Summary
本方案概述了一种用于建立用于诱导小鼠睡眠剥夺的基于摇杆平台的具有成本效益的摇杆平台的装置的方法。该设备已被证明可有效导致脑电图 （EEG） 证明的睡眠模式中断，以及诱导与睡眠剥夺相关的代谢和分子变化。
Abstract
昼夜节律紊乱是指外部环境或行为与内源性分子钟不同步，严重损害健康。睡眠不足是昼夜节律紊乱的最常见原因之一。据报道，各种方式（例如，水上平台、轻柔处理、滑动杆室、旋转鼓、轨道振动器等）可诱导小鼠睡眠剥夺，以研究其对健康的影响。目前的研究引入了一种小鼠睡眠剥夺的替代方法。设计了一种基于自动摇杆平台的设备，该设备具有成本效益，并且可以在可调节的时间间隔内有效地扰乱群居小鼠的睡眠。该装置以最小的应激反应诱导睡眠剥夺的特征性变化。因此，这种方法可能对有兴趣研究睡眠剥夺对多种疾病发病机制的影响和潜在机制的研究人员有用。此外，它还提供了一种经济高效的解决方案，特别是当需要多个睡眠剥夺设备并行运行时。
Introduction
昼夜节律紊乱是指外部环境或行为与内源性生物钟之间的不同步。昼夜节律紊乱的最常见原因之一是睡眠剥夺1.睡眠不足不仅会对人类健康产生负面影响，还会显着增加患多种疾病的风险，包括癌症2 和心血管疾病3。然而，睡眠剥夺的有害影响背后的机制在很大程度上仍然未知，建立睡眠剥夺模型对于加强我们在这方面的理解至关重要。
已经报道了各种剥夺小鼠睡眠的方法，例如使用水平台4，轻柔处理5，滑动杆室6，旋转鼓7和笼式搅拌协议5,8,9。滑动杆室自动扫过笼子底部的杆，迫使老鼠走过它们并保持清醒。笼子搅拌方案包括将笼子放在实验室轨道振动器上，从而有效地中断睡眠。虽然这些方法是自动且有效的，但当需要多个设备并行运行时，它们可能会很昂贵，特别是对于涉及昼夜节律基因分析所需的大量睡眠不足小鼠的特定研究设计。另一方面，水平台和温和的处理方案是通常用于诱导睡眠剥夺的更便宜、更简单的方法。然而，水平台不允许自动控制预先指定的剥夺-休息周期10,11，并且轻柔的处理需要研究人员持续保持警惕以扰乱睡眠。此外，其他方式，如旋转鼓，可能会因社会孤立或压力而混淆 12.
受基于轨道振荡器的方法的启发，我们旨在引入一种协议，用于建立基于摇臂平台的小鼠睡眠剥夺装置。这种方法便宜、有效、压力最小、可控且自动化。根据我们的可访问性，当前的协议允许我们以比轨道振动器便宜约十倍的成本创建基于摇杆平台的设备。该装置有效地扰乱了群居小鼠的睡眠，并以最小的应激反应诱导了睡眠剥夺的特征性变化。对于有兴趣研究睡眠剥夺对多种疾病发病机制的影响和潜在机制的研究人员来说，这将特别有用，特别是当该研究同时涉及多组睡眠剥夺时。
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Protocol
本研究所有动物实验方案均获得上海交通大学医学院仁济医院实验动物福利伦理委员会批准。该研究使用了年龄在8至10周之间的雄性C57BL / 6J小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。 图1A列出了建立设备所需的主要部件。
1.睡眠剥夺装置的制备
- 用螺钉将 50 cm 开槽钢槽的一端固定在 40 cm 开槽钢槽的中间（见材料表），制成 T 形结构;重复该过程并制作两个这样的T形结构（图1B-a）。
- 使两个 T 形结构平行向上站立 30 厘米，并使用螺钉将两个 T 形结构的底部与 30 厘米的螺钉兼容钢圆柱体（见材料表）连接（图 1B-b）。
- 在两个 T 形结构之间放置一个钢制矩形平台（20 × 25 厘米）（见材料表）（图 1B-c）。
