções para obter uma imagem de alta qualidade do simulador. Marque esse local para que ele seja facilmente replicável no futuro.
NOTA: Uma vez que este local é encontrado, o local não será alterado para o restante do tratamento. Portanto, certifique-se de que é um local adequado para a colocação de ressonância magnética animal, ou todo o registro precisará ser repetido. - Faça uma ressonância magnética do simulador usando as configurações da Tabela 1.
- Remova o suporte do furo do ímã, mas mantenha-o no scanner. Remova a cama de ressonância magnética que contém o simulador do berço e, em seguida, coloque a cama com o simulador no sistema MRgFUS deslizando o pino na parte inferior para o slot correto.
- Coloque a ponta de registro nos slots magnéticos no braço do transdutor de modo que ele aponte para baixo em direção ao simulador (veja a Figura 2).
- No software, escolha Selecionar uma nova posição inicial e, em seguida, selecione Modo Jog ativado para iniciar a localização focada guiada. Depois que o modo de corrida for alternado, use as teclas esquerda, direita, para cima, para baixo, página para cima e página para baixo para mover manualmente o braço do transdutor nas direções esquerda, direita, frente, trás, para cima e para baixo, respectivamente.
- Ajuste o ponteiro manualmente em todas as três dimensões até que a ponta do ponteiro toque o meio do padrão de cruz que fica na parte superior do simulador (consulte a Figura 2).
- Baixe as imagens de RM fantasma para o computador e coloque-as em uma pasta no diretório escolhido e, em seguida, carregue as imagens de RM no software selecionando Carregar imagens fantasmas. As fatias axiais do fantasma preencherão a tela do lado direito. Percorra essas fatias através da barra de rolagem do mouse. Ajuste o brilho clicando e segurando na imagem e, em seguida, movendo o mouse para cima ou para baixo.
Observação : se qualquer um dos arquivos na pasta não são arquivos DICOM descompactados, em seguida, o software não será capaz de lê-los e importá-los, portanto, remova quaisquer outros arquivos dessa pasta. - Role até qualquer imagem do fantasma onde há um círculo claro com três buracos escuros em cada um. Clique no meio do fantasma e um círculo vermelho aparecerá. Clique e arraste o círculo até que ele tenha o mesmo diâmetro e se alinhe com a circunferência do simulador (veja a Figura 2).
- As coordenadas desta posição são referidas como "posição inicial"; salve isso clicando em Definir L/R, A/P e S/I.
- Clique em Modo Jog Desativado, remova a dica de registro do braço do transdutor e selecione Sair da Localização de Foco. Confirme a posição inicial para concluir a sequência de inicialização.
6. Preparação animal para SDT
- Anestesiar o camundongo usando uma mistura de gás isoflurano-O2 em uma câmara de indução. Ajuste a taxa de fluxo de gás para 1,0 mL/min e o vaporizador para 2,0% para indução anestésica, normalmente exigindo 3-5 minutos na câmara (consulte a Tabela de Materiais).
- Avaliar o animal quanto à sedação adequada, pinçando o dedo do pé. Aplique uma pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento das córneas.
NOTA: Monitorar a profundidade da anestesia durante todo o procedimento. - Injectar no rato 40 μL de contraste gadolínio através da veia caudal (ver Tabela de Materiais).
- Remova qualquer pelo que obstrua o couro cabeludo acima do crânio usando um creme de depilação e um barbeador eletrônico.
- Fixe o animal no leito de RM usando os seguintes passos (ver Figura 3).
- Conectar o tubo de entrada do leito de RM (Figura 3A) a uma fonte de isoflurano para anestesia e ajustar o fluxo de gás para 1,0 mL/min e o vaporizador para 2,0% para indução anestésica. Conecte o tubo de saída a um recipiente de filtro de carvão para absorção da anestesia.
- Coloque o pedaço do cone nasal em sua fenda, como mostra a Figura 3B. Deslize a barra de mordida através dos orifícios da barra de mordida no cone do nariz e no final da cama, como mostrado, com a extremidade do protetor de mordida pairando sobre o poço aberto no leito de ressonância magnética.
- Coloque o animal na cama de ressonância magnética com as orelhas alinhadas com os orifícios estereotáxicos da barra de orelha e prenda os dentes através do protetor de mordida para mantê-lo no lugar. Deslize o cone do nariz para a frente de modo que ele fique por cima do focinho do animal para fornecer um fluxo constante de anestesia.
