במאמר זה אנו מתארים מספר פרוטוקולים המכוונים להערכה משולבת של Gracilaria gracilis: קציר מיני בר, גידול פנימי ומיצוי של מרכיבים ביו-אקטיביים. ההשפעות נוגדות החמצון, האנטי-מיקרוביאליות והציטוטוקסיות של התמציות נבדקות, יחד עם הערכה תזונתית ויציבותית של מזון מועשר בביומסה ופיגמנטים של אצות שלמות.
העניין באצות ים כחומר גלם שופע להשגת מרכיבים ביו-אקטיביים יקרי ערך ורב-תכליתיים גדל ללא הרף. בעבודה זו, אנו חוקרים את הפוטנציאל של Gracilaria gracilis, אצה אדומה אכילה, המעובדת ברחבי העולם בשל העניין המסחרי שלה כמקור לאגר ומרכיבים אחרים ליישומים קוסמטיים, פרמקולוגיים, מזון והזנה.
תנאי הגידול של G. gracilis עברו אופטימיזציה באמצעות ריבוי וגטטיבי ונבגים תוך מניפולציה של התנאים הפיזיקוכימיים כדי להשיג מלאי ביומסה גדול. מתודולוגיות מיצוי ירוקות עם אתנול ומים בוצעו על גבי ביומסה של אצות. הפוטנציאל הביו-אקטיבי של תמציות הוערך באמצעות סדרה של בדיקות במבחנה בנוגע לציטוטוקסיות, נוגדות חמצון ותכונות אנטי-בקטריאליות שלהן. נוסף על כך, ביומסה של אצות מיובשות שולבה בפורמולות פסטה כדי להעלות את הערך התזונתי של המזון. פיגמנטים שהופקו מ- G. gracilis שולבו גם ביוגורט כצבע טבעי, ויציבותם הוערכה. שני המוצרים הוגשו להערכה של פאנל חושי מאומן למחצה שמטרתו להשיג את הנוסחה הסופית הטובה ביותר לפני ההגעה לשוק.
התוצאות תומכות ברבגוניות של G. gracilis בין אם הוא מיושם כביומסה שלמה, תמציות ו / או פיגמנטים. באמצעות יישום מספר פרוטוקולים מותאמים, עבודה זו מאפשרת פיתוח מוצרים בעלי פוטנציאל להרוויח בשוקי המזון, הקוסמטיקה והחקלאות הימית, קידום קיימות סביבתית וכלכלה מעגלית כחולה.
יתר על כן, ובהתאם לגישת הזיקוק הביולוגי, הביומסה השיורית של האצות תשמש כביוסטימולנט לגידול צמחים או תומר לחומרי פחמן שישמשו לטיהור מים של מערכות החקלאות הימית של MARE-Polytechnic מלייריה, פורטוגל.
אצות ים יכולות להיחשב כחומר גלם טבעי מעניין שיש להרוויח ממנו על ידי מגזרי התרופות, המזון, המזון ואיכות הסביבה. הם מסנתזים ביולוגית מגוון של מולקולות, רבות מהן אינן נמצאות באורגניזמים יבשתיים, עם תכונות ביולוגיות רלוונטיות 1,2. עם זאת, פרוטוקולי גידול אופטימליים לאצות ים צריכים להיות מיושמים כדי להבטיח מלאי ביומסה גדול.
שיטות גידול חייבות תמיד לקחת בחשבון את אