Summary
Dette arbeidet presenterer en dyremodell av endotel-til-mesenkymal overgangsindusert fibrose, som sett i medfødte hjertefeil som kritisk aortastenose eller hypoplastisk venstre hjertesyndrom, som muliggjør detaljert histologisk vevsevaluering, identifisering av regulatoriske signalveier og testing av behandlingsalternativer.
Abstract
Endokardial fibroelastose (EFE), definert ved subendokardial vevsakkumulering, har stor innvirkning på utviklingen av venstre ventrikkel (LV) og utelukker pasienter med medfødt kritisk aortastenose og hypoplastisk venstre hjerte-syndrom (HLHS) fra kurativ anatomisk biventrikulær kirurgisk reparasjon. Kirurgisk reseksjon er i dag eneste tilgjengelige behandlingsalternativ, men EFE kommer ofte tilbake, noen ganger med et enda mer infiltrativ vekstmønster inn i tilstøtende myokard.
For bedre å forstå de underliggende mekanismene til EFE og for å utforske terapeutiske strategier, ble det utviklet en dyremodell egnet for preklinisk testing. Dyremodellen tar hensyn til at EFE er en sykdom i det umodne hjertet og er forbundet med strømningsforstyrrelser, som støttet av kliniske observasjoner. Dermed er heterotopisk hjertetransplantasjon av nyfødte rottedonorhjerter grunnlaget for denne modellen.
Et nyfødt rottehjerte transplanteres inn i en ungdomsrottes mage og kobles til mottakerens infrarenale aorta og vena cava inferior. Mens perfusjon av koronararteriene bevarer levedyktigheten til donorhjertet, induserer strømningsstagnasjon i LV EFE-vekst i det svært umodne hjertet. Den underliggende mekanismen for EFE-dannelse er overgangen av endokardiale endotelceller til mesenkymale celler (EndMT), som er en godt beskrevet mekanisme for tidlig embryonal utvikling av ventiler og septa, men også den ledende årsaken til fibrose ved hjertesvikt. EFE-dannelse kan observeres makroskopisk i løpet av dager etter transplantasjon. Transabdominal ekkokardiografi brukes til å overvåke transplantatets levedyktighet, kontraktilitet og patensen til anastomosene. Etter eutanasi høstes EFE-vevet, og det viser de samme histopatologiske egenskapene som humant EFE-vev fra HLHS-pasienter.
Denne in vivo-modellen gjør det mulig å studere mekanismene for EFE-utvikling i hjertet og teste behandlingsalternativer for å forhindre denne patologiske vevsdannelsen og gir mulighet for en mer generalisert undersøkelse av EndMT-indusert fibrose.
Introduction
Endokardial fibroelastose (EFE), definert ved akkumulering av kollagen og elastiske fibre i subendokardialvevet, presenterer som et perleaktig eller ugjennomsiktig fortykket endokardium; EFE gjennomgår mest aktiv vekst i fosterperioden og tidlig barndom1. I en obduksjonsstudie var 70% av tilfellene med hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) assosiert med tilstedeværelsen av EFE2.
Celler som uttrykker markører for fibroblaster er den viktigste cellepopulasjonen i EFE, men disse cellene uttrykker også samtidig endokardiale endotelmarkører, noe som er en indikasjon på opprinnelsen til disse EFE-cellene. Vår gruppe har tidligere fastslått at den underliggende mekanismen for EFE-dannelse innebærer en fenotypisk forandring av endokardiale endotelceller til fibroblaster gjennom endotel-til-mesenkymal overgang (EndMT)3. EndMT kan detekteres ved hjelp av immunhistokjemisk dobbeltfarging for endotelmarkører som klynge av differensiering (CD) 31 eller vaskulær endotelial (VE)-cadherin (CD144) og fibroblastmarkører (f.eks. alfa-glatt muskelaktin, α-SMA). Videre har vi også tidligere etablert TGF-ß-banens regulatoriske rolle i denne prosessen med aktivering av transkripsjonsfaktorene SLUG, SNAIL og TWIST3.