- Deslize as barras auriculares através dos orifícios em ambos os lados da cama de ressonância magnética e levante a cabeça do animal até que ambas as barras auriculares possam caber nos canais auditivos do rato.
NOTA: Não vá muito longe, pois isso pode danificar os tímpanos do animal. - Certifique-se de que o animal está em uma posição confortável. Em seguida, usando uma chave de fenda de cabeça plana, parafuse os parafusos compatíveis com ressonância magnética para travar ambas as barras auriculares, o cone do nariz e a barra de mordida. Isso irá prender o animal no lugar e impedir qualquer movimento da cabeça até que o animal seja retirado da cama.
NOTA: Certifique-se de que não há nenhuma perturbação no posicionamento do animal no leito de ressonância magnética após esta etapa. Se o animal se mover, toda a configuração (etapa 6.5) precisará ser repetida, independentemente da distância ao longo do protocolo. - Enquanto o animal estiver esperando, coloque a cama de ressonância magnética em uma almofada térmica quente para manter a temperatura corporal.
NOTA: Monitorar e manter a temperatura corporal durante todo o procedimento.
- O isoflurano é fornecido continuamente ao animal através de tubos acoplados aos cones nasais durante todo o tratamento, quando o leito do animal é fixado no sistema FUS, utilizando as luminárias fornecidas na plataforma.
7. Procedimentos de RM
- Pegue o leito de RM com o animal estereotaticamente fixado e coloque-o no berço de RM previamente conectado ao scanner de RM (ver Tabela de Materiais), encaixando o orifício do leito de RM em sua extremidade ao pino no berço da RM, como mostrado na Figura 3. Conecte os tubos de anestesia de entrada e saída aos tubos correspondentes no aparelho de ressonância magnética.
- Deslize o berço da RM contendo o animal para dentro do furo da RM, certificando-se de manter o mesmo posicionamento de onde o simulador foi colocado.
- Realize um localizador para ver a localização do cérebro do animal e, em seguida, uma ressonância magnética ponderada em T1 pós-contraste cobrindo todo o cérebro usando as configurações de ressonância magnética da Tabela 2.
- Exporte a ressonância magnética como um conjunto de arquivos DICOM não compactados, um para cada fatia.
8. Tratamento ultrassonográfico focalizado (Figura 4)
- Retire o animal do berço da ressonância magnética após a conclusão do exame e coloque-o na plataforma, encaixando a frente da cama em seu pino correspondente na parte de trás da plataforma e encaixando a parte de trás da cama em seu pino correspondente.
- Conectar o tubo de entrada do leito de RM a uma fonte de isoflurano para anestesia e ajustar o fluxo de gás para 1,0 mL/min e o vaporizador para 2,0% para manutenção da anestesia. Conecte o tubo de saída a um recipiente de filtro de carvão para absorção da anestesia.
- Transfira o conjunto de arquivos DICOM para o computador e coloque-os em uma pasta no diretório de trabalho principal do estudo atual.
Observação : consulte a etapa 5.9 para requisitos de arquivo. - No software, vá para a página principal de inicialização e ative o Modo Jog clicando em Guided Focus Finding e, em seguida, clique em Jog Mode On.
- Coloque um punhado de gel de ultrassom centrifugado na cabeça do animal, com gel suficiente para cobrir todo o couro cabeludo acima do crânio.
- Despeje DI e água desgaseificada no banho-maria até 80% e, em seguida, encaixe o banho-maria em suas colunas correspondentes na plataforma.
- Abaixe o banho-maria preenchido com água DI até que a membrana inferior toque o gel de ultrassom na cabeça do animal, formando uma superfície de acoplamento entre a água e o gel. Certifique-se de que o gel de ultrassom cubra toda a cabeça do animal até o banho-maria e que não haja bolhas de ar no gel de ultrassom entre o banho-maria e o couro cabeludo do rato.
- Submerja o transdutor de ultrassom no banho-maria, garantindo que não se formem bolhas de ar na superfície do transdutor.
- Abaixe o braço do transdutor usando o Jog Mode Down em direção ao transdutor parcialmente submerso e acople-o ao transdutor alinhando os slots magnéticos entre si enquanto a superfície do transdutor permanece submersa.
- Desative o Modo Jog e, em seguida, Saia da Localização Focada, conforme feito durante a etapa de inicialização. Certifique-se de confirmar a posição inicial como feito antes.
