Summary
En optisk densitetsbaserad mikroplattmetod beskrivs för att kvantifiera långsiktig bakterietillväxt i närvaro av bakteriofager, lämpliga för aktinomyceter och andra långsamt växande bakterier. Denna metod inkluderar modifieringar för att minska avdunstning och lockkondensation och R-kod för att beräkna virusinfektionsmått, inklusive arean under kurvan, tillväxtmaximum och relativ virulens.
Abstract
Bakteriofager är en viktig del av naturliga miljöer, och de har en kraftfull förmåga att forma bakteriepopulationer. För att förstå hur enskilda fager interagerar med långsamt växande bakterievärdar som aktinomyceter behövs en enkel och pålitlig metod för att kvantifiera långsiktig bakterietillväxt i närvaro av fager. Spektrofotometriska mikroplattläsare möjliggör upprepade mätningar med hög genomströmning, men inkubation av en liten volym under en längre tid kan ge tekniska utmaningar. Denna procedur anpassar en standard 96-brunns mikroplatta för att möjliggöra samodling av fager och bakterier utan delprovtagning i 96 timmar, med bakterietillväxten registrerad var 8: e timme med spektrofotometriska absorbansvärden. Dessa optiska densitetsvärden analyseras med R för att ge infektionsmått, inklusive procentuell tillväxthämning, relativ virulens och Stacy-Ceballos-indexet. Metoderna som beskrivs här ger ett effektivt sätt att genomföra och analysera experiment med mikroplattans tillväxtkurva med förlängd varaktighet och inkluderar modifieringar för att minska avdunstning och lockkondensation. Dessa protokoll underlättar mikroplattbaserade analyser av interaktioner mellan långsamt växande bakterievärdar och deras bakteriofager.
Introduction
Bakteriofager eller fager är virus som infekterar bakterier. De är de mest talrika biologiska enheterna på planeten1, och det är allmänt accepterat att bakteriofager påverkar bakteriell utveckling och ekosystemprocesser 2,3,4. Flera metoder finns för att beskriva, mäta och analysera bakteriofagvärdområde 8 och infektionsdynamik5,6, inklusive agarbaserade metoder såsom dubbelskiktagarmetoden7 och optiska densitetsbaserade mikroplattmetoder8,9,10,11,12. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar. På grund av deras effektivitet är pläteringstester med dubbelskiktagarmetoden "guldstandarden" för värdområdesanalyser, men denna metod är tids- och arbetsintensiv9. Snabba mikroplattmetoder, som returnerar resultat inom 24 timmar eller mindre, ger utmärkta resultat för snabbväxande bakterievärdar som Escherichia coli 9,10,11,12 men är för korta för att visa bakteriofaginfektionsprogression i långsammare växande bakterievärdar som aktinomyceter7,13,14,15.
En optisk densitetsbaserad mikroplattanalys utformad för snabbväxande bakterier kan inte köras under de flera dagar som krävs för att karakterisera infektionsdynamiken i en långsamt växande värdbakterie utan att avdunstning inträffar och ger artificiellt höga bakterietätheter. För att erhålla jämförbara data med hög genomströmning om bakteriofaginfektionsdynamik för långsamt växande bakteriearter krävs således specialiserade tekniker anpassade för dessa bakterier.
Mikroplattmetoden som presenteras här minskar avdunstningen, vilket gör att långsamt växande bakterier kan samodlas med en under en förlängd 96-timmarsperiod och möjliggöra undersökningar av faginfektionsdynamik och värdområde. Denna metod visar också Stacy-Ceballos index16, ett optiskt densitetsbaserat mått som möjliggör virulensjämförelser mellan olika värdvirussystem.
Protocol
Även om detta protokoll är skrivet för Gordonia terrae, har det också framgångsrikt använts för Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta och Gordonia westfalica.
1. Beredning av bakterier
- Använd god mikrobiologisk praxis17 i ett biosäkerhetsskåp för att inokulera en enda koloni av Gordonia terrae CAG3 i en 1 L steril förbryllad kolv med 200 ml peptonjästkalciumbuljong18 (PYCa) innehållande 0,01 mg/ml cykloheximid (se materialtabellen).
- Inkubera kolven vid 30 °C genom skakning vid 250 rpm tills kulturen är mättad eller i 3 dagar7.
