Summary
El protocolo resume las mejores prácticas para minimizar la carga biológica microbiana en un entorno de sala limpia e incluye estrategias como el monitoreo ambiental, el monitoreo de procesos y las pruebas de esterilidad del producto. Es relevante para las instalaciones de fabricación y prueba que deben cumplir con los estándares actuales de buenas prácticas de tejidos y los estándares actuales de buenas prácticas de fabricación.
Abstract
Un programa holístico y bien validado que incorpore batas robustas, limpieza, monitoreo ambiental y medidas de monitoreo de personal es fundamental para minimizar la carga biológica microbiana en las salas de fabricación de terapia celular y los laboratorios de pruebas correspondientes para garantizar que las instalaciones operen en un estado de control. Garantizar la seguridad del producto a través de medidas de control de calidad, como las pruebas de esterilidad, es un requisito reglamentario tanto para las células, tejidos y productos celulares y a base de tejidos (HCT/Ps) mínimamente manipulados (sección 361) como para los más que mínimamente manipulados (artículo 351). En este video, proporcionamos una guía paso a paso sobre cómo desarrollar e incorporar las mejores prácticas asépticas para operar en un entorno de sala limpia, incluyendo batas, limpieza, puesta en escena de materiales, monitoreo ambiental, monitoreo de procesos y pruebas de esterilidad del producto utilizando inoculación directa, proporcionada por la Farmacopea de los Estados Unidos (USP<71>) y el Método Alternativo de Prueba de Esterilidad de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este protocolo pretende ser una guía de referencia para los establecimientos que se espera que cumplan con las buenas prácticas de tisú actuales (cGTP) y las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP).
Introduction
La implementación de un sólido programa de monitoreo microbiano a través del monitoreo ambiental (EM), monitoreo de procesos y pruebas de esterilidad del producto es un requisito regulatorio para las buenas prácticas tisulares actuales (cGTP) y las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) en laboratorios de terapia celular1. Además, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) espera que el laboratorio que realiza las pruebas de control de calidad (QC) del producto también emplee instalaciones y controles comparables a los utilizados para las operaciones de llenado aséptico2.
Este protocolo tiene cuatro secciones principales: 1) Prácticas asépticas, incluyendo bata de personal, limpieza y puesta en escena de materiales; 2) EM, incluidos los cultivos viables de aire y superficie y el monitoreo de partículas en el aire no viable; 3) monitoreo del proceso, incluidas las placas de sedimentación y el muestreo de la punta de los dedos enguantados; y 4) pruebas de esterilidad del producto a través de la farmacopea compendial de los Estados Unidos (USP) <71> método3 o el método alternativo de prueba de esterilidad4 de los NIH. Cuando se usan juntas, estas medidas pueden ser un método eficaz para garantizar que una instalación permanezca en un estado de control.
Las técnicas descritas aquí no son novedosas; Sin embargo, los estándares actuales de los reguladores y las organizaciones profesionales carecen de detalles, lo que ha llevado a la ausencia de monitoreo microbiano o la implementación de prácticas no estandarizadas, particularmente en centros académicos donde la fabricación in situ y las pruebas de esterilidad del producto están emergiendo a un ritmo rápido 1,5,6 . Este protocolo se puede utilizar como guía para crear un programa de monitoreo y control microbiano que cumpla con los requisitos reglamentarios cuando se usa junto con la validación del usuario final y las evaluaciones de riesgos.
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Protocol
1. Prácticas asépticas
- Personal vestido para un espacio de sala limpia
NOTA: Este procedimiento se basa en el vestido inicial en un espacio no clasificado, seguido de la entrada en un área de la Organización Internacional de Normalización (ISO) 8 y luego en un área ISO7. Este procedimiento es relevante para los laboratorios que intentan convertir el espacio existente en una función de sala limpia. Idealmente, todo el vestido inicial ocurriría en un espacio clasificado ISO8 (no en un espacio no clasificado).- Asegure el cabello suelto. Lávese las manos y cámbiese a exfoliantes (es preferible la parte superior de manga larga y los pantalones de exfoliación largos). Reúnase y cámbiese a zapatos de sala limpia con cubiertas para zapatos.
- Desinfecte las manos con un desinfectante de manos a base de alcohol inicialmente y luego nuevamente entre cada uno de los siguientes pasos: ponerse guantes no estériles y luego una cubierta para la barba (para cualquier cantidad de vello facial visible), si corresponde. Póngase un bouffant no estéril y cubra los antebrazos con mangas no estériles si no se han utilizado tapas de manga larga.
- Retire las cubiertas de los zapatos, pisando la alfombra pegajosa frente a la puerta de la antesala ISO8 con cada pie después de que se haya quitado la cubierta del zapato. Asegúrese de que todo el pie haga contacto con la alfombra pegajosa antes de ingresar. Deseche las cubiertas de los zapatos y descontamine los guantes y la manija de la puerta con alcohol isopropílico estéril al 70% (sIPA). Ingrese a la antesala ISO8.
- Reúna una capucha estéril, una mascarilla estéril, un mono estéril, fundas de botas estériles y gafas de seguridad. Descontaminar los guantes con 70% sIPA. Póngase gafas de seguridad y coloque los materiales sobre una superficie limpia, según el paso 1.5.
