Summary
本プロトコルは、マウスに睡眠剥奪を誘発するために使用される費用対効果の高いロッカープラットフォームベースのデバイスをセットアップするための方法を概説する。このデバイスは、脳波(EEG)で証明された睡眠パターンの乱れを引き起こし、睡眠不足に関連する代謝および分子の変化を誘発するのに効果的であることが証明されています。
Abstract
概日リズムの乱れとは、外部環境や行動と内因性分子時計との同期が崩れることを指し、健康を著しく損ないます。睡眠不足は、概日リズムの乱れの最も一般的な原因の1つです。マウスの睡眠不足を誘発する様々なモダリティ(例えば、水上のプラットフォーム、穏やかなハンドリング、スライディングバーチャンバー、回転ドラム、軌道シェーカーなど)が報告されており、健康への影響を調査しています。今回の研究では、マウスの睡眠不足の代替方法を紹介しています。自動化されたロッカープラットフォームベースのデバイスは、費用対効果が高く、調整可能な時間間隔でグループ飼育マウスの睡眠を効率的に妨害するように設計されています。このデバイスは、最小限のストレス反応で睡眠不足の特徴的な変化を誘発します。したがって、この方法は、複数の疾患の病因に対する睡眠不足の影響と根本的なメカニズムの研究に関心のある研究者に役立つ可能性があります。さらに、特に複数の睡眠不足デバイスを並行して実行する必要がある場合に、費用対効果の高いソリューションを提供します。
Introduction
概日リズムの乱れとは、外部環境や行動と内因性の体内時計との同期が崩れることを指します。概日リズムの乱れの最も一般的な原因の1つは、睡眠不足です1。睡眠不足は人間の健康に悪影響を及ぼすだけでなく、がん2 や心血管疾患3など、多くの病気のリスクを著しく高めます。しかし、睡眠不足の有害な影響の根底にあるメカニズムはほとんど不明であり、この点に関する理解を深めるためには、睡眠不足モデルの確立が不可欠です。
マウスの睡眠不足には、水プラットフォーム4、穏やかな取り扱い5、スライドバーチャンバー6、回転ドラム7、ケージ攪拌プロトコル5,8,9の使用など、さまざまな方法が報告されている。スライド式バーチャンバーは、ケージの底にバーを自動的に掃き出し、マウスにその上を歩かせて目を覚まさせます。ケージ攪拌プロトコルでは、ケージを実験室の軌道シェーカーに置き、効率的な睡眠障害を引き起こします。これらの方法は自動的かつ効果的ですが、複数のデバイスを並行して実行する必要がある場合、特に概日遺伝子プロファイリングに必要な睡眠不足のマウスを多数含む特定の研究デザインでは、コストが高くなる可能性があります。一方、水プラットフォームと穏やかな取り扱いプロトコルは、睡眠不足を誘発するために一般的に使用される安価で簡単な方法です。しかし、水プラットフォームでは、事前に指定された剥奪-休息サイクル10,11の自動制御はできず、穏やかな取り扱いには、睡眠を妨げるために研究者からの継続的な警戒が必要です。さらに、回転ドラムのような他のモダリティは、社会的孤立やストレスによって混乱する可能性があります12。
軌道振とう機を用いた方法に着想を得て、マウスの睡眠不足のためのロッカープラットフォームベースのデバイスを確立するためのプロトコルの導入を目指しています。この方法は、安価で効果的で、ストレスが最小限に抑えられ、制御可能で、自動化されています。現在のプロトコルでは、アクセスのしやすさに基づいて、軌道シェーカーの約10倍のコストでロッカープラットフォームベースのデバイスを作成できます。このデバイスは、グループ飼育マウスの睡眠を効果的に妨害し、最小限のストレス反応で睡眠不足の特徴的な変化を誘発しました。これは、複数の疾患の病因に対する睡眠不足の影響と根本的なメカニズムの調査に関心のある研究者にとって特に有用であり、特に研究が複数のグループの睡眠不足を並行して含む場合に役立ちます。
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Protocol
この研究のすべての動物実験プロトコルは、上海交通大学医学部仁済病院の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。この研究には、8〜10週齢の雄のC57BL/6Jマウスを使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。デバイスの確立に必要な主要部品を 図1Aに示します。
1.睡眠遮断装置の準備
- 50cmのスロット付きスチールチャネルの一方の端を40cmのスロット付きスチールチャネルの中央にネジで固定し(材料表を参照)、T字型の構造を作成します。このプロセスを繰り返して、このようなT字型の構造を2つ作成します(図1B-a)。
- 2つのT字型構造物を30cm離して平行に上向きに立たせ、2つのT字型構造物の底部を30cmのネジ対応鋼製シリンダー(材料表を参照)でネジで接続します(図1B-b)。