- Späd den mättade G. terrae-kulturen seriellt i PYCa-buljong och sprid plattan 100 μL var och en av 10-4, 10-5 och 10-6 utspädningarna på PYCa-plattorna 19,20. Kyl den outspädda mättade kulturen vid 4 °C.
- Inkubera de spridda plattorna upp och ned i 3 dagar vid 30 °C.
- Efter inkubation, identifiera en "räknebar platta", en platta med 20-200 kolonier. Räkna antalet kolonier på plattan och beräkna de kolonibildande enheterna per milliliter (cfu/ml)19,20.
- Späd den mättade kulturen med PYCa-buljong till 4,0 x 106 cfu / ml bakterier.
2. Fagberedning
OBS: De representativa resultaten som rapporterades erhölls med Gordonia-fagen DelRio21, en tempererad bakteriofag isolerad på G. terrae. Dessa metoder har också framgångsrikt använts med andra Gordonia-fager .
- Börja med en isolerad bakteriofag, späd seriellt fagprovet i fagbuffert7 till en 1 x 10-8 utspädning. Utför en dubbelskikts agarfagtiteranalys7 genom att infektera 0,3 ml av den mättade G. terrae-kulturen med 10 μL av varje fagutspädning. Efter en 5-10 min rumstemperaturinkubation, kombinera bakteriefagblandningen med 3 ml PYCa-toppagar och häll på PYCa-agarplattorna.
- Inkubera plattorna upp och ned vid 30 °C i 3 dagar eller tills plack bildar7.
- Efter inkubation, identifiera en "räknebar platta", en platta med 20-200 plack. Räkna antalet plack på plattan och beräkna plackbildande enheter per milliliter (pfu / ml)7.
3. Förberedelse av mikroplatta
OBS: Flatbottnade 96-brunns mikroplattor (se materialtabellen) bör användas för denna metod. All plåtberedning och lastning måste utföras i ett biosäkerhetsskåp, och god mikrobiologisk praxis17bör användas.
- Bered den imfria lockbeläggningslösningen genom att kombinera 100 μL Triton-X 100, 40 ml 100% isopropanol och 160 ml avjoniserat vatten22. Rör om för att blanda och förvara vid rumstemperatur.
- I ett biosäkerhetsskåp, tillsätt 6 ml lockbeläggningslösning på insidan av ett sterilt 96-brunns mikroplattlock, håll locket i kanterna och rotera det för att säkerställa att det täcks av lösningen. Låt lösningen sitta på locket i 20 sekunder, häll sedan av lösningen och vänd locket på en autoklaverad pappershandduk i en vinkel tills locket är helt torrt, vilket vanligtvis tar 35-45 minuter. Var noga med att hålla locket i kanterna.
- Förbered 20 ml 0,1% agaros i vatten för varje 96-brunns mikroplatta, mikrovågsugn för att smälta agarosen.
- När agarosen har svalnat till 50–60 °C pipett 100 μl av 0,1 % agaros i alla utrymmen mellan plattans brunnar och 200 μl agaros i brunnarna i rad A och rad H och kolumn 1, kolumn 2, kolumn 11 och kolumn 1223 (figur 1).
4. Ladda plattan med bakterier och
OBS: All plåtberedning och laddning måste slutföras i ett biosäkerhetsskåp, och god mikrobiologisk praxis17 bör användas.
- Plattan med 96 brunnar kommer att innehålla 75 μL 2,0 x 106 cfu/ml bakterier i varje brunn9. Späd bakteriekulturen 4,0 x 10 6 cfu / ml 1: 1 med 2x PYCa-buljong till 2,0 x 106 cfu / ml. Förbered 5 ml per 96-brunnsplatta.
- Späd faglysatet med fagbuffert7 för att göra 1 ml vardera av 2,0 x 106 pfu / ml, 2,0 x 105 pfu / ml och 2,0 x 104 pfu / ml koncentrationer. Detta möjliggör en multiplicitet av infektion (MOI) på 1, 0,1 och 0,01 inom mikroplattan9.
- För att ladda mikroplattan, ta en platta som beretts med antidimlösning och agaros och pipettera 75 μL av 2,0 x 106 cfu / ml bakterier i kolumnerna 3-10, enligt figur 1.