- Póngase un nuevo par de fundas para zapatos no estériles sobre los zapatos dedicados a la sala limpia y suba a la alfombra pegajosa frente a la antesala secundaria. Asegúrese de que la totalidad de cada pie haga contacto con la alfombra pegajosa. Descontaminar los guantes con 70% sIPA. Reúna los suministros de vestimenta escenificados y entre en la antesala secundaria ISO7, que permanece en el lado sucio de la línea de demarcación.
- Póngase la capucha estéril y el mono estéril, tocando solo el interior del material de la bata y asegurándose de que el cuello de la capucha esté metido dentro del mono para crear un sello completo. Póngase las cubiertas de botas estériles secundarias. Descontamine los guantes con un 70% de sIPA entre cada paso de colocación.
- Verifique que la bata se haya puesto correctamente, descontamine los guantes con 70% de sIPA e ingrese al espacio ISO7.
NOTA: Inspeccione periódicamente el material de la bata para verificar su integridad. Si se ve comprometido, salga de la sala limpia inmediatamente y vuelva a vestirse.
- Ponerse para un gabinete de seguridad biológica (BSC)
- Bata según el paso 1.1 anterior con estas prácticas adicionales.
- Reúna guantes estériles y mangas estériles. Limpie el BSC según el paso 1.4 y organice los materiales según el paso 1.5. Descontaminar los guantes con 70% sIPA.
- Asépticamente póngase mangas estériles sobre el mono, usando bucles para el pulgar si están presentes. Coloque guantes estériles sobre los guantes existentes, asegurándose de que el puño del guante se extienda sobre la manga estéril. Descontamine los guantes con un 70% de sIPA entre cada paso. Entra en el BSC.
NOTA: Inspeccione periódicamente el material de la bata para verificar su integridad. Si se ve comprometido, salga de la sala limpia inmediatamente y vuelva a vestirse.
- Desprendimiento de los materiales de bata
- Salga del BSC y quítese con cuidado el par de guantes superiores y las mangas estériles. Descontaminar los guantes interiores con 70% sIPA.
- Ingrese a la antesala secundaria y luego primaria, esperando que la puerta se cierre completamente entre cada paso. Retire los materiales en el siguiente orden: cubiertas exteriores estériles para botas, mono, capucha y mascarilla.
- Salga de la antesala principal y retire la bata no estéril.
NOTA: El orden de eliminación en el espacio no clasificado no es importante; Sin embargo, las cubiertas interiores no estériles deben permanecer en los zapatos de sala limpia para su almacenamiento en espacios no clasificados. - Desinfecte las manos con un desinfectante de manos a base de alcohol y vuelva a la ropa de calle.
- Limpieza de las superficies de las salas blancas y del BSC
- Ensamble un trapeador de limpieza de mano u obtenga una toallita limpia con pelusa baja. Si usa una toallita baja en pelusas, doble la toallita en cuartos y gire entre cada superficie. Sature el cabezal de la fregona o la toallita con pelusa baja con un desinfectante aprobado.
- Trabajando de atrás hacia adelante (o de arriba a abajo), limpie el BSC usando toallitas superpuestas en el siguiente orden: la parrilla difusora HEPA (la parte superior del BSC), la pared posterior del BSC, ambas paredes laterales del BSC, la hoja y la superficie de trabajo. Finalmente, limpie la hoja del BSC con 70% de sIPA para eliminar cualquier desinfectante residual. Consulte la Figura 1 para ver un patrón de limpieza típico de BSC.
- Preparación de materiales y equipos en entornos clasificados
- Descontaminar (es decir, estadificar) todos los materiales que requieren transferencia de un área no clasificada o clasificada inferior a un área clasificada más alta (por ejemplo, de un espacio ISO8 a ISO7) para minimizar la transferencia de microbios. La transferencia de materiales entre áreas del mismo nivel de clasificación ISO no requiere puesta en escena.
NOTA: Si los materiales han sido esterilizados terminalmente y están en varias bolsas, retire la bolsa exterior y mueva el material al espacio clasificado; No es necesario limpiar la bolsa/bolsa interna. - Obtenga una toallita baja en pelusa y doble la toallita en cuartos para girar hacia un lado limpio a medida que la toallita se ensucie. Sature la toallita con 70% de sIPA o un desinfectante aprobado.
- Limpie el exterior del material/equipo con toallitas superpuestas. Asegúrese de que todas las áreas del artículo estén limpias, incluido el interior de los sellos del paquete separables y los rincones / hendiduras en el equipo y otros suministros de forma irregular. Para el equipo sobre ruedas, asegúrese de que toda la rueda se haya limpiado durante el proceso de estadificación (es posible que sea necesario inclinar suavemente el equipo para permitir que las ruedas giren).
- Descontaminar (es decir, estadificar) todos los materiales que requieren transferencia de un área no clasificada o clasificada inferior a un área clasificada más alta (por ejemplo, de un espacio ISO8 a ISO7) para minimizar la transferencia de microbios. La transferencia de materiales entre áreas del mismo nivel de clasificación ISO no requiere puesta en escena.
Figura 1: Ejemplo de un patrón de limpieza BSC. Trabajando de atrás hacia adelante (o de arriba a abajo), limpie el BSC usando toallitas superpuestas en el siguiente orden: la parrilla difusora HEPA (la parte superior del BSC), la pared posterior del BSC, ambas paredes laterales del BSC, la hoja y la superficie de trabajo. Finalmente, limpie la hoja del BSC con 70% de sIPA para eliminar cualquier desinfectante residual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Monitoreo ambiental (EM)
- Muestreo de superficie viable
- Organice los materiales necesarios para la sesión de muestreo según el paso 1.5 y se incorpore al espacio clasificado según la sección 1.
NOTA: El muestreo de superficie debe realizarse antes del muestreo de aire en cualquier lugar especificado. Si utiliza varias placas para tomar muestras de superficie de un área, no muestree exactamente la misma ubicación. Use placas de contacto para tomar muestras de superficies planas solo para garantizar un contacto completo y evitar daños potenciales al agar. - Recoja y etiquete una placa de agar tríptico de soja con lecitinasa y tween (TSALT) y una placa de dextrosa Sabouraud con lecitinasa y placa de interpolación (SABLT) para cada sitio de muestreo. Sosteniendo la parte inferior de la placa con una mano, retire asépticamente la tapa, teniendo cuidado de no tocar la superficie de agar elevada.
- Toque el agar elevado con la superficie que se está muestreando, asegurándose de que toda la superficie esté en contacto, y aplique una presión firme a la placa. Deje la placa en contacto con la superficie durante al menos 5 s.
- CRÍTICO: No mueva la placa lateralmente sobre la superficie que se está muestreando, ya que esto puede extender el crecimiento potencial sobre el área de superficie, dificultando la resolución de colonias individuales. No ejerza una fuerza excesiva sobre la placa de contacto durante el muestreo, ya que la superficie del agar puede agrietarse.
- Reemplace asépticamente la cubierta, teniendo cuidado de no tocar la superficie elevada del agar. Bloquee la tapa en su lugar si la placa de contacto tiene un sistema de bloqueo. Limpie el área de muestreo con sIPA al 70% para eliminar cualquier medio residual de la superficie. Empaque holgadamente las placas e incube los cultivos como se describe en la Tabla 1. En la Figura 2 se ilustra una imagen representativa que muestra el crecimiento de tres unidades formadoras de colonias (UFC) con dos morfologías de colonias distintas en una placa de muestreo de superficie TSALT. La Figura 3 muestra la contaminación de una placa de TSALT con crecimiento en el borde de la placa, atribuible a una técnica aséptica deficiente durante la recolección de muestras.
- Organice los materiales necesarios para la sesión de muestreo según el paso 1.5 y se incorpore al espacio clasificado según la sección 1.
- Muestreo de aire viable
- Organice los materiales necesarios para la sesión de muestreo según el paso 1.5 y se incorpore al espacio clasificado según la sección 1.
- Recoja y etiquete una placa de agar tríptico de soja (TSA) y una placa de agar dextrosa Sabouraud (SAB) para cada sitio de muestreo. Prepare el muestreador de aire retirando asépticamente el cabezal de muestreo agarrando solo el borde exterior para evitar contaminar el cabezal.
- Sosteniendo el cabezal de muestreo en una mano, coloque asépticamente el medio en el soporte de la placa en el muestreador. Si hay una púa que es más larga que las otras, inserte el medio contra la púa más larga primero y luego empuje la placa hacia abajo en las puntas restantes para asegurar la placa.
- Retire asépticamente la tapa de la placa y colóquela sobre una superficie limpia hasta que se haya completado el muestreo. Reemplace y asegure asépticamente el cabezal de muestreo, agarrando solo el borde exterior para evitar contaminar el cabezal. Repita los pasos 2.2.2-2.2.4 para el medio restante si utiliza un muestreador de aire de varios cabezales.
- Coloque el muestreador de aire en el lugar de muestreo con los cabezales de muestreo orientados en la dirección predominante del movimiento del flujo de aire. Asegúrese de que el escape del muestreador de aire no viable (si se muestrea simultáneamente) no interfiera con el muestreador viable. Asegúrese de que el muestreador de aire esté ajustado a la configuración validada e inicie el ciclo de muestreo.
- Cuando se haya completado el ciclo de muestreo, retire asépticamente el cabezal de muestreo del muestreador agarrando solo el borde exterior para evitar contaminar el cabezal. Sostenga el cabezal de muestreo en una mano y reemplace asépticamente la tapa de la placa de agar. Retire la placa del soporte de placa. Empaque holgadamente las placas e incube los cultivos como se describe en la Tabla 1.
- Desinfecte el cabezal de muestreo y el área alrededor del soporte de la placa con 70% de sIPA. Asegure asépticamente el cabezal de muestreo, agarrando solo el borde exterior. Repita los pasos 2.2.6 y 2.2.7 para el medio restante si utiliza un muestreador de aire de varios cabezales.
NOTA: La Figura 4 muestra un cultivo de muestreo de aire activo TSA con crecimiento causado por un cabezal de muestreo contaminado. Por el contrario, la Figura 5 representa un cultivo de muestreo de aire activo TSA sin crecimiento. Las hendiduras de impacto de aire del cabezal de muestreo se pueden ver en la imagen.
- Muestreo no viable
- Realice una comprobación cero en el contador de partículas láser antes de las actividades de muestreo para cada día de uso. Acople el cabezal isocinético al puerto de muestreo del contador de partículas, ya sea directamente o fijado a una longitud de tubo según sea necesario para el lugar de muestreo.
- Si se aplica tubería, use una longitud corta, ya que la tubería de >1 m de largo puede causar problemas con la enumeración de partículas de ≥1 μm y también puede provocar curvas innecesarias en el tubo. Asegúrese de que el contador de partículas esté configurado en la configuración validada. Se recomienda establecer un retardo de aproximadamente 30 s para permitir la salida de la zona de muestreo y evitar la interrupción del flujo de aire durante el muestreo.
- Coloque el cabezal isocinético del contador de partículas láser en el lugar de muestreo con el cabezal isocinético orientado hacia la dirección predominante del movimiento del flujo de aire. Asegúrese de que el escape del muestreador de aire viable (si se muestrea simultáneamente) no interfiera con el muestreador no viable. Para áreas donde el flujo de aire no es unidireccional o el patrón de flujo de aire es desconocido, asegúrese de que la cabeza isocinética mire verticalmente hacia arriba.
NOTA: Si el desinfectante rotacional o sIPA al 70% se ha aerosolizado cerca del muestreador de aire, espere al menos 5 minutos antes de comenzar el ciclo de muestreo. - Inicie el ciclo de muestreo y salga lentamente del área de muestreo para evitar interrumpir el flujo de aire.
CRÍTICO: No aerosolice líquidos cerca del muestreador de aire durante un ciclo de muestreo, ya que esto causará altos recuentos no viables. - Cuando se haya completado el muestreo, recupere el contador de partículas láser. Registre el recuento promedio de partículas para 0.5 μm. Algunas instalaciones también pueden rastrear y establecer una tendencia de 5.0 μm.
- Repita los pasos 2.3.3-2.3.6 para la siguiente ubicación de muestreo. Si se mueve entre habitaciones o BSC, limpie el exterior del muestreador de partículas no viable con un 70% de sIPA o un desinfectante aprobado. Evite que el desinfectante entre en el cabezal isocinético, ya que esto podría provocar recuentos de partículas inexactos.
| Categoría | Medio | Condiciones de cultivo | Observación de la cultura | Resultados | ||||||
| Vigilancia ambiental | TSA (aire viable) | 30 °C-35 °C, aire, durante al menos 3 días | Fin de la incubación | El grupo de GC de cada instalación debe establecer límites de alerta y acción para cada tipo de muestreo y ubicación. Los límites de acción para muestras viables basadas en la clasificación ISO se pueden guiar utilizando PIC/S 009-16 (Anexos) 18 e ISO-14644-1 7. Los límites de acción para muestras de aire no viables generalmente se establecen en un porcentaje del límite ISO (por ejemplo, 99%). Los límites de alerta para muestras viables generalmente se establecen en un porcentaje del límite de acción o el límite ISO (por ejemplo, 95%). Consulte PDA TR-13 y USP<1116> para obtener más detalles sobre el establecimiento de niveles de alerta y acción y la validación de las condiciones de cultivo seleccionadas 8,9. | ||||||
| SAB (aire viable) | 20 °C-25 °C, aire, durante al menos 7 días | |||||||||
| TSALT (superficie viable) | 30 °C-35 °C, aire, durante al menos 3 días | Las imágenes representativas de las placas EM se muestran en la Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5. | ||||||||
| SABLT (superficie viable) | 20 °C-25 °C, aire, durante al menos 7 días | |||||||||
| Monitoreo de procesos | TSA (placa de sedimentación) | 30 °C-35 °C, aire, durante al menos 3 días | Solo a título informativo. Proporciona información útil en caso de una investigación OOS en respuesta a una prueba de esterilidad del producto fallida. | |||||||
| SAB (placa de decantación) | 20 °C-25 °C, aire, durante al menos 7 días | Consulte la figura 6 para ver un ejemplo de una placa de sedimentación positiva. | ||||||||
| Muestreo con la yema del dedo enguantado | TSALT | 30 °C-35 °C, aire, durante al menos 48 horas días, seguido de 20 °C-25 °C durante al menos 5 días 19. | El criterio de aceptabilidad para GFS es <1 UFC/placa (es decir, sin crecimiento) según PIC/S 009-16 (Anexos) 18. Los criterios de aceptabilidad pueden modificarse a discreción de la garantía de calidad de la instalación. | |||||||
| Pruebas de esterilidad del producto | TSB (USP<71>) | 20 °C-25 °C, aire, durante al menos 14 días | Periódicamente durante todo el período de incubación (días 3, 5, 7 y 14) | Sin crecimiento. | ||||||
| FTM (USP<71>) | 30 °C-35 °C, aire, durante al menos 14 días | |||||||||
| iFA+ (método NIH) | 30 °C-35 °C, aire, durante al menos 14 días | Monitorización automática mediante el instrumento BacT/ALERT Dual-T. Se recomienda encarecidamente la revisión visual de cada botella al final de la incubación en busca de bolas de molde. | Consulte la Figura 8 para ver un ejemplo de bolas de molde visibles que no pudieron ser detectadas automáticamente por el BacT/ALERT. | |||||||
| iFN+ (método NIH) | ||||||||||
| SAB (método NIH) | 20 °C-25 °C durante al menos 14 días | Periódicamente durante todo el período de incubación (días 3, 5, 7 y 14) | ||||||||
Tabla 1: Resumen de las condiciones de cultivo recomendadas y resultados esperados. Las condiciones de cultivo descritas aquí son recomendaciones basadas en un programa validado utilizado en los NIH. Se requiere que cada usuario final valide su propio programa de pruebas microbiológicas. Las estrategias de control microbiano y pruebas pueden diferir entre los institutos dependiendo de variables que incluyen el diseño de la instalación, la flora de la instalación y la clasificación del riesgo del producto.
Figura 2: Crecimiento en la placa de TSALT. La placa de muestreo de superficie TSALT muestra tres UFC de dos morfologías de colonias distintas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Contaminación de la placa TSALT durante la recolección. El cultivo superficial de TSALT muestra una sola colonia en el borde de la placa, indicativo de un manejo aséptico deficiente durante el proceso de muestreo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cultivo obtenido utilizando un cabezal de muestreo de aire contaminado. Ejemplo de un cultivo de muestreo de aire activo TSA que muestra >100 unidades formadoras de colonias (UFC) de morfologías mixtas. El patrón de crecimiento indica contaminación del cabezal de muestreo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: No hay crecimiento en una placa de aire viable activa TSA. Placa de aire viable activa TSA que ilustra que no hay crecimiento después de la incubación. Las hendiduras del cabezal del muestreador de aire activo se pueden ver en la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Monitoreo de procesos
- Placas de sedimentación (monitorización pasiva del aire)
- Coloque las placas TSA y SAB etiquetadas cerca del área de trabajo, pero en un área que no interfiera con las pruebas. Documente la hora de inicio del muestreo y abra asépticamente ambas placas, colocando las tapas sobre una superficie limpia en el BSC lejos del área de trabajo.
- Las placas de decantación pueden estar abiertas durante un máximo de 4 h para evitar que el agar se seque. Cierre las tapas de las placas al final del procesamiento. Empaque holgadamente las placas e incube los cultivos como se describe en la Tabla 1. La Figura 6 muestra un solo contaminante de colonia en una placa de sedimentación de aire TSA.
- Muestreo con la punta del dedo enguantado (GFS)
- Obtenga dos placas TSALT etiquetadas. Retire asépticamente la tapa de una placa y colóquela sobre una superficie de trabajo limpia lejos del área de muestreo.
- Enrolle suavemente la yema de cada dedo y pulgar de una mano sobre la superficie de la placa (Figura 7). Muestree el área de superficie más grande de cada dedo / pulgar en lugar de la punta. Use la fuerza suficiente para hacer ligeras depresiones en el agar sin agrietar la superficie del agar.
- Vuelva a colocar la tapa sobre la placa de forma aséptica y repita el paso 3.2.2 para la otra mano. Desinfecte las manos con 70% de sIPA al finalizar el muestreo. Empaque holgadamente las placas e incube los cultivos como se describe en la Tabla 1.
Figura 6: Crecimiento en una placa de sedimentación de aire TSA. Una placa de sedimentación de aire TSA que ilustra una sola colonia de un contaminante cultivado durante el monitoreo pasivo del proceso de aire en el BSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Muestreo con la punta del dedo enguantado. El método correcto para obtener muestras de la punta del dedo enguantado utilizando el área de superficie más grande (o almohadilla) de cada dedo / pulgar se muestra a la izquierda. El proceso incorrecto en el que solo se muestrea la yema del dedo se muestra a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Pruebas de esterilidad por inoculación directa del producto
- Inoculación directa después de USP<71>
- Obtenga una botella de caldo de soja tríptico (TSB) etiquetada y una botella de medio de tioglicolato fluido (FTM) etiquetada para cada artículo de prueba enviado. Para la sesión de prueba, obtenga una TSALT y una SABLT para muestreo de superficie viable, una placa TSA y una placa SAB para placas de sedimentación, y dos placas TSALT para GFS.
- Bata para trabajar dentro del BSC según el paso 1.2. Limpie el BSC según el paso 1.4. Coloque los materiales en el BSC según el paso 1.5. Realice muestreos de contacto del área de trabajo crítica según el paso 2.1, limpiando la superficie con 70% de sIPA después del muestreo. Prepare las placas de sedimentación TSA y SAB cerca del área de trabajo según el paso 3.1.
- Obtenga el artículo de prueba y las botellas TSB y FTM asociadas. Si los frascos TSB y FTM tienen tabique, retire las tapas protectoras de cada frasco y limpie el tabique con una toallita con alcohol estéril. Si las botellas TSB y FTM tienen una tapa de rosca, afloje la tapa de las botellas (pero no retire la tapa).
- Vórtice el artículo de prueba para garantizar una suspensión homogénea. Inocular los frascos con el volumen validado del artículo de ensayo (hasta 10 ml/frasco) utilizando una jeringa estéril y una aguja hipodérmica (para tapas de tabique) o una pipeta (para tapones de rosca).
- Después de la inoculación, limpie el tabique con una toallita con alcohol estéril e inserte una unidad de ventilación estéril para permitir el intercambio de aire durante la incubación. Para botellas con tapa de rosca, cierre la botella pero deje la tapa de 1/4 a 1/2 vuelta suelta para permitir el intercambio de aire durante la incubación. Repita los pasos 4.1.3-4.1.5 para cada artículo de prueba que se vaya a probar dentro de esa sesión.
- Cierre asépticamente las placas de sedimentación TSA y SAB, y documente la hora final del muestreo. Realice GFS según el paso 3.2, limpiando los guantes con 70% de sIPA después del muestreo. Empaque holgadamente las placas e incube los cultivos como se describe en la Tabla 1.
- Transfiera todos los materiales de prueba fuera del BSC y limpie el BSC según el paso 1.4.
- Inoculación directa siguiendo el método alternativo de prueba de esterilidad de los NIH
- Obtenga una etiqueta i FA+, una etiquetada iFN+ y una placa SAB para cada artículo de prueba. Para la sesión de prueba, obtenga una TSALT y una SABLT para muestreo de superficie viable, una placa TSA y una placa SAB para placas de sedimentación, y dos placas TSALT para GFS.
- Bata para trabajar dentro del BSC según el paso 1.2. Limpie el BSC según el paso 1.4. Coloque los materiales en el BSC según el paso 1.5. Realice muestreos de contacto del área de trabajo crítica según el paso 2.1, limpiando la superficie con 70% de sIPA después del muestreo. Prepare las placas de sedimentación TSA y SAB cerca del área de trabajo según el paso 3.1.
- Obtenga el artículo de prueba y la placa iFA+, iFN+ y SAB asociadas. Retire las tapas protectoras de los frascos i FA+ e iFN+ y limpie el tabique con una toallita con alcohol estéril.
- Vórtice el artículo de prueba para garantizar una suspensión homogénea. Inocular los frascos con el volumen validado del artículo de ensayo (hasta 10 ml/frasco) utilizando una jeringa estéril y una aguja hipodérmica. Limpie el tabique con una toallita con alcohol estéril después de la inoculación. Incubar los frascos en el instrumento BacT/ALERT Dual-T como se describe en la Tabla 1.
- Utilizando una pipeta, inocular la placa SAB con la cantidad validada del artículo de ensayo (no más de 500 μL/placa) y rayar el aislamiento utilizando un asa estéril. Deje reposar durante 10 minutos para asegurarse de que la muestra no se ejecute en la tapa de la placa cuando se invierte para la incubación. Coloque cada placa SAB inoculada con el artículo de prueba en una bolsa de plástico, átela holgadamente e incube como se describe en la Tabla 1.
- Cierre asépticamente las placas de sedimentación TSA y SAB, y documente la hora final del muestreo. Realice GFS como se describe en el paso 3.2, limpiando los guantes con 70% de sIPA después del muestreo. Empaque holgadamente las placas e incube los cultivos como se describe en la Tabla 1. La inspección visual de las botellas BacT/ALERT al final del período de incubación es esencial para detectar bolas de moho que pueden haber pasado desapercibidas por el instrumento (Figura 8).
- Transfiera todos los materiales de prueba fuera del BSC y limpie el BSC según el paso 1.4.
Figura 8: Crecimiento de moho que no pudo ser detectado por el BacT/ALERT. Ejemplo de bolas de molde, visibles a simple vista, que no pudieron ser detectadas automáticamente por el sistema BacT/ALERT. Con base en estos hallazgos, recomendamos la inspección visual terminal de todas las botellas de BacT/ALERT y la adición de la placa SAB para cultivo de hongos utilizando el Método Alternativo de Prueba de Esterilidad de los NIH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Los resultados esperados se describen en la Tabla 1. Los datos EM deben revisarse y seguirse con una investigación y respuesta adecuadas a la acción, alerta o excursiones de límite ISO. Si se produce una excursión para partículas no viables, se debe proceder según ISO 14644-Anexo A, sección A.5.57. Si la excursión puede atribuirse a una ocurrencia anormal inmediatamente identificable, los resultados originales del muestreo deben documentarse, se debe agregar una nota para ignorar los resultados originales y se debe proporcionar una descripción detallada de la ocurrencia anormal. Se puede tomar otra muestra en el sitio en cuestión. Si la excursión no puede atribuirse a una ocurrencia anormal inmediatamente identificable, documente el resultado del muestreo. Tome otro conjunto de muestras no viables en el sitio en cuestión inmediatamente después de identificar el resultado fuera de especificación (OOS). Esto se puede utilizar como parte de la investigación. Según ISO 14644-Anexo A, sección A.5.6, investigue el hallazgo de OOS y remedie la causa raíz identificada.
Una prueba de esterilidad del producto fallida dará como resultado la turbidez del cultivo USP<71> o el crecimiento en las botellas BacT/ALERT y/o la placa SAB (Figura 8). El organismo debe identificarse a nivel de especie, y se deben realizar pruebas de sensibilidad apropiadas, si está clínicamente justificado. El laboratorio de pruebas debe completar una investigación para determinar si el resultado de OOS es válido o si hubo algún error de laboratorio potencial que pueda haber contribuido al OOS. Se recomienda encarecidamente realizar pruebas de la muestra de retención. La decisión de retener o liberar el producto para perfusión debe ser tomada por el equipo de atención clínica del paciente y por el equipo de fabricación, microbiología, enfermedades infecciosas, garantía de calidad y asuntos regulatorios. Para HCT / P que ya pueden haber sido infundidos en base a pruebas preliminares en proceso, el paciente debe ser monitoreado cuidadosamente y se debe presentar un informe de evento a la agencia reguladora apropiada.
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Discussion
Hay varias áreas críticas en este protocolo, incluido el mantenimiento de la técnica aséptica y el flujo de aire unidireccional dentro de las salas limpias y los BSC. Las mejores prácticas incluyen moverse lenta y deliberadamente para minimizar la turbulencia. Las manipulaciones asépticas deben realizarse desde el lado del producto, no desde arriba. Se recomienda el procesamiento de sistemas cerrados y el uso de materias primas esterilizadas terminalmente. Se debe evitar hablar en áreas críticas y apoyarse contra paredes o equipos. Del mismo modo, se debe evitar tocar innecesariamente artículos no estériles y recoger artículos caídos hasta que se haya completado el procesamiento estéril. Los materiales en el BSC deben estar dispuestos para evitar el bloqueo del flujo de aire y para mantener el movimiento unidireccional de limpio a sucio. El movimiento del operador dentro y fuera del BSC debe minimizarse. La documentación de todas las actividades, incluidos los números de lote, las fechas de vencimiento, las fechas de calibración, las horas de inicio / parada y el personal de prueba para todos los materiales, equipos y procesos dentro de una sesión de muestreo o prueba también es crítica.
El procedimiento EM descrito aquí se basa en la incubación manual y el conteo de colonias. El diseño de un programa EM queda a discreción del usuario final. Los lugares de muestreo y la frecuencia de prueba deben guiarse por el Informe Técnico PDA 13 8 y justificarse mediante una evaluación de riesgos que incorpore el flujo de trabajo del laboratorio, la proximidad del producto, la criticidad del sitio, la duración y el número de personal paracada paso 8 del flujo de trabajo. Un programa EM típico debe incorporar las partículas totales de aire (partículas no viables de 0,5 μm), el muestreo de aire viable (1.000 L) y el muestreo de superficie viable recogido en condiciones dinámicas con una frecuencia basada en el riesgo del producto y las tendencias históricas. Por lo general, se recomienda el muestreo semanal para las nuevas instalaciones hasta que se hayan establecido suficientes tendencias de datos. La orientación general para EM y las condiciones de cultivo se proporciona en la Tabla 1 y en USP<1116>9; sin embargo, otros han evaluado diferentes condiciones de cultivo, como el medio que se limitó a TSA / TSALT solamente, y diferentes temperaturas de incubación, incluidas las temperaturas duales10,11. Los instrumentos EM automatizados que combinan la incubación con la lectura de placas de recuento de colonias se utilizan comúnmente en el mercado farmacéutico como métodos rápidos 8,12. El programa EM elegido debe ser validado y generalmente depende de la flora de la instalación, la capacidad de la incubadora, el volumen de prueba y la capacidad del personal. Además, un programa EM establecido debe tener un ciclo de vida activo, con ajustes relevantes realizados en los sitios de recolección, frecuencia de prueba y / o límites de alerta / acción basados en una revisión anual y una evaluación de riesgos basada en datos8. Los cambios importantes en las tendencias de los mercados emergentes pueden desencadenar la reevaluación del programa de limpieza. Los desinfectantes deben validarse mediante un estudio de eficacia del desinfectante utilizando superficies de materiales representativos contra la flora de la instalación durante el tiempo de contacto prescrito, como se describe en USP<1072>13. Los desinfectantes típicos pueden incluir Vesphene III (tiempo de contacto: 10 min), LpH III (tiempo de contacto: 10 min) y un agente esporicida como Peridox RTU (tiempo de contacto: 5 min). Para las mejores prácticas, los desinfectantes deben rotarse mensualmente, y los enchufes, las conexiones mecánicas y las superficies de trabajo que están debajo del equipo en el BSC deben limpiarse rutinariamente.
El volumen mínimo de producto que debe probarse para determinar la esterilidad se define en USP<71>3 y se basa en el volumen total del producto final. Desafortunadamente, USP<71> fue diseñado originalmente para productos farmacéuticos estériles y se reconoce que no es adecuado para productos de corta vida útil debido al lento tiempo de respuesta y al alto volumen de prueba del producto14. USP<1071> reconoce que los métodos microbianos rápidos alternativos pueden ser beneficiosos y que los volúmenes de prueba de productos más bajos pueden ser aceptables cuando se ha aplicado un enfoque basado en el riesgo14. Dadas las limitaciones de USP<71> para las pruebas de esterilidad de productos de terapia celular, se han utilizado métodos alternativos como los métodos automatizados de respiración BacT/ALERT en la industria 1,4,6. Sin embargo, cualquier uso de un método de prueba alternativo requiere una validación rigurosa por parte del usuario final para demostrar la no inferioridad con el método USP<71> para ese producto 5,15,16. También se requiere una prueba de idoneidad del método para cada nuevo producto para garantizar que el producto, con el volumen de inoculación y las condiciones de prueba elegidos, no sea inhibidor de la detección de contaminantes de bajo nivel6. Por lo tanto, es posible que el volumen de prueba y el volumen de inoculación puedan variar entre productos dependiendo del resultado de los estudios de validación. La filtración por membrana, un método secundario descrito en USP<71>, se puede utilizar para muestrear un volumen de muestra mayor en una sola prueba. Las pruebas de validación e idoneidad del método deben incluir organismos más allá de los seis aislados de control de calidad compendial. Se debe prestar atención a la flora de las instalaciones recuperada con frecuencia y a los contaminantes de productos anteriores. Se debe prestar especial atención a los hongos, ya que los métodos de respiración por sí solos han demostrado un rendimiento subóptimo 4,17, razón por la cual el Método Alternativo de Prueba de Esterilidad de los NIH incluye un cultivo de hongos pareado en SAB y una inspección visual terminal de las botellas de BacT/ALERT.
Una limitación importante para cualquier programa de control microbiano es la naturaleza retrospectiva en la que los resultados están disponibles. Las pruebas estándar de oro se basan en el cultivo, lo cual es lento y puede conducir a medidas reactivas constantes para la acción correctiva. Los métodos de prueba más rápidos requieren una validación rigurosa, pero aún no pueden proporcionar una garantía en tiempo real del monitoreo y control microbiano. Además, los cultivos microbiológicos capturan solo un pequeño subconjunto de tiempo durante una sesión de producción o prueba. Por lo tanto, es fundamental que la monitorización microbiana activa se realice con frecuencia justificada por el riesgo para garantizar que los datos de tendencias estén bien establecidos. Esto permitirá el uso de límites de alerta establecidos adecuadamente para predecir posibles desviaciones del control microbiano antes de que ocurran.
El establecimiento de un programa robusto cGTP / cGMP requiere tiempo y esfuerzo y, desafortunadamente, no puede simplemente transferirse de una instalación a otra. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos espera que todos los programas se sometan a pruebas de validación del usuario final a pesar de la posible disponibilidad de resultados publicados por terceros que demuestren su eficacia. Por lo tanto, el control microbiano y las estrategias de prueba pueden diferir entre los institutos dependiendo de variables que incluyen el diseño de la instalación, la flora de la instalación y la clasificación del riesgo del producto. Las estrategias descritas en este protocolo ayudan a proporcionar un marco a través del cual establecer un programa sólido de monitoreo y control microbiano para los laboratorios cGTP / cGMP.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-25°C Incubator | Lab preference | ||
| 30-35°C Incubator | Lab preference | ||
| Alcohol-based hand sanitizer | Lab preference | ||
| BacT/ALERT Dual-T instrument | BioMerieux Industry | ||
| Beard cover | Lab preference | ||
| Biosafety cabinet (BSC) | Lab preference | ||
| Cleanroom shoes | Lab preference | ||
| Fluidthioglycollate medium (FTM) | Hardy Diagnostics | U84 | USP |
| Handheld cleaning mop | Contec | 2665LF | |
| Hypodermic needle | Lab preference | ||
| iFA+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412990 | |
| iFN+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412991 | |
| Isokinetic head | Lab preference | ||
| Laser particle counter | TSI Incorporated | 9500-01 | |
| LpH III | Steris | 1S16CX | |
| Mirror | Lab preference | ||
| Non-sterile bouffant | Lab preference | ||
| Non-sterile gloves | Lab preference | ||
| Non-sterile shoe covers | Lab preference | ||
| Non-sterile sleeve covers | Lab preference | ||
| Parafilm | Lab preference | ||
| Peridox RTU | Contec | CR85335IR | |
| Plastic bag | Lab preference | ||
| Sabouraud Dextrose Agar with Lecithinase and Tween (SABLT) | Hardy Diagnostics | P595 | USP, irradiated |
| Sabouraurd Dextrose Agar (SAB) | Hardy Diagnostics | W565 | USP, irradiated |
| Safety glasses | Lab preference | ||
| Scrubs (top and bottom) | Lab preference | ||
| Spor-Klenx RTU | Steris | 6525M2 | |
| Sterile 70% isopropyl alcohol (IPA) | Decon CiDehol | 8316 | |
| Sterile alcohol wipe | Lab preference | ||
| Sterile boot covers | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile coveralls | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile face mask | Lab preference | ||
| Sterile gloves | Lab preference | ||
| Sterile hood | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile low-lint wipes | Texwipe | TX3210 | |
| Sterile mop cleaning pads | Contec | MEQT0002SZ | |
| Sterile sleeve covers | Kimberly Clark | 36077 | |
| Sterile spreading rod | Fisher Scientific | 14665231 | |
| Sterile syringe | Lab preference | ||
| Tacky mats | Lab preference | ||
| Tryptic Soy Agar (TSA) | Hardy Diagnostics | W570R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Agar with Lecithinase and Tween (TSALT) | Hardy Diagnostics | P520R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Hardy Diagnostics | U46 | USP |
| Tubing | Lab preference | ||
| Vesphene III | Steris | 1S15CX | |
| Viable air sampler | Hardy Diagnostics | BAS22K | |
| Vortex | Lab preference |
References
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