注意： 如果没有指定尺寸的即用型钢矩形平台，可以通过焊接 2 毫米厚的扁钢来制作一个。 - 将连接到平台中的 30 厘米螺钉兼容钢圆柱体的两端固定在距离顶部 10 厘米处的每个 T 形结构上的两个轴承上（图 1B-d）。
- 使用螺钉将电机安装座（参见材料表）固定在距顶部 25 厘米处的 T 形结构之一上（图 1B-e）。
注意： 或者，可以使用建筑粘合剂将电机安装座固定在 T 形结构上，而不是机组人员上。 - 用螺钉在电机支架上安装电机（参见材料表）（图 1B-f）。
- 在电机下方的 T 形结构上用自锁带固定冷却风扇（参见材料表）（图 1B-g）。
- 使用螺钉将连杆的轴承端固定到面向电机的平台角上（图 1B-h）。
- 使用螺钉将连杆的另一端固定到电机的轴上（图 1B-i）。
- 使用电钻在塑料容器或标准动物笼子的四个角上钻两个 4 毫米的孔（见材料表），并在笼子左侧钻两个 4 毫米的孔和一个较低的 6 毫米孔（图 1B-j）。
- 用自锁带通过角孔将笼子固定在矩形平台上（图 1B-k）。
- 用电钻在 50 mL 离心管的盖子上钻一个 5 mm 的孔，然后用装有球阀的长喷嘴插入孔，以防止漏水。
注意：如果定制水瓶很困难，水凝胶将是供水的替代选择。 - 使用自锁带将定制的水瓶固定在笼子的左侧，穿过两个 4 毫米的孔，喷嘴穿过 6 毫米的孔（图 1B-l）。
- 将电源砖适配器的输出电线连接到电机的两个端子（图 1B-l）。
注意： 将电线连接到电机端子没有特定的极性要求。 - 将电源模块适配器的输入电线连接到时间接触器（图 1B-m）。
2.诱导睡眠剥夺
- 分别按下时间接触器左半部分和右半部分的最右边加号按钮（参见材料表），直到两侧的机械计数器上出现“M”（图 1C-a）。
- 按下时间接触器左右两半的中间加号按钮，直到两侧的机械计数器上出现“5M”（图 1C-b）。
- 按下时间接触器左半部分最左边的加号按钮，直到左侧机械计数器上出现“15M”（图 1C-c）。
注意： 然后，时间接触器将在循环模式下打开 15 分钟并关闭 5 分钟。 - 随意将小鼠放入笼子中，并随意喝水和食物。
- 为时间接触器和冷却风扇供电。
注意： 平台现在将以 10 rpm 的速度摇摆。 - 每天在Zeitgeber时间0（ZT0）称量每只小鼠。
注意： 灯从上午 8 点 （ZT0） 到晚上 8 点 （ZT12） 亮着。
3.口服葡萄糖耐量试验
- 通过从尾静脉取样血液来测量空腹小鼠的空腹血糖水平。
- 使用1mL注射器腹膜内注射葡萄糖溶液到每只小鼠（2g / kg体重）中。
- 通过尾静脉采集血样，分别在葡萄糖注射后15分钟、30分钟、60分钟和120分钟检测血糖。
- 测试后，将小鼠放回笼子里，随意喂食和喝水。
4. 收获脑组织
- 在充分麻醉后将小鼠暴露于异氟烷（2%）3-5分钟，将其斩首。
- 露出头骨，用手术剪刀在头骨上垂直切开 1 厘米。
- 使用蚊子止血器（见 材料表）去除颅骨以暴露脑组织。
- 使用弯曲的镊子轻轻地将整个大脑移出颅腔。
注意：应根据当地政策切除脑组织。 - 使用冷磷酸盐缓冲盐水（1x PBS，4°C）洗涤脑组织。
- 将完整的脑组织在液氮中快速冷冻，并将组织转移到-80°C进行长期储存。
注意：当储存在 -80°C 下时，速冻脑组织可稳定至少 6 个月。
5. 聚合酶链反应（PCR）检测基因表达
- 在4°C或冰上解冻脑组织。
- 将组织转移到 1.5 mL 微量离心管中，并使用基于 TRIzol 的方法提取总 RNA13。
- RNA提取后，使用分光光度计测量RNA的浓度（参见 材料表）。
- 使用商业试剂盒14 将总 RNA （1 μg） 逆转录为互补 DNA （cDNA）。
- 通过实时逆转录聚合酶链反应测量基因表达水平15.