- Till kolumn 3 och kolumn 4, tillsätt 75 μl steril fagbuffert till varje brunn för att fungera som en positiv kontroll utan, enligt figur 1, och pipettera upp och ner för att blanda efter varje tillsats. Tillsätt 75 μl av fagen 2,0 x 10 6 pfu/ml till kolumn 5 och kolumn6 , 75 μl av fagen 2,0 x 105 pfu/ml till kolumn 7 och kolumn 8 och 75 μl av fagen 2,0 x 104 pfu/ml till kolumn 9 och kolumn 10, pipettera upp och ner för att blanda efter varje tillsats.
- Tejpa båda kortsidorna av plattan med 0,5 i märkningstejp för att delvis täta plattan samtidigt som gasutbyte tillåts.
5. Inkubations- och absorbansmätning
- När plattorna är laddade med bakterier och, placera dem på en mikroplattskakare vid 250 rpm och inkubera vid 30 °C.
- Inkubera plattorna i 96 timmar med en optisk densitetsmätning vid 600 nm på en mikroplattläsare var 8:e timme med början vid timme 16. Sätt tillbaka plattorna i skakapparaten mellan mätningarna.
OBS: Mätperioder på 4, h 6 h, 8 h och 12 h bedömdes, med början vid timme 0, och det bestämdes att en provtagningsperiod på 8 timmar som började vid 16 timmar efter infektion bäst fångade Gordonia-faginteraktionerna. - Övervaka locket för kondens under hela experimentet. Om kondens observeras, byt ut locket mot ett annat lock som är belagt enligt steg 3.2.
- Generera kontroll- och infekterade tillväxtkurvor enligt protokollavsnitt 6.
6. Analys av data
- Använd ett kalkylprogram för att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för varje fagutspädning, enligt kalkylbladslayouten i Stacy-Ceballos-Index GitHub-arkivet (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- Skapa kontroll- och infekterade tillväxtkurvor och beräkna infektionsmått med R (se materialtabellen) med paketen DescTools 24, dplyr 25, ggplot226 och readxl27 och följ R-skriptet i Stacy-Ceballos-Index GitHub-lagringsplatsen (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- AUCcon är arean under den oinfekterade kontrollkurvan, medan AUCinf är arean under den infekterade kurvan16. Beräkna AUC och beräkna sedan procentuell tillväxthämning baserat på arean under kurvvärdena, PIAUC16, med hjälp av följande ekvation:
(1 - [AUCinf/AUCcon]) × 100 - De streckade horisontella linjerna på varje kurva visar topptillväxten, med den oinfekterade tillväxttoppen märkt N asymptote (con) och den infekterade tillväxttoppen märkt Nasymptote (inf). IdentifieraN-asymptotvärdena och beräkna sedan procentuell tillväxthämning baserat på dessa topptillväxtvärden, PImax16, med hjälp av följande ekvation:
(1 - [N asymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100 - Beräkna Stacy-Ceballos-indexet, ISC16, från PIAUC och PImax-värdena enligt följande:
(PIAUC ×PI max) 0.5
Beräkna relativ virulens genom att integrera Stacy-Ceballos index över tid16.
- AUCcon är arean under den oinfekterade kontrollkurvan, medan AUCinf är arean under den infekterade kurvan16. Beräkna AUC och beräkna sedan procentuell tillväxthämning baserat på arean under kurvvärdena, PIAUC16, med hjälp av följande ekvation:
Representative Results
Ett experiment är framgångsrikt om den resulterande tillväxtkurvan visar en ökning av den positiva kontrollbakteriepopulationen över tid utan plötslig fluktuation i absorbans. Exempel på ett lyckat experiment vid en MOI på 1 med och utan produktiv faginfektion visas i figur 2 respektive figur 3. En produktiv infektion vid en MOI på 0,01 representeras i figur 4. Det positiva kontrolltillväxtmönstret (grön kurva) som ses i alla tre figurerna indikerar att bakterierna växer, de klumpar sig inte under tillväxten och inga föroreningar är närvarande. Klumpning och kontaminering indikeras av ovanligt hög absorbans vid en enda tidpunkt. Standardavvikelser ökar vanligtvis under ett experiments tidsförlopp; En drastisk ökning eller standardavvikelser som överlappar mellan kontrollkurvorna och infekterade kurvor kan dock tyda på kontaminering eller klumpbildning i en eller flera brunnar.