EndMT er en fysiologisk prosess som oppstår under embryonal hjerteutvikling og fører til dannelse av septa og ventiler fra endokardiale puter4, men det forårsaker også organfibrose ved hjertesvikt, nyrefibrose eller kreft og spiller en nøkkelrolle i vaskulær aterosklerose 5,6,7,8. EndMT ved hjertefibrose reguleres hovedsakelig gjennom TGF-β banen, som vi og andre har rapportert 3,9. Ulike stimuli har blitt beskrevet for å indusere EndMT: betennelse 10, hypoksi11, mekaniske endringer 12 og strømningsforstyrrelser, inkludert endringer i den intrakavitære blodstrømmen 13, og EndMT kan også være en konsekvens av en genetisk sykdom 14.
Denne dyremodellen ble utviklet ved hjelp av nøkkelkomponentene i hjerte-EFE-utvikling, som er umodenhet og endringer i den intrakavitære blodstrømmen, spesielt strømningsstagnasjon. Umodenhet ble oppfylt ved å bruke nyfødte rottehjerter som donorer, siden nyfødte rotter er kjent for å være utviklingsmessig umodne umiddelbart etter fødselen. Heterotopisk hjertetransplantasjon tilbød tilbud om intrakavitær flowrestriksjon15.
Fra et klinisk synspunkt tillater denne dyremodellen bedre å undersøke effekten av EndMT på den voksende venstre ventrikkelen (LV). Vekstbegrensningen som pålegges foster- og nyfødthjertet gjennom EndMT-indusert EFE-dannelse16 utelukker pasienter med venstre ventrikkels utløpskanalobstruksjoner (LVOTO) som medfødt kritisk aortastenose og hypoplastisk venstre hjerte-syndrom (HLHS) fra kurativ anatomisk biventrikulær kirurgisk reparasjon17. Denne dyremodellen forenkler studiet av cellulære mekanismer og regulering av vevsdannelse gjennom EndMT og muliggjør testing av farmakologiske behandlingsalternativer 3,18.
Transabdominal ekkokardiografi brukes til å overvåke transplantatets levedyktighet, kontraktilitet og patensen til anastomosene. Etter eutanasi kan EFE-dannelse observeres makroskopisk innen 3 dager etter transplantasjon. EFE-vev viser de samme histopatologiske egenskapene som humant EFE-vev fra pasienter med LVOTO.
Derfor kan denne dyremodellen, selv om den er utviklet for pediatrisk bruk i spekteret av HLHS, brukes når man studerer ulike sykdommer basert på den molekylære mekanismen til EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrene ble utført i samsvar med National Research Council. 2011. Veileder for stell og bruk av forsøksdyr: åttende utgave. Dyreprotokollene ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Boston Children's Hospital.
Før operasjon blir alle operasjonsinstrumentene dampautoklavert, og modifisert Krebs-Henseleit-buffer, med en sluttkonsentrasjon på 22 mmol/L KCl, fremstilles som kardioplegisk løsning (tab 1). Oppløsningen filtersteriliseres og oppbevares ved 4 °C over natten. Et kirurgisk mikroskop (12,5x) er nødvendig for heterotopisk neonatal rotte hjertetransplantasjon prosedyre.
1. Forberedelse og anestesi
- Bruk hannrotter/hunnrotter fra Lewis med en vekt på ca. 150 g (5-6 ukers alder) som mottakere.
- For å starte, barberer du sjenerøst rottens mage med en barberhøvel.
- Sett rotta inn i et isofluran kammer, og slå på oksygenstrømmen ved 2 l/min med 2 % isofluran til dyret er riktig sedert, men fortsatt puster spontant. Injiser 45 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin intraperitonealt (IP), samt 300 E/kg heparin. Bekreft riktig bedøvelse med en tåklemmetest.