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Representative Results
图1D显示了用于小鼠睡眠剥夺的既定装置。在睡眠剥夺开始后的第 7 天，脑电图 （EEG） 和肌电图 （EMG） 监测16 表明该装置显着缩短了小鼠的睡眠持续时间并增加了清醒持续时间（图 2A-D）。同时，目前的方案显着增加了大脑中 Homer1a 的腺苷积聚和 mRNA 水平（图 2E，F），这是成功睡眠剥夺的标志 17。使用 ELISA 试剂盒18，我们观察到血清皮质酮水平没有因当前的睡眠剥夺方案而显着改变（图 2G）。睡眠剥夺 7 天后，身体和胸腺重量显着下降（图 3A-D），与之前的报告一致19。此外，睡眠剥夺后小鼠的葡萄糖耐量显着受损（图3E，F）。为了研究时钟基因表达的变化，在一天中每 4 小时收集一次脑组织。我们观察到，在睡眠剥夺后，大脑中时钟基因的表达模式发生了显着变化（图3G和表1），表明分子钟20的破坏。
图1：基于摇臂平台的装置的建立。 （A） 描述组装基于摇臂平台的装置所需的主要部件的插图。（B） 演示睡眠剥夺装置组装的详细步骤。（C） 在时间接触器中显示参数设置的图像。（D） 完全组装的振荡室的照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：小鼠睡眠障碍和血清皮质酮水平的评估。 （A）示出睡眠剥夺期间小鼠脑电图/肌电图记录的示意图。（B） 在小鼠中追踪的代表性脑电图/肌电图记录。（C） 小鼠在清醒、NREM 和 REM 期间的代表性 EEG/EMG 波形。 （D） 在睡眠中断小鼠和对照小鼠（n = 4 只小鼠/组）中记录的觉醒持续时间、NREM 持续时间和 REM 持续时间的百分比。*P < 0.05，***P < 0.001。使用非配对 t 检验进行统计分析。缩写：CTR，对照组;NREM，非快速眼球运动;REM， 快速眼动;SD，睡眠剥夺组。（E） 在睡眠中断小鼠和对照小鼠（n=4 只小鼠/组）中测量的脑组织中 Homer1a 的 mRNA 水平。*P < 0.05，使用非配对 t 检验进行统计分析。缩写：CTR，对照组;Homer1a， 荷马支架蛋白1a;SD，睡眠剥夺组。（F） 使用 ELISA 试剂盒在睡眠中断小鼠和对照小鼠（n = 4 只小鼠/组）中测量脑组织中的腺苷含量。*P < 0.05，在每个时间点使用非配对 t 检验 进行统计分析。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。（G）在睡眠中断的小鼠和对照小鼠中测量的血清皮质酮浓度（n = 每个时间点/组4只小鼠）。使用双因素方差分析进行统计分析。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：小鼠睡眠剥夺后的病理生理变化。 （A）显示指示组中小鼠大小的代表性图像。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。（B）指定组（n = 每组24只小鼠）开始睡眠剥夺后体重的变化。**P < 0.001，使用非配对 t 检验进行统计分析。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。（C） 显示所示组中胸腺大小的代表性图像。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。 （D）两组之间胸腺重量与体重的比率比较（n = 每组24只小鼠）。**P < 0.001，使用非配对 t 检验进行统计分析。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。 （E） 指定组的腹膜内葡萄糖耐量试验结果（每组 n = 5）。*P < 0.01;**P < 0.001，使用非配对 t 检验进行统计分析。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。（F） 睡眠剥夺组和对照组腹膜内葡萄糖耐量试验曲线下面积 （AUC） 的比较（每组 n = 5）。**P < 0.001，使用非配对 t 检验进行统计分析。缩写：CTR，对照组;SD，睡眠剥夺组。（G） 在睡眠剥夺组和对照组（n = 4 只小鼠/组）中测量脑组织中时钟基因（Bmal1、 Dbp、 Cry1、 Cry2、 Nr1d1、 Nr1d2、 Per1 和 Per2）的昼夜节律表达模式。使用非线性余弦回归比较数据，并使用 R 包 CircaCompare 拟合时钟基因的表达曲线。 P 值如图所示提供。缩写：A，振幅; Bmal1，脑和肌肉Arnt样1; Cry1，隐花色素昼夜节律调节因子1; Cry2，隐花色素昼夜节律调节因子2; CTR， 对照组; Dbp， D位点结合蛋白;M， 中层; Nr1d1，核受体亚家族1，D组成员1; Nr1d2，核受体亚家族1，D组成员2;P， 相位; Per1，周期昼夜节律调节器1; Per2，周期昼夜节律调节器2;SD，睡眠剥夺组。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 时钟基因 | 布马尔 | DBP的 | 哭泣1 | 哭泣2 | NR1D1型 | Nr1d2型 | 每 1 | 每 2 个 | |
| 韵律性 | 控制 | P < 0.05 | P < 0.01 | P < 0.001 | P < 0.05 | P < 0.001 | P < 0.01 | P < 0.001 | P < 0.001 |
| 睡眠不足 | P < 0.05 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | |
| Acrophase（Zeitgeber时间） | 控制 | 22 | 12 | 17 | 15 | 11 | 14 | 14 | 16 |
| 睡眠不足 | 10 | 24 | 4 | 3 | 22 | 0 | 1 | 1 | |
| Mesor 估计 | 控制 | 0.933 | 2.242 | 1.136 | 1.171 | 1.799 | 1.41 | 1.289 | 1.033 |
| 睡眠不足 | 0.826 | 2.101 | 1.094 | 1.155 | 1.756 | 1.399 | 0.999 | 0.888 | |