Tillväxtkurvan som visar en produktiv faginfektion, representerad av figur 2, visar minskad bakteriell absorbans över tid i brunnar med fagen tillsatt. Denna minskning av bakterietätheten kommer inte att ses om bakterien ligger utanför fagens värdområde, som visas i figur 3.
Infektionsmått visas för alla representativa experiment, med en relativt stor I SC för de produktiva infektionerna i figur 2 och figur 4 och en mycket liten ISC i figur 3 för fagen som inte effektivt infekterade värdbakterien.
Figur 1: Mikroplattans layout. De grå områdena är fyllda med 0,1% agaros. Blindbrunnarna i kolumn 3 och kolumn 4 är positiva kontrollbrunnar utan som endast innehåller fagbuffert och 2,0 x 106 cfu/ml bakterier. De prickade brunnarna innehåller och 2,0 x 106 cfu / ml bakterier; De stora punkterna i kolumn 5 och kolumn 6 indikerar en MOI på 1 med 2,0 x 106 pfu/ml. De medelstora punkterna i kolumn 7 och kolumn 8 anger en MOI på 0,1 med 2,0 x 105 pfu/ml. och de små punkterna i kolumn 9 och kolumn 10 indikerar en MOI på 0,01 med 2,0 x 104 pfu / ml. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ett lyckat tillväxtkurvexperiment med en vid en MOI på 1 som produktivt infekterar värdbakterien. De genomsnittliga absorbansvärdena (± standardavvikelse) visas för oinfekterade bakterier (grön) och bakterier med fagen tillsatt (blå). Förkortningar: AUC = arean under kurvan; PIAUC = procentuell tillväxthämning beräknad från arean under kurvan; Nasymptot = topptillväxtvärde; PImax = procentuell tillväxthämning beräknad utifrån topptillväxtvärdena; ISC = Stacy-Ceballos index. Denna graf representerar den tempererade Gordonia-fagen DelRio som infekterar G. terrae, bakterien den isolerades på. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ett lyckat tillväxtkurvexperiment med en vid en MOI på 1 som inte effektivt infekterar värdbakterien. De genomsnittliga absorbansvärdena (± standardavvikelse) visas för oinfekterade bakterier (grön) och bakterier med fagen tillsatt (blå). Förkortningar: AUC = arean under kurvan; PIAUC = procentuell tillväxthämning beräknad från arean under kurvan; Nasymptot = topptillväxtvärde; PImax = procentuell tillväxthämning beräknad utifrån topptillväxtvärdena; ISC = Stacy-Ceballos index. Detta diagram representerar G. rubripertincta-infektion med DelRio. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ett lyckat tillväxtkurvexperiment med en vid en MOI på 0,01. De genomsnittliga absorbansvärdena (± standardavvikelse) visas för oinfekterade bakterier (grön) och bakterier med fagen tillsatt (blå). Förkortningar: AUC = arean under kurvan; PIAUC = procentuell tillväxthämning beräknad från arean under kurvan; Nasymptot = topptillväxtvärde; PImax = procentuell tillväxthämning beräknad utifrån topptillväxtvärdena; ISC = Stacy-Ceballos index. Denna graf representerar G. terrae infektion av DelRio. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Denna optiska densitetsbaserade mikroplattmetod möjliggör undersökning av bakteriofagvärdområde och infektionsdynamik11 och visar användbarheten av Stacy-Ceballos index16 som ett mått på bakteriofagvirulens. Även om denna metod kan användas med vilket bakteriofagvärdsystem som helst, utformades den speciellt för att anpassa snabba mikroplatttillväxtanalyser 9,10,11 för användning med långsammare växande bakterier såsom aktinomyceter. Snabba mikroplattanalyser kan inte användas för långsamt växande bakterier utan modifieringar för att hantera avdunstning och lockkondensation. Denna metod beskriver dessa nödvändiga modifieringar och demonstrerar för första gången användningen av Stacy-Ceballos-indexet och relaterade mätvärden16 för att beskriva bakteriofaginfektion.