MERK: Overvåk nøye spontan pust og hjertefrekvens gjennom palpasjon av brystet for å sikre en stabil hemodynamisk status gjennom hele prosessen. - For intubasjon, plasser rotta på en skrå hylle (figur 1), fest fortennene med en snor og plasser hodet vendt mot kirurgen.
- Plasser lyset på utsiden av nakken på området av stemmebåndene, ta tak i tungen med to fingre, og skyv den litt oppover og til venstre for å gi optimal visjon for intubasjon. Bruk en 18 G, 2 i kanyle for en 100-150 g rotte. Fest intratrakealrøret med tape.
MERK: Kirurgiske loups med 3,5x forstørrelse anbefales for intubasjon. - Koble intubasjonskanylen til ventilatoren for små dyr, og juster innstillingene i henhold til produsentens instruksjoner basert på dyrestørrelsen.
MERK: Bruk følgende innstillinger for en 150 g rotte: volummodus; respirasjonsfrekvens, 55/min; tidalvolum, 1,3 ml 50 % I/E-forhold, men dette kan justeres etter behov. Sikre riktig bilateral og lik brystbevegelse, og administrer isofluran kontinuerlig med 0,5 %–2 % gjennom ventilatoren. - Plasser rotta på en varmepute (for å opprettholde normal kroppstemperatur) i liggende stilling med halen vendt mot kirurgen. Steriliser magen tre ganger med betadinoppløsning og 70% etanol vekselviserende. Administrer øye glidemiddel, og dekk rotta med en steril kirurgisk drapering, slik at magen blir avdekket.
2. Kirurgisk forberedelse og heterotopisk transplantasjon av nyfødtdonorhjerte hos mottakerrotte
- Utfør en midtlinje laparotomi ved hjelp av en 15 blad skalpell for huden snitt, og bruk saks for å åpne den fremre bukveggen, etterfulgt av stump eksponering av retroperitoneal abdominal aorta og dårligere vena cava (IVC) med bomull spiss applikatorer.
- Mobiliser tarmene (inkludert synkende kolon), og plasser dem mot høyre øvre kvadrant. Dekk tarmene med varmt, saltvann-gjennomvåt gasbind. Bruk retractors for å sikre optimal eksponering av IVC og abdominal aorta.
- Utfør stump disseksjon av infrarenal IVC og abdominal aorta opp mot bifurkaturen. Ligat alle infrarenale forgreningsarterier og vener (f.eks. Inferior mesenterisk arterie og lymfeknutearterier) med en 10-0 nylonsutur.
MERK: Det er stor variasjon i anatomien til disse sidegrenene. Overvåk aorta puls og hjertefrekvens visuelt når ingen annen hemodynamisk overvåking er tilgjengelig. Vurder riktig dybde av anestesi hvert 15. minutt gjennom en tåklemmetest. Konsentrasjonen av isofluran justeres tilsvarende. - Etter at donorhjertet er høstet fra en nyfødt rotte, lever det utskårne hjertet i sterile forhold i et kirurgisk basseng som inneholder Krebs-Henseleit buffer til det kirurgiske feltet. Skyll donorhjertet periodisk med iskald kardioplegisk løsning.
MERK: Når en annen kirurg er tilgjengelig, bør hjertet være forberedt samtidig, da en annen kirurg reduserer mottakerens totale anestesitid og iskemitiden til donorhjertet. Når en annen kirurg ikke er tilgjengelig, dekk mottakerens mage med varmt saltvann, og overvåke dyret under høstingsprosedyren. - Påfør fire små atraumatiske vaskulære klemmer til de distale og proksimale segmentene av infrarenal aorta og IVC. Om nødvendig, okkluder midlertidig et ugunstig nyrekar med en 7-0 silkesutur, og slipp suturen etter prosedyren. Plasser en 10-0 nylon sutur vertikalt på den fremre veggen av aorta for å lette aortotomi. Utfør en aortotomi med to små horisontale kutt (kileformet) med mikrosaks ved å trekke opp suturen litt.