| 振幅估计 | 控制 | 0.099 | 0.746 | 0.305 | 0.131 | 0.494 | 0.314 | 0.294 | 0.341 |
| 睡眠不足 | 0.108 | 0.866 | 0.342 | 0.168 | 0.503 | 0.323 | 0.388 | 0.305 | |
表 1：每组中测试时钟基因的节律性、中值估计、振幅估计和顶相的存在。
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Discussion
睡眠剥夺的小鼠模型对于研究睡眠中断对各种疾病的影响至关重要，包括心血管疾病21、精神疾病22 和神经系统疾病23。在小鼠现有的睡眠剥夺策略中，涉及重复短期睡眠中断的物理方法是最常用的5,7,12。这些物理方法包括使用水平台4、轻柔处理5、滑动杆室6、24、旋转鼓7或轨道振动器8、9、25、26。
为了有效地诱导小鼠睡眠剥夺，理想的方法应该用非应激刺激唤醒小鼠。所选择的设备也应该是自动化的，并且易于控制，以调整剥夺-休息周期。在上述方法中，滑杆腔室满足了大多数这些要求。然而，它很昂贵，偶尔可能会伤害老鼠。另一种有效且压力最小的方法是基于轨道振荡器的协议7,8,9,25，其中将笼子放置在与时间控制器相连的标准实验室轨道振荡器上，导致重复性睡眠中断。然而，当特定的研究设计需要多个轨道振动器并行运行时，对于某些研究小组来说，成本可能会变得高得令人望而却步。
受轨道振动器方法的启发，本研究提出了一个详细的分步方案，用于建立基于摇臂平台的睡眠剥夺设备。它的成本大约是实验室轨道振动器的十分之一，使其更容易获得。所引入的设备被验证为对小鼠睡眠剥夺有效，如EEG/EMG监测数据所示，该数据显示睡眠持续时间显着缩短，睡眠剥夺标志物增加。此外，这种基于摇臂平台的装置没有显着改变小鼠的血清皮质酮水平。总体而言，我们推出了一种新的自动睡眠剥夺设备，它价格低廉、有效、压力最小且可控。
尽管有其优点，但当前的协议有一些局限性。首先，与即用型市售设备不同，这里介绍的睡眠剥夺设备需要实验人员组装。但是，已经提供了详细的分步协议和插图以简化该过程。其次，并非设备建立所需的所有材料都是市售的，可能需要根据本工作提供的规格对材料进行一些定制。第三，与摇臂平台一起使用的传统水瓶可能会漏水，因此需要使用定制的水瓶来防止此问题。
总之，本研究提出了一种具有成本效益和高效的方法，用于建立一种替代装置来诱导群居小鼠的睡眠剥夺。该协议可以帮助研究人员调查睡眠剥夺对各种健康状况的影响和潜在机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（82230014,81930007,82270342）、上海市杰出学术带头人计划（18XD1402400）、上海市科学技术委员会（22QA1405400,201409005200,20YF1426100）、上海浦江人才计划（2020PJD030）、上海老龄医学临床研究中心（19MC1910500）和蚌埠医学院研究生创新计划资助（Byycxz21075）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602002 | |
| Adenosine ELISA kit | Ruifan technology | RF8885 | |
| Animal cage | ZeYa tech | MJ2 | |
| Blood glucose meter | YuYue | 580 | |
| C57BL/6J Mice | JieSiJie Laboratory Animal | N/A | Age: 8-10 weeks |
| Connecting rod | ShengXiang Tech | N/A | Length: 20 cm |
| Cooling fan | LiMing | EFB0805VH | Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm |
| Corticosterone ELISA kit | Elabscience | E-OSEL-M0001 | |
| EEG/EMG recording and analysis system | Pinnacle Technology | 8200-K1-iSE3 | |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | |
| mosquito hemostats | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Motor and motor mount | MingYang | MY36GP-555 | Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Power brick adapter | MingYang | QiYe-0243 | Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m |
| qPCR commercial kit | Vazyme | Q711-02 | |
| qPCR measurement equipment | Roche | 480 | |
| Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm |
| Reverse RNA to cDNA commercial kit | Vazyme | R323-01 | |
| Screw and nut | Guwanji | N/A | Inner diameter: 6 mm, 12 mm |
| Screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Length: 300 mm |
| Slotted steel channels | Customized | N/A | Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm |
| Time contactor | LiXiang | DH48S-S | Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT |
| TRIzol | Vazyme | R401-01 |
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