- Vá para a guia de tratamento e, em seguida, carregue os arquivos de ressonância magnética ponderados em T1 pós-contraste clicando no ícone de pasta no meio superior da tela. Selecione a pasta que contém os arquivos DICOM que foram carregados no computador anteriormente e abra-os. Esta etapa deve carregar automaticamente todos os arquivos DICOM no painel superior direito.
- Em seguida, na guia Modo de Sonicação , selecione o modo de tratamento adequado escolhendo Burst ou Continuous Wave. Se estiver no modo de intermitência, na guia Configurações de Sonicação , insira o comprimento de intermitência, o período de intermitência e o número de períodos. Esses parâmetros corresponderão a cada local de sonicação. Se estiver no modo de onda contínua, insira apenas a duração da sonicação.
OBS: Neste estudo, o modo de onda contínua foi utilizado por uma duração de 120 s. - Clique no ícone de destino no meio superior da página e selecione os locais apropriados no corte correto de RM onde a região focal do FUS deve ser direcionada. Um quadrado vermelho claro com um círculo vermelho estará presente onde clicado. Mais de uma seleção pode ser escolhida.
- À esquerda da imagem da ressonância magnética há uma tabela, que preencherá com as coordenadas 3D das regiões focais selecionadas. Na última coluna da tabela, insira o nível de potência a ser sonicado, em cada ponto focal, que pode ser calculado separadamente para cada transdutor usado para obter os níveis de pressão ou intensidade desejados. Clique em cada ponto focal na tabela para confirmar, o que resultará no destaque das coordenadas, e a região focal correspondente na imagem ficará azul.
NOTA: Consulte a folha de dados do transdutor para determinar como converter o nível de potência inserido na tabela em pressão ou intensidade, pois esses valores são específicos do transdutor. - Quando estiver satisfeito com todas as regiões focais, selecione Teste de movimento. Isso solicitará que o software mova o transdutor para todos os pontos focais para garantir que os movimentos sejam possíveis. Após a confirmação, o software indicará Teste de Movimento Concluído. Se ocorrer um erro, ajuste as regiões focais para que elas possam caber dentro dos eixos 3D dos motores do transdutor.
- Uma vez pronto, selecione Begin Sonication para iniciar o protocolo de sonicação, movendo o transdutor e aplicando os parâmetros FUS corretos em cada região focal selecionada.
- Terminado o protocolo de sonicação, desacople o transdutor do braço do transdutor, retire o banho-maria da plataforma e limpe o gel de ultrassom do couro cabeludo do animal.
- Desparafuse a mordida e as barras auriculares, retire o animal do leito de ressonância magnética e, em seguida, coloque o animal em uma almofada quente até que o animal acorde da anestesia. Neste momento, devolva o animal à sua gaiola.
- Para os animais subsequentes, repetir o mesmo protocolo, a partir da seção 6.
- Uma vez que os animais desejados são tratados, limpe todas as superfícies tocadas pelos animais com etanol 70% (ver Tabela de Materiais).
- Saia do software e, em seguida, desligue e desligue cada equipamento.
9. Etapas pós-tratamento
- Repetir o protocolo do sistema de imagem in vivo (IVIS) da seção 1 para medição de bioluminescência 24 h após o tratamento. Para analisar a eficácia do tratamento, compare os registros de bioluminescência antes e após o tratamento para determinar a taxa de crescimento para os grupos tratados e não tratados.
- Execute exames de ressonância magnética de acompanhamento usando as mesmas configurações da etapa 6.4. Usando exames contrastados, comparar a intensidade média da escala de cinza da região tumoral ou calcular o volume total coberto pelo meio de contraste para determinar diferenças no volume tumoral pré e pós-tratamento.
Representative Results
O tamanho do tumor diminui nos animais tratados com TSD 24 h após o tratamento.
No dia do tratamento com TPD, a média original do sinal de bioluminescência para os grupos controle e tratamento (N = 4 cada) foi de 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 e 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr, respectivamente. Os valores médios de bioluminescência correspondentes ao tamanho do tumor antes do tratamento entre os dois grupos não foram estatisticamente significativos (p = 0,89). O sinal de bioluminescência médio do grupo tratamento foi de 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 h após TPS, enquanto o sinal bioluminescente do grupo controle foi aumentado para 5,5 x 10 6 ± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr. Como mostra a Figura 5, isso corresponde a uma taxa de crescimento de 83,4% ± 78% e 172% ± 34%, respectivamente, assumindo crescimento exponencial (p = 0,08). Dos quatro animais tratados, três apresentaram menores taxas de crescimento pós-tratamento em relação aos controles. Houve um outlier no grupo de tratamento que mostrou crescimento comparável ao controle, distorcendo os desvios.
Além disso, os animais foram submetidos a exames de RM com contraste no dia seguinte ao tratamento para comparação pré e pós-tratamento do tumor. A intensidade média do contraste em tons de cinza nos tumores foi realizada em cada corte de RM para cada animal para medir a quantidade de contraste que estava entrando nos tumores após o tratamento, como uma estimativa do tamanho do tumor. Antes do tratamento, a intensidade média da escala de cinza tumoral entre os grupos controle e tratado foi semelhante. Em média, essa intensidade da escala de cinza aumentou no grupo controle para uma magnitude maior do que nos grupos tratados, embora isso não tenha sido significativo (p = 0,47). Esses dados podem ser observados na Tabela 2. A alta variabilidade desses resultados deve-se, potencialmente, ao fato de que as RMs foram realizadas apenas 24 h após o tratamento, momento em que o potencial terapêutico da TPS está apenas começando a ocorrer. Mesmo assim, a Figura 6 mostra um exemplo das lesões criadas pela TVF.
Figura 1: Configuração do sistema FUS. (Topo) Sistema MRgFUS com componentes rotulados. (Frente) 1. Plataforma. 2. Eixo motorizado braço do transdutor. 3. Transdutor de USF. 4. Banho-maria. 5. Leito de ressonância magnética. 6. Monitorar. 7. Caixa de correspondência de impedância do transdutor. 8. Caixa do amplificador de potência. 9. Gerador de funções. 10. Função gerador canal 1 porta BNC. 11. Computador de mesa. (Parte inferior) Sistema MRgFUS com fiação codificada por cores esquemática com as seguintes conexões. (Voltar) 1. Cabos de alimentação. 2. Monitore HDMI para desktop HDMI. 3. Porta B USB B para desktop USB A. 4. Osciloscópio LAN ethernet para desktop ethernet. 5. Interface de movimento ethernet para desktop ethernet. 6. Osciloscópio aux in/out BNC para AWG entrada BNC. 7. Osciloscópio canal 1 (frontal) BNC para SYNC BNC. 8. Correspondência de saída da caixa BNC para RF entrada coaxial. 9. Saída de RF coaxial para caixa de correspondência coaxial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Registro fantasma. (A) Configuração do sistema e software durante o registro do fantasma. (B) Captura de tela da tela de registro do fantasma, onde o círculo vermelho é a circunferência selecionada da seção transversal axial. (C) Simulador colocado no leito de RM, vista superior. (D) Vista lateral do simulador, onde a linha vermelha está no corte axial correspondente ao círculo em C. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Colocação dos animais. (A) Leito e berço da RM, com várias partes marcadas: 1. Berço da RM. 2. Leito de RM estereotáxica. 3. Barras auriculares. 4. Barra de mordida. 5. Cone nasal. 6. Orifício da cama da RNM. 7. Tubos de anestesia com isoflurano. (B) Ilustração representando a colocação do mouse no leito de ressonância magnética e colocação no berço, com a bobina de RF (laranja) (ilustração modificada usando o modelo Biorender 2022). (C) Ilustração representando a colocação do mouse no leito de RM durante um tratamento com FUS (ilustração modificada usando o modelo Biorender 2022). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Seleção do ponto focal. Exemplo de uma seleção de ponto de sonicação em um único animal. Cada coluna representa um corte de RM pós-contraste ponderado em T1, onde cada corte é de 0,5 mm na direção proximal (corte 1) a distal (corte 5). O limite do tumor foi segmentado manualmente e é delineado em vermelho (fileira 1), e os locais de sonicação correspondentes (fileira 2) são representados por um quadrado verde claro (centro máximo focal) e círculo azul (circunferência focal meia máxima). Cada local foi sonicated por 2 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Taxa de crescimento após a TPD. A taxa de crescimento de tumores GBM de pré a 24 h após o tratamento com TSD em animais tratados e não tratados (controle) com tumores M59 intracranianos com base na luminescência medida. As barras de erro indicam o desvio padrão. Um teste t de estudante para duas amostras foi realizado para determinar a significância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Lesão gerada pela TVS. RM ponderada em T1 pré e pós-contraste em modelo animal com corte axial representativo mostrando lesão tumoral criada pela TVS. (Esquerda) Ressonância magnética realizada antes do tratamento com TPS, com o tumor delineado em vermelho. (Meio) Seleção do ponto focal FUS onde a pressão máxima é representada por círculos azuis claros e as regiões de pressão meia-máxima são representadas por círculos azuis. (Direita) Exames de RM pós-TFD, onde o tumor é delineado em vermelho. São mostradas as lesões criadas pela SDT e o orifício da seringa para implantação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Seqüenciar | T1 |
| Tempo de repetição | 3000 ms |
| Tempo de eco | 30 milímetros |
| Espessura de corte | 0,5 milímetros |
| Número de fatias | 25 |
| Espaçamento entre pixels | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Matriz de aquisição | De 133 a 133 anos |
| Médias | 4 |
Tabela 1: Ajustes na RM.
| Controle | Grupo SDT | Valor de p | |
| Pré-Tratamento | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Pós-Tratamento | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Diferença percentual | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabela 2: Escala de cinza ponderada em T1 pós-contraste na RM.
Discussion
Novas opções terapêuticas e eficazes de tratamento são necessárias para pacientes com GBM. Este protocolo delineou um tratamento pré-clínico mediado por FUS para GBM que está atualmente passando por extensa investigação para tradução clínica. Embora a TSD tenha um potencial empolgante, ainda há muito a ser compreendido e otimizado no cenário pré-clínico.
Um dos componentes mais importantes desse protocolo é a utilização da USF guiada por RM para atingir o tumor para máxima eficácia. Usando um fantasma, um espaço de coordenadas 3D pode ser criado, onde cada pixel de cortes axiais de ressonância magnética pode ser atribuído a uma coordenada. Em seguida, um procedimento simples de selecionar o local de sonicação na imagem de RM informa ao transdutor para onde mirar. O sistema de USF pré-clínico usado é altamente versátil e aplicável quando se precisa direcionar locais de patologia específica, como um tumor, incluindo tumores de localização mais profunda, que seriam difíceis de atingir sem confirmação por imagem. Usando o gadolínio como agente de contraste, há uma clara visualização do tumor, permitindo que o usuário tome decisões informadas na escolha dos alvos. A vantagem que a TSD tem sobre muitos outros tratamentos é que é uma terapia tumor-específica. O USF de baixa intensidade deve atingir apenas o tecido tumoral, deixando o parênquima cerebral normal relativamente intocado 3,8.
Os resultados deste experimento destacam como as vantagens desse protocolo podem levar a resultados terapêuticos semelhantes a outros achados da literatura para a TPD. A Figura 5 mostra que, em menos de 24 h após o dia do tratamento, houve uma desaceleração do crescimento tumoral na coorte tratada. Embora insignificante usando este pequeno tamanho amostral, a significância pode resultar em um número maior de animais. Esse atraso no crescimento tumoral é semelhante ao que foi demonstrado no artigo pioneiro sobre o assunto de Wu et al (2019), que exibiu crescimento tumoral desacelerado ao longo do tempo em animais tratados, bem como aumento do tempo de sobrevida9.
As considerações que foram feitas ao elaborar este protocolo incluíram cepa animal, tipo de tumor e seleção de agentes sonossensibilizantes. Camundongos atímicos nus foram escolhidos para este protocolo por múltiplas razões. Primeiro, o rato nude é mais fácil de sonicar, pois a falta de cabelo impede qualquer atenuação. Além disso, a falta de um sistema imunológico permite a implantação de xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) para que o modelo tumoral se assemelhe mais à situação clínica. A desvantagem do uso de um modelo atímico é que o sistema imunológico não pode ser caracterizado, de modo que qualquer resposta imune gerada pela SDT não será medida nesses estudos10. A linhagem tumoral escolhida é uma linhagem PDX agressiva e de crescimento rápido. O tempo de tratamento é muito importante, pois o estabelecimento do tumor deve ser verificado, mas a carga tumoral não deve preencher o hemisfério craniano. Diferentes linhagens celulares requerem diferentes tempos de incubação para alcançar um tumor de tamanho ideal para experimentação pré-clínica. Neste protocolo, o 5-ALA foi utilizado como sonosensibilizador devido à sua captação preferencial em tumores de GBM, o que foi confirmado in vitro para esta linhagem celular em experimentos anteriores (dados não publicados). Outros sonosensibilizadores podem ser substituídos e testados para determinar o composto mais adequado para eficácia e segurança. Finalmente, o tratamento foi iniciado 3 h após a injeção de 5-ALA, pois a literatura prévia mostrou que este é o momento ideal com essa dose de injeção5.