MERK: For å fjerne eventuelle blodpropper anbefales rødme av aortalumen med heparinisert saltvann. - Plasser donorhjertet på venstre side (fra dyrets perspektiv) av aorta og sikre mottakerens infrarenale aorta og donorens stigende aorta ende-til-side klokken 12 og 6 posisjoner av aortotomi med suturer. Fortsett med den tredje og fjerde suturen klokken 3 og 9 stillinger, forsiktig snu hjertet over til høyre side av aorta etter den tredje suturen. Fullfør arteriell anastomose ved å legge til en til to suturer til hvert mellomrom.
MERK: Forsiktighet bør utvises for å unngå å berøre enten donorens stigende aorta eller mottakerens abdominal aorta med tang når du oppretter anastomosen for å unngå vevskader. - Roter rotta mot klokken, med hodet vendt mot kirurgens venstre hånd. Flytt donorens aorta til venstre side av abdominal aorta for å tillate optimalt syn på IVC.
- Utfør en venotomi på IVC, litt proksimal for aortaanastomosen, ved hjelp av et 11-blad for punktering og mikrosaks for tilstrekkelig størrelsesjustering i henhold til diameteren på donorens lungestamme. Skyll igjen det intrakavalale lumen med heparinisert saltvann.
- Start med venøs anastomose mellom mottakerens IVC og donorens lungestamme, som best oppnås ved å plassere avbrutte 11-0 nylonsuturer på bakveggen på fartøyet, starter klokka 12 og 6 (relatert til IVC), og plasser deretter en kontinuerlig 11-0 nylon sutur på frontveggen (fra klokken 6 mot klokken 12).
- Dekk anastomosene med små strimler av en absorberbar gelatinsvamp, og fjern mikrovaskulære klemmer som starter distalt. Bruk en bomullsspissapplikator for å komprimere svampene lett for å oppnå optimal hemostase.
- Observer transplantatets koronarbeholdere som fylles på tidspunktet for frigjøring av de distale mikrovaskulære klemmene, og sørg for at donorhjertet begynner å slå umiddelbart når den proksimale klemmen slippes ut.
MERK: Transplantatets levedyktighet kan skåres fra 0 til 4 intraoperativt i henhold til en modifisert Stanford-score19 for å bekrefte tilstrekkelig graftfunksjon. - Plasser tarmene tilbake i magen ved å sørge for ikke å forvrenge arteriell og venøs anastomose.
- Administrer meloksikam (1 mg/kg) og etiqa XR (0,65 mg/kg) subkutant mens dyret er fullt anestesert for å fastslå postoperativ analgesi. Lukk deretter bukveggen med en kontinuerlig 5-0 absorberbar vicrylsutur før du lukker huden med en 6-0 absorberbar vicrylsutur intrakutant.
MERK: Veiledning om vanlige feil og feilsøking er presentert i tabell 2.
3. Høsting av nyfødtdonorhjertet
- Plasser den nyfødte donorrotten i et kammer med isofluran (2 %) for sedasjon. Administrer ketamin (75 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg), samt heparin (300 E/kg) intraperitonealt.
- Bekreft dybden av anestesi ved tåklemme, og legg rotta i en liggende stilling med halen vendt mot deg. Steriliser hele brystkassen og bukveggen med betadin og 70% etanol tre ganger alternativt. Dekk rotta med et sterilt kirurgisk drap.
- Ved hjelp av et 12,5x kirurgisk mikroskop, fjern hele den fremre thoraxveggen ved å starte med et horisontalt snitt ved hjelp av en 15-blads skalpell på xyphoid etterfulgt av vertikale snitt lateralt opp til aksillene på begge sider med saks. Den fremre thoraxveggen kan da fjernes ved å fortsette med et annet horisontalt snitt rett under nakken.
- Dissekere IVC, høyre og venstre overlegne vena cavae og lungekar med saks, og deretter omringe og ligere alle fartøyene med en 7-0 silkesutur. Administrer 3 ml iskald, høykaliummodifisert Krebs-Henseleit-løsning til høyre atrium ved å punktere IVC med en 30 G nål og skyve membranen litt ned med tang.
- Klipp IVC, SVC, lungekar og aorta med saks. Transekter lungearteriene så langt som mulig og aorta distalt for brakiocephalic trunkus for å sikre riktig lengde ved hjelp av en 11 blad skalpell.
- Separer lungestammen og stigende aorta med mikrosaks, og skyll hjertet med iskald kardioplegisk løsning ved hjelp av en 3 ml sprøyte.
4. Restitusjon av mottaker og overvåkning av transplantat
- Etter operasjonen, gi rotta god tid til å våkne opp, noe som vanligvis skjer i et tidsvindu på 15 minutter, og la det komme seg på en varmepute.
MERK: Ingen antibiotika er nødvendig på grunn av svært lav risiko for infeksjon og for ikke å kompromittere den eksperimentelle modellen, og ingen begrensning til mat eller vann brukes. - Etter transplantasjonen overvåkes transplantatfunksjonen ved palpasjon av det transplanterte hjertet daglig, men tenk på at dette noen ganger kan være vanskelig å vurdere på grunn av tarmoverlegg.
MERK: Abdominal ekkokardiografi kan mer nøyaktig måle transplantatets levedyktighet. For ekkokardiografi, sedere rotta litt med isofluran (1-2%) inhalert gjennom en nesekegle, og plasser den på en varmepute. Ekkokardiografi utføres vanligvis på postoperativ dag (POD) 1, POD 7 og POD 14. For å kunne vurdere hjertefrekvens og kontraktilitet kan man enkelt få utsikt over langakse og kortakse (figur 2A, B). For å evaluere anastomosene bruker du dopplerekkokardiografi (figur 3A) og bekrefter dannelsen av EFE-vev sett som et ekkolyst endokardialt lag i venstre ventrikkelhule (figur 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Graft levedyktighet og juling
I dette arbeidet ble transplantatets levedyktighet visuelt vurdert etter at alle klemmene var fjernet, og en omtrentlig reperfusjonstid på 10-15 min ble tillatt med åpen abdomen for observasjon av transplantatet. Det samme skåringssystemet for objektivt verifisering av transplantatets levedyktighet ble brukt til visuell vurdering ved slutten av operasjonen og for ekkokardiografien på POD 1, POD 7 og POD 14.
0 = ingen organfunksjon; 1 = (hvile) organfunksjon, bare minimal sammentrekning; 2 = svak eller delvis organfunksjon; 3 = kontraktil hastighet eller intensitet redusert, men homogen organfunksjon; 4 = optimal atrium og ventrikkelkontraksjon (120-160 slag/min). En poengsum på 3 eller 4 ble vurdert som en suksess. Palpatorisk evaluering av abdominaldonortransplantatet ble brukt for å overvåke transplantatets levedyktighet mellom tidspunktene for ekkokardiografisk vurdering.
Suksessrate for dødelighet og levedyktighet for transplantat
Prosedyren ble introdusert for et nytt kirurgisk team ved studiesenteret mellom oktober 2022 og desember 2022, og det ble utført 19 neonatale heterotopiske rottehjertetransplantasjoner ved studiesenteret i denne perioden. Den umiddelbare operative overlevelsesraten var 79 %, og suksessraten for transplantatets levedyktighet (som viser et levedyktig, bankende donorhjerte) var 84 %. Prosedyrekarakteristikkene er presentert i tabell 3.
Blant de 12 overlevende dyrene krevde 2 eutanasi før 2 ukers studieendepunkt, 1 på grunn av ileus (n = 1), og den andre på grunn av smertestillende smertestillende medikamenter (n = 1), og 2 ble avlivet med design 1 uke etter operasjonen.
Hos tre rotter økte den påførte modifiserte Stanford-poengsummen fra 3 til 4 mellom umiddelbar postoperativ visuell gradering og ekkokardiografisk evaluering på POD 1. Blant de åtte overlevende rottene ved 14-dagers endepunktet var de modifiserte Stanford-poengene ved ekkokardiografi fire for syv dyr og tre for ett dyr. Den vanligste dødsårsaken i denne serien var hemodynamisk svikt på grunn av stort blodtap som følge av det svært umodne hjertet og dermed skjøre donorkar for anastomose eller lang anestesitid.