- 2つのT字型構造物の間に、鋼製の長方形のプラットフォーム(20×25 cm)(材料表を参照)を配置します(図1B-c)。
注:指定されたサイズのすぐに使用できる鋼製の長方形のプラットフォームが利用できない場合は、厚さ2mmの平鋼を溶接して作ることができます。 - プラットフォームに取り付けられた30cmのネジ互換スチールシリンダーの両端を、上から10cm下のT字型構造のそれぞれに固定された2つのベアリングに固定します(図1B-d)。
- ネジを使用して、T字型の構造物の1つに、上から25 cm下にモーターマウント(材料表を参照)を固定します(図1B-e)。
注意: または、建設用接着剤を使用して、乗組員の代わりにT字型の構造にモーターマウントを固定することもできます。 - モーター(材料表を参照)をモーターマウントにネジで取り付けます(図1B-f)。
- モーターの下のT字型の構造にセルフロックバンド付きの冷却ファン(材料表を参照)を固定します(図1B-g)。
- ネジを使用して、コネクティングロッドのベアリング端をモーターに面したプラットフォームの角に固定します(図1B-h)。
- コネクティングロッドのもう一方の端をネジを使用してモーターのシャフトに固定します(図1B-i)。
- 電気ドリルを使用して、プラスチック容器または標準的な動物ケージ(材料表を参照)の四隅にそれぞれ4mmの穴を2つ開け、ケージの左側に2つの4mmの穴と下部の6mmの穴を開けます(図1B-j)。
- コーナーホールにセルフロックバンドでケージを長方形のプラットフォームに固定します(図1B-k)。
- 50mL遠心チューブのキャップに電動ドリルで5mmの穴を開け、ボールバルブ付きの長いノズルで穴を塞いで水漏れを防ぎます。
注:ハイドロゲルは、ウォーターボトルのカスタマイズが困難な場合の給水の代替オプションになります。 - カスタマイズされたウォーターボトルをケージの左側に固定し、2つの4mmの穴にセルフロックバンドを通し、ノズルを6mmの穴に通します(図1B-l)。
- 電源ブリックアダプターの出力電線をモーターの2つの端子に接続します(図1B-l)。
注意: ワイヤをモーター端子に接続するための特定の極性要件はありません。 - 電源ブリックアダプタの入力電線をタイムコンタクタに接続します(図1B-m)。
2.睡眠不足の誘発
- タイムコンタクタの左半分と右半分にある右端のプラス記号ボタン(材料表を参照)を、両側の機械式カウンターに「M」が表示されるまでそれぞれ押します(図1C-a)。
- タイムコンタクタの左半分と右半分にある中央のプラス記号ボタンを、両側の機械式カウンターに「5M」が表示されるまで押します(図1C-b)。
- 左の機械式カウンタに「15M」と表示されるまで、タイムコンタクタの左端にあるプラス記号ボタンを押します(図1C-c)。
注意: その後、タイムコンタクタはサイクリックモードで15分間オンになり、5分間オフになります。 - マウスを水と餌と一緒にケージに入れます。
- タイムコンタクタと冷却ファンに電力を供給します。
注:プラットフォームは10rpmで揺れます。 - 毎日ツァイトゲーバー時間0(ZT0)で各マウスの重量を量ります。
注意: ライトは午前8時(ZT0)から午後8時(ZT12)まで点灯します。
3.経口ブドウ糖負荷試験
- 尾静脈から血液をサンプリングすることにより、絶食マウスの空腹時血糖値を測定します。
- 1 mLシリンジを使用して、各マウス(2 g / kg体重)にグルコース溶液を腹腔内に注入します。
- 尾静脈から血液サンプルを採取し、ブドウ糖注入後15分、30分、60分、120分でそれぞれ血糖値を測定します。
- テスト後、マウスを餌と水と一緒にケージに戻します。
4. 脳組織の採取
- 十分な麻酔後、マウスをイソフルラン(2%)に3〜5分間曝露して首を切除します。
- 頭蓋骨を露出させ、手術用ハサミを使用して頭蓋骨に1cmの垂直切り込みを入れます。
- 蚊の止血剤( 材料表を参照)を使用して頭蓋骨を除去し、脳組織を露出させます。
- 湾曲したピンセットを使用して、脳全体を頭蓋腔からそっと移動させます。
注:脳組織は、地域のポリシーに従って除去する必要があります。 - 冷たいリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS、4°C)を使用して脳組織を洗浄します。
- 無傷の脳組織を液体窒素で急速凍結し、組織を-80°Cに移して長期保存します。
注:-80°Cで保存した場合、瞬間凍結した脳組織は少なくとも6か月間安定しています。
5. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による遺伝子発現の検出
- 脳組織を4°Cまたは氷上で融解します。
- 組織を1.5mLの微量遠心チューブに移し、TRIzolベースの方法13を用いて全RNAを抽出する。
- RNA抽出後、分光光度計( 材料表参照)を用いてRNAの濃度を測定します。
- 市販のキット14を用いて、トータルRNA(1μg)を相補的DNA(cDNA)に逆転写する。
- リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子発現レベルの測定15.
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Representative Results
マウスの睡眠不足のために確立された装置を図1Dに示す。睡眠不足開始後7日目に、脳波(EEG)および筋電図(EMG)モニタリング16は、デバイスがマウスの睡眠時間を有意に短縮し、覚醒時間の増加を図示しました(図2A-D)。一方、現在のプロトコルでは、脳内のアデノシンの蓄積とmRNAレベルが有意に増加し(図2E、F)、睡眠不足の成功のマーカーである17。ELISAキット18を用いて、血清コルチコステロン濃度は現在の睡眠剥奪プロトコルによって有意に変化しないことを観察した(図2G)。7日間の睡眠不足後、体重と胸腺の重量は有意に減少し(図3A-D)、以前の報告と一致した19。さらに、睡眠不足後のマウスでは耐糖能が有意に低下しました(図3E、F)。時計遺伝子発現の変化を調べるために、脳組織を1日を通して4時間ごとに収集しました。睡眠不足後、脳内の時計遺伝子の発現パターンが有意に変化していることが観察され(図3G、表1)、分子時計の乱れが示唆された20。
図1:ロッカープラットフォームベースのデバイスの確立。 (A)ロッカープラットフォームベースの装置を組み立てるのに必要な主要部品を描いたイラスト。(b)睡眠遮断装置の組み立てを示す詳細な手順。(C)タイムコンタクタのパラメータ設定を表示する画像。(D)完全に組み立てられた振動室の写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マウスにおける睡眠障害と血清コルチコステロンレベルの評価。 (A)睡眠不足時のマウスの脳波/筋電図記録を示す模式図。(B)マウスで追跡された代表的なEEG/EMG記録。(C)覚醒時、ノンレム睡眠、レム睡眠中のマウスの代表的な脳波/筋電図波形。 (D)睡眠障害マウスと対照マウス(n = 4匹/群)で記録された覚醒時間、ノンレム睡眠時間、およびレム睡眠時間の割合。*P < 0.05、***P < 0.001。統計解析は対応のない t検定を用いて行った。略語:CTR、対照群。ノンレム、非急速眼球運動;レム、急速な眼球運動;SD、睡眠不足グループ。(E)睡眠障害マウスおよび対照マウス(n=4マウス/群)で測定した脳組織中のHomer1aのmRNAレベル。*P < 0.05、統計解析は対応のない t検定を用いて行った。略語:CTR、対照群。Homer1a、ホーマー足場タンパク質1a;SD、睡眠不足グループ。(F)ELISAキットを用いて、睡眠障害マウスおよび対照マウス(n=4マウス/群)で測定した脳組織中のアデノシン含量。*P < 0.05、各時点で対応のない t検定 を用いて統計解析を行った。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(G)睡眠障害マウスおよび対照マウスで測定された血清コルチコステロン濃度(n = 4マウス/時点/群)。統計分析は、二元配置分散分析を用いて行った。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの睡眠不足後の病態生理学的変化。 (A)示された群のマウスの大きさを示す代表的な画像。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(B)示されたグループにおける睡眠剥奪の開始後の体重の変化(グループあたりn = 24マウス)。**P < 0.001、統計解析は対応のないt検定を使用して行われました。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(C)示されたグループにおける胸腺のサイズを示す代表的な画像。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(D)2群間の胸腺重量と体重の比率の比較(n=24匹/群)。**P < 0.001、統計解析は対応のないt検定を使用して行われました。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(E)腹腔内ブドウ糖負荷試験は、示されたグループ(グループあたりn = 5)の結果です。*P < 0.01;**P < 0.001、統計解析は対応のないt検定を用いて行いました。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(F)睡眠遮断群と対照群の間の腹腔内ブドウ糖負荷試験の曲線下面積(AUC)の比較(グループあたりn = 5)。**P < 0.001、統計解析は対応のないt検定を用いて行いました。略語:CTR、対照群。SD、睡眠不足グループ。