Os parâmetros do USF escolhidos nesse protocolo (10 W/cm2 por 2 min a 515 kHz em cada local alvo) foram decididos com base em revisão da literatura prévia e experimentosiniciais4,9. Uma grade de pontos de sonicação cobrindo todo o tumor foi escolhida para gerar o efeito ROS em todo o tumor. A intensidade utilizada aqui é maior do que outras publicações, mas, em um curto espaço de tempo, não se espera que isso leve a efeitos adversos relacionados à temperatura, uma vez que intensidades de até 25 W/cm2 têm sido usadas com sucesso em um modelo de camundongo sem efeitos colaterais significativos11. É importante ressaltar que nenhum conjunto padronizado ou otimizado de parâmetros do USF foi publicado na literatura. Portanto, os valores específicos que são relatados aqui podem ser ajustados para determinar o conjunto ótimo de parâmetros, levando à redução máxima do tecido tumoral, mantendo a segurança. Além disso, como diferentes linhagens celulares têm diferentes níveis de vascularização e hipóxia, esse tratamento pode precisar ser ajustado. Demonstramos uma diminuição geral do crescimento tumoral (Figura 5) dentro de 24 h após o tratamento com TSF, embora os parâmetros precisem ser otimizados e mais animais precisem ser testados para determinar o efeito máximo desse tratamento. A RM pós-tratamento não mostra aparecimento de lesões criadas pelo tratamento com USF em tecido normal, com efeito localizado no tecido tumoral (Figura 6). Há também a oportunidade de combinar a TFS com outras técnicas de USF, como a permeabilização transitória da barreira hematoencefálica, para maximizar a captação de 5-ALA notumor12. Este protocolo pode ser complementado com a realização de várias técnicas histológicas para verificar a segurança e eficácia a nível estrutural. Uma coloração de hematoxilina e eosina (H&E) pode ser realizada para verificar danos estruturais ou tumorais13, enquanto uma coloração terminal de desoxinucleotidiltransferase dUTP nick end (TUNEL) pode ser realizada para verificar apoptose celular14. Independentemente disso, este protocolo apresenta um tratamento seguro e específico para o tumor, onde as alterações são perceptíveis mesmo 24 h após o tratamento, o que é aparente comparando-se a taxa de crescimento de tumores tratados com SDT e tumores não tratados, bem como comparando-se cortes tumorais antes e após a sonicação.
Com qualquer protocolo, sempre há desvantagens ou limitações que precisam ser ponderadas. A principal limitação do protocolo atual é o tempo e o custo. Enquanto isso, uma das vantagens desse protocolo é sua mira focada automatizada. Para realizar esse procedimento focado, exames de ressonância magnética precisam ser feitos para cada animal individualmente para garantir que o alvo do tumor esteja correto, um processo que pode ser demorado e caro. Além disso, dependendo do número de pontos focais desejados, o tempo para a realização deste protocolo pode ser de horas para apenas alguns animais, resultando em baixo número de animais experimentais. Apesar dessas desvantagens, este protocolo não invasivo direcionado continua sendo uma preferência viável quando comparado às opções de cirurgia aberta.
Em conclusão, este protocolo mostrou a capacidade do tratamento com SDT de diminuir o crescimento tumoral no cérebro dentro de 24 h de tratamento, mantendo o tecido neural saudável em um modelo pré-clínico de camundongo. Estudos sobre a efetividade da TPF e otimização dos diversos parâmetros para aumentar a produção de ERO são necessários para tornar esse tratamento clinicamente adequado. Novos caminhos devem ser explorados para o uso da TSF como modelo terapêutico não invasivo.
Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses. Amir Manbachi leciona e presta consultoria para a BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical e é inventor de várias tecnologias FUS com patente pendente. Betty Tyler tem financiamento de pesquisa do NIH e é coproprietária da Accelerating Combination Therapies*. também licenciou uma de suas patentes, e ela é acionista da Peabody Pharmaceuticals (*inclui ações ou opções).
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio financeiro do National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), do ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) e do Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR's) Clinical Research Scholars Program (KL2), administrado pelo National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). As células foram compradas e fornecidas pela Mayo Foundation for Medical Education and Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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