Avdunstning kan vara en betydande utmaning i flerdagars 96-brunns platttillväxtkurvanalyser; Denna metod löser det problemet genom att lägga till agaros till gränsbrunnarna och utrymmena mellan brunnarna. Agarosmarginalen, i kombination med imskyddslockets behandling22, ger den nödvändiga fuktigheten i mikroplattan och möjliggör tillförlitliga optiska densitetsmätningar. Utan den extra fuktigheten sker betydande kanteffektavdunstning23 under den långa inkubationsperiod som krävs, vilket leder till artificiellt höga optiska densitetsavläsningar. Anti-dimma lockbehandling är en nödvändig modifiering eftersom lockkondensation också artificiellt kan höja de optiska densitetsvärdena. Att skaka plattorna under inkubationsperioden är en rekommenderad modifiering, eftersom aktinomycetebakterier kan klumpa sig under tillväxt, vilket ger artificiellt höga optiska densitetsvärden och effektivt minskar infektionsmångfalden.
Förhållandet mellan bakterier och i experiment som karakteriserar infektionsdynamik är kritiskt, eftersom det måste finnas tillräckligt med för att visa en infektionseffekt men inte så många att värdbakteriepopulationen omedelbart kraschar9 eller frekvensen av lysogeni ökar dramatiskt28. I denna metod var det förhållande som befanns vara mest effektivt för att erhålla konsekventa resultat en MOI på 1, men användbara resultat erhölls också med MOI på 0,1 och 0,01. Vid implementering av denna metod rekommenderas att välja en koncentration av bakterier och testa flera fagkoncentrationer i MOI-intervallet 0,01-1 9,10,11.
Denna teknik som beskrivs här gör det möjligt att bedöma bakteriofag-värdinteraktioner för långsamt växande bakterier i mikroplattanalyser med hög kapacitet snarare än med delprovtagning från en större odlingskolv vid varje mätintervall29. Vidare, genom att visa hur mikroplatttillväxtanalyser 9,10,11 kan anpassas, ökar denna teknik användbarheten av andra mikroplattbaserade bakteriofaganalyser för långsammare växande bakterier, inklusive fagkarakterisering5,6,12 och evolutionsstudier 30,31. Slutligen demonstrerar denna metod användningen av Stacy-Ceballos index16 för att beskriva bakteriofaginfektion. Detta mått utvecklades ursprungligen med data från ett arkealt virusmodellsystem och beräknas från optiska densitetsvärden, vilket ger det utbredd användbarhet över olika virussystem.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett NSF DBI Biology Integration Institute (BII) bidrag (pris nr 2119968; PI-Ceballos) och av Arkansas INBRE-programmet, med bidrag från National Institute of General Medical Sciences, (NIGMS), P20 GM103429 från National Institutes of Health. Författarna uppskattar också stödet från Patterson Summer Undergraduate Research Program vid Ouachita Baptist University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
| Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
| Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
| Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
| Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
| Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
|
| Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
| Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
|
| R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
| Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |
References
- Mushegian, A. R. Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer. Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).
- Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. Interactions between bacterial and phage communities in natural environments. Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).
- Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. Phage life cycles behind bacterial biodiversity. Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).
- Weitz, J. S., et al.
- Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. High-throughput analysis of growth differences among phage strains. Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).
- Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence. PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).
- Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home (2012).
- Martinez-Soto, C. E., et al. PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods. Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).
- Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach. PLoS One. 14 (5), e0216292 (2019).
- Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence. Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).
- Sørensen, P. E., et al. Classification of in vitro phage-host population growth dynamics. Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).
- Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity. Biochemical Engineering Journal. 161, 107652 (2020).
- Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).
- Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).
- Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro. BMC Research Notes. 12 (1), 519 (2019).
- Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough. Journal of General Virology. 102 (1), 001515 (2021).
- Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).
- Van Alst, A. J., LeVeque, R. M., Martin, N., DiRita, V. J. Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units (2023).
- Wise, K. Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology. , Available from: https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf (2006).
- Mathes, H. N., et al. Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas. Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323 (2023).
- Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers. PLoS One. 16 (1), 0245205 (2021).
- Evoluted New Media. Beating the edge effect. Laboratory News. , Available from: http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect (2011).
- Signorell, A. DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=DescTools (2023).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K., Vaughan, D. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2023).
- Wickham, H., et al. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2 (2023).
- Wickham, H., Bryan, J. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=readxl (2023).
- Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118 (2021).
- Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice. Communications Biology. 5, 48 (2022).
- Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol. Viruses. 11 (3), 241 (2019).
- Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli. PeerJ. 4, e2060 (2013).