(G)脳組織における時計遺伝子(Bmal1、Dbp、Cry1、Cry2、Nr1d1、Nr1d2、Per1、Per2)の概日発現パターンを、睡眠不足群と対照群(n=4匹/時点/群)で測定した。データは非線形コシナー回帰を用いて比較し、時計遺伝子の発現曲線はRパッケージCircaCompareを用いてフィッティングした。p値は示されているとおりに提供されます。略語:A、振幅;Bmal1、脳と筋肉はArnt様1;Cry1、クリプトクロム概日調節因子1;Cry2、クリプトクロム概日調節因子2;CTR、対照群;DbpのD部位の結合蛋白質;M、メソール;Nr1d1、核内受容体サブファミリー1、グループDメンバー1;Nr1d2、核内受容体サブファミリー1、グループDメンバー2;P、フェーズ;Per1、周期概日調節因子1;Per2、周期概日調節因子2;SD、睡眠不足グループ。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 時計遺伝子 | Bmal さん | DBPの | 泣き声1 | クライ2 | Nr1d1 | Nr1d2 | パー1 | Per2 (パー2) | |
| リズム | コントロール | P < 0.05 | P < 0.01 | P < 0.001 | P < 0.05 | P < 0.001 | P < 0.01 | P < 0.001 | P < 0.001 |
| 睡眠不足 | P < 0.05 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | |
| Acrophase (Zeitgeberの時間) | コントロール | 22 | 12 | 17 | 15 | 11 | 14 | 14 | 16 |
| 睡眠不足 | 10 | 24 | 4 | 3 | 22 | 0 | 1 | 1 | |
| Mesor 推定値 | コントロール | 0.933 | 2.242 | 1.136 | 1.171 | 1.799 | 1.41 | 1.289 | 1.033 |
| 睡眠不足 | 0.826 | 2.101 | 1.094 | 1.155 | 1.756 | 1.399 | 0.999 | 0.888 | |
| 振幅推定 | コントロール | 0.099 | 0.746 | 0.305 | 0.131 | 0.494 | 0.314 | 0.294 | 0.341 |
| 睡眠不足 | 0.108 | 0.866 | 0.342 | 0.168 | 0.503 | 0.323 | 0.388 | 0.305 | |
表1:各グループでテストされた時計遺伝子のリズム、メザー推定値、振幅推定値、およびアクロフェーズの存在。
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Discussion
睡眠不足のマウスモデルは、心血管疾患21、精神疾患22、神経障害23など、さまざまな疾患に対する睡眠障害の影響を研究するために不可欠です。マウスにおける既存の睡眠剥奪戦略の中で、睡眠の短期間の中断を繰り返す物理的アプローチが最も一般的に用いられている5,7,12。これらの物理的アプローチには、水プラットフォーム4、穏やかなハンドリング5、スライディングバーチャンバー6、24、回転ドラム7、または軌道シェーカー8、9、25、26の使用が含まれる。
マウスの睡眠不足を効果的に誘発するには、理想的な方法でマウスをストレスのない刺激で目覚めさせる必要があります。また、選択したデバイスは自動化され、剥奪と休息のサイクルを調整するために簡単に制御できる必要があります。上記の方法の中で、スライディングバーチャンバーはこれらの要件のほとんどを満たしています。ただし、高価であり、マウスに害を及ぼす場合があります。もう1つの効果的でストレスの少ない方法は、オービタルシェイカーベースのプロトコル7,8,9,25で、タイムコントローラーに接続された標準的な実験室用オービタルシェーカーにケージを置き、睡眠の中断を繰り返します。しかし、特定の研究設計で複数の軌道シェーカーを並行して運転する必要がある場合、一部の研究グループではコストが法外なものになる可能性があります。
軌道振とう器法に触発された本研究は、ロッカープラットフォームベースの睡眠遮断装置を確立するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提示する。そのコストは実験室の軌道振とう機の約10分の1であり、より身近なものとなっています。導入した機器は、脳波/筋電図モニタリングデータから有意な睡眠時間の短縮と睡眠不足マーカーの増加が示され、マウスの睡眠不足に有効であることが確認されました。さらに、このロッカープラットフォームベースのデバイスは、マウスの血清コルチコステロンレベルを有意に変化させませんでした。全体として、安価で効果的で、ストレスが最小限に抑えられ、制御可能な新しい自動睡眠遮断装置を導入しました。