Histologisk vurdering av EFE-vev
Etter CO2 -eutanasi av mottakerrotten ble det utført relaparotomi under steril preparering. Donortransplantatet ble skåret ut og umiddelbart lagt i en fysiologisk saltvannsoppløsning på is for videre behandling. En horisontal skive ble resektert på midtventrikkelnivå i høyre og venstre ventrikkel, plassert i optimalt skjæretemperatur (OCT) innebyggingsmedium og frosset i flytende nitrogen (figur 4A). Alt annet vev ble snap-frosset med flytende nitrogen og lagret i en -80 ° C fryser for videre analyse. Bildene ble tatt ved hjelp av et invertert mikroskop (figur 4B-D).
Immunhistokjemisk farging som gullstandard for å identifisere EndMT ble utført med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå), VE-Cadherin som endotelmarkør (rød) og α-SMA som fibroblastmarkør (grønn). Fosforylerte SMAD-proteiner og transkripsjonsfaktoren SLUG/SNAIL ble også farget i EFE-vevet (figur 5A-E)3,20.
Figur 1: Skrå hylle for intubasjon. Rotta er plassert på ryggen, med fortennene sikret med en snor og hodet vendt mot kirurgen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekkokardiografisk langaksebilde av LV . (A) Innfødt rottehjerte som indikerer normal fylling under diastolen. (B) Donortransplantat med strømningsstagnasjon i LV. Redusert volumbelastning under diastolen. Forkortelser: LV = venstre ventrikkel; MV = mitralventil; LVOT = venstre ventrikulær utløpskanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Anastomoser og EFE-evaluering. (A) Ekkokardiografisk fargedopplerstudie som indikerer patente arterielle (røde piler) og venøse (blå pil) anastomoser. (B,C): Ekkolys endokardial overflate i LV-hulen som indikerer EFE (hvite piler). Forkortelser: LV = venstre ventrikkel; EFE = endokardial fibroelastose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Makroskopisk og mikroskopisk vevsevaluering . (A) Midtventrikulært tverrsnitt gjennom LV og RV. De hvite pilene peker mot EFE-vevet. (B) Hematoksylin-eosin, (C) Massons trikrom (MTS), og (D) Elastin van Gieson (EVG) farging. Den store forstørrelsen indikerer at EFE-vevet (svarte piler) inneholder store mengder organisert kollagen (blått i MTS) og elastinfibre (svart i EVG). Forkortelser: LV = venstre ventrikkel; RV = høyre ventrikkel; EFE = endokardial fibroelastose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Sammenligning av histologiske og immunhistologiske bilder. (A) Farging av hematoksylin-eosin. (VG Nett) Immunhistokjemisk farging; EFE-vev dobbeltfarget for (B,C) VE-Cadherin og α-SMA, (D) CD31 og fosfo-SMAD2/SMAD3 (samlokalisert med kjernene farget med DAPI i blått), og (E) CD31 og SLUG/SNAIL (samlokalisert med kjernene farget med DAPI i blått), indikativ for EndMT, som vist ved de hvite pilene. Forkortelser: LV = venstre ventrikkel; EFE = endokardial fibroelastose; EndMT = endotel-til-mesenkymal overgang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 1 liter sterilisert, destillert vann | |
| NaCl | 118 mmol/l |
| KCl | 22 mmol/l |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| MgSO4 | 1,2 mmol/l |
| NaHCO3 | 25 mmol/l |
| Glukose | 11 mmol/l |
| CaCl2 | 2,5 mmol/l |
Tabell 1: Sammensetning av den modifiserte Krebs-Henseleit-bufferen. Kardioplegisk oppløsning med høyt kaliumnivå (22 mmol/l KCl) fremstilles, filtersteriliseres og oppbevares ved 4 °C over natten.