その利点にもかかわらず、現在のプロトコルにはいくつかの制限があります。まず、今回紹介する睡眠遮断装置は、市販の既製の装置と異なり、実験者による組み立てが必要です。ただし、プロセスを簡素化するために、詳細なステップバイステップのプロトコルと図が提供されています。第2に、デバイスの確立に必要なすべての材料が市販されているわけではなく、この作業で提供される仕様に基づいて材料のいくつかのカスタマイズが必要になる場合があります。第三に、ロッカープラットフォームで使用される従来のウォーターボトルは漏れが発生する可能性があるため、この問題を防ぐためにカスタマイズされたウォーターボトルを使用する必要があります。
結論として、この研究は、グループ飼育されたマウスに睡眠不足を誘発する代替デバイスを確立するための費用対効果が高く効率的な方法を提示します。このプロトコルは、研究者がさまざまな健康状態に対する睡眠不足の影響と根本的なメカニズムを調査するのに役立ちます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(82230014、81930007、82270342)、上海優秀学術指導者プログラム(18XD1402400)、上海市科学技術委員会(22QA1405400、201409005200、20YF1426100)、上海浦江人材プログラム(2020PJD030)、SHWSRS(2023-62)、上海老化医療臨床研究センター(19MC1910500)、および蚌埠医科大学の大学院イノベーションプログラムからの助成金によって支援されました(Byycxz21075)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602002 | |
| Adenosine ELISA kit | Ruifan technology | RF8885 | |
| Animal cage | ZeYa tech | MJ2 | |
| Blood glucose meter | YuYue | 580 | |
| C57BL/6J Mice | JieSiJie Laboratory Animal | N/A | Age: 8-10 weeks |
| Connecting rod | ShengXiang Tech | N/A | Length: 20 cm |
| Cooling fan | LiMing | EFB0805VH | Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm |
| Corticosterone ELISA kit | Elabscience | E-OSEL-M0001 | |
| EEG/EMG recording and analysis system | Pinnacle Technology | 8200-K1-iSE3 | |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | |
| mosquito hemostats | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Motor and motor mount | MingYang | MY36GP-555 | Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Power brick adapter | MingYang | QiYe-0243 | Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m |
| qPCR commercial kit | Vazyme | Q711-02 | |
| qPCR measurement equipment | Roche | 480 | |
| Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm |
| Reverse RNA to cDNA commercial kit | Vazyme | R323-01 | |
| Screw and nut | Guwanji | N/A | Inner diameter: 6 mm, 12 mm |
| Screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Length: 300 mm |
| Slotted steel channels | Customized | N/A | Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm |
| Time contactor | LiXiang | DH48S-S | Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT |
| TRIzol | Vazyme | R401-01 |
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