| Vanlige feil og feilsøking | ||
| Transplantatet begynner ikke å slå/koronararteriene fylles ikke etter at klemmene er sluppet | Sjekk for trombedannelse ved arteriell anastomose | |
| Sjekk for iskemitid (= total arrestasjonstid) (bør ikke overstige 100 minutter) | ||
| Lang oppvåkningstid eller rotte våkner ikke etter operasjonen | Overvåk pulsstyrke og frekvens under kirurgi og reduser innånding av isofluran hvis hemodynamikken er svak | |
| Umiddelbar postoperativ livid eller nekrotisk tarm er mistenkelig for redusert intraoperativ hemodynamikk, ofte på grunn av lang anestesitid | ||
| Svak hemodynamikk rett etter laparotomi | Juster gjennomstrømningen av isofluran ved anestesi | |
| Vurder intubasjon og riktig brystbevegelse: ensidig intubasjon, pneumothorax, blokkert endotrakeal lumen er vanlige feil i begynnelsen. | ||
| Rotte våkner, men dør i løpet av de første 24 timene | Omfattende blodtap under operasjonen | |
| Hvis økt mengde blod er funnet ved obduksjon i abdomen, er det mest sannsynlig på grunn av svikt i anastomosen | ||
Tabell 2: Vanlige feil og feilsøking. Grundig overvåking og revurdering av mislykkede prosedyrer er avgjørende for å oppnå høy overlevelse i denne modellen.
| Mottaker rottevekt i gram, median [IQR] | 150 [50] |
| Donoralder i dager, median [IQR] | 3 [1] |
| Donorvekt i gram, median [IQR] | 9 [2] |
| Tid for graftiskemi i minutter, median [IQR] | 100 [25] |
| Postoperativ suksessrate, n | 16/19 (=84 %) |
Tabell 3: Prosedyrekarakteristika. Mottaker- og donorvalg, graft iskemitid og overlevelsesrate. Forkortelse: IQR = interkvartilt område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne dyremodellen for heterotopisk transplantasjon av et neonatalt donorrottehjerte i mottakerens mage skaper muligheten til å studere EndMT-avledet fibrose gjennom detaljert histologisk vevsevaluering, identifisere regulatoriske signalveier og teste behandlingsalternativer. Siden EndMT er den underliggende mekanismen for fibrotiske sykdommer i hjertet, har denne modellen stor verdi innen pediatrisk hjertekirurgi og utover. I denne modellen kan mange faktorer påvirke utfallet av prosedyren negativt. Dermed er riktig håndtering av det svært skjøre vevet på grunn av donorhjertets umodenhet, riktig dyrehåndtering under anestesi og mikrokirurgiske ferdigheter på høyt nivå grunnleggende krav for suksessen til denne modellen. Et optimalt teknisk oppsett, inkludert et kirurgisk mikroskop, smådyrventilator og mikrokirurgiske instrumenter, bør brukes når du utfører disse forsøkene. Selv om det ikke er viktig, kan grunnleggende overvåking av hjertefrekvens eller kroppstemperatur være gunstig, spesielt for uerfarne kirurger, for å overvåke hemodynamikken og dybden av anestesi.
Viktige kirurgiske aspekter å huske på inkluderer umodenhet av neonatale donorhjerter, noe som gjør vevet svært skjørt og etterlater den stigende aorta og lungestammen sårbar for tårer. Enhver håndtering bør derfor utføres med stor forsiktighet. På grunn av de små karene som brukes til anastomose, anbefales det å utføre arteriell anastomose med avbrutte masker og intermitterende spyling av anastomosestedet med heparinisert saltvann, noe som bidrar til å unngå trombusdannelse. Seleksjon av passende aldrende nyfødte rotter er nødvendig for å overvinne problemet med å bruke hjerter som er for umodne og derfor svært utsatt for anastomosebrudd. På den annen side, etter en viss alder på ca. 7 dager, kan EndMT ikke lenger vises reproduserbart i denne dyremodellen15.
EndMT har blitt identifisert som den sentrale mekanismen for ulike typer hjertefibrose og aterosklerose, men forskningen har blitt hemmet på grunn av mangel på in vivo modeller8. Hovedutviklingen innen EndMT-forskning er begrenset til cellekulturmodeller, som har iboende begrensninger 3,8,9. Videre er studier på endokardiale endotelceller enda mer begrenset. Alternativt brukes koronarendotelceller ofte som substitutt, da de er rapportert å stamme delvis fra endokardceller21. Derfor kan denne dyremodellen brukes ikke bare for hjertefibrose, men for å studere viktige patomekanismer av strømningsindusert EndMT ved aterosklerose. For medfødt hjertesykdom har vi vist evnen til å reprodusere overgangen fra friskt endokard til EFE-vev gjennom EndMT i vår rottemodell, med EFE som strukturelt ligner humant EFE-vev. Det er noen kontroverser angående den cellulære opprinnelsen til mesenkymale celler i EFE-vevet. Clark et al.22 rapporterte at epikardceller bidrar til EFE, men våre data indikerte at flertallet av EFE-vevet er avledet gjennom endokardiale endotelceller som gjennomgår EndMT3. Eksperimenter på enkeltcellenivå pågår for tiden for å fastslå den cellulære opprinnelsen til EFE-vev.
Gjennom denne in vivo-modellen kan regulatoriske veier for EndMT studeres. En ubalanse, spesielt en økning i TGF-ß-banen og nedsatt benmorfogenetisk protein (BMP) signalering, har vist seg å spille en viktig rolle i endokardiale celler som uttrykker transkripsjonsfaktorer som regulerer EndMT. Alternativt har Jagged/NOTCH-signalering og Wnt/ß-Catenin også blitt rapportert å indusere EndMT 3,23. TGF-ß-banen induserer aktiveringen av transkripsjonsfaktorer som SLUG, SNAIL og TWIST via SMAD-proteiner, og regulerer dermed EndMT20,24. I denne dyremodellen har vi vært i stand til å rekapitulere disse mekanismene, som har blitt bekreftet ved immunhistokjemisk farging.
De stimulerende faktorene for EndMT-indusert fibrose i denne dyremodellen er umodenhet og flytstagnasjon, mens andre modeller er designet for å indusere EndMT gjennom genetiske modifikasjoner, hypertensjon eller diettbegrensninger 9,25. Sammenlignet med andre arter er nyfødte rotter svært umodne ved fødselen, og derfor er de spesielt utsatt for å gjennomgå EndMT.
Vi og andre har brukt mus til å bedre studere opprinnelsen til EFE via transgen avstamningssporing, men flere begrensninger må diskuteres 3,22. For det første, på grunn av modellens kompleksitet, er dødeligheten høyere hos mus sammenlignet med rotter, og presentasjonen av EFE er mer heterogen; Derfor er RAT-modellen mer pålitelig og reproduserbar. Ekkokardiografiske tiltak er avgjørende for å vurdere transplantatfunksjonen gjennom studieperioden, og vi har vist at med disse målene, samt vurdering av anastomosenes pulsatilitet og patency, kan også transplantatfunksjon og kontraktilitet studeres. Med mer erfaring kan enda mer avanserte analyser av det transplanterte hjertet, som tøyningsanalyse av LV, utføres i rottemodeller. Det er foreløpig uklart om samme patofysiologiske tilstand kan induseres hos andre større dyr enn gnagere, og dette krever ytterligere undersøkelser.
Avslutningsvis etterligner denne pediatriske dyremodellen den menneskelige sykdommen til EndMT og kan være nyttig for å bestemme reguleringen av EndMT og for å studere farmakologiske inngrep for å hemme denne patologiske prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) og Single Ventricle Expansion Fund (til I.F.) og et Marietta Blau-stipend fra OeAD-GmbH fra midler fra det østerrikske føderale departementet for utdanning, vitenskap og forskning BMBWFC (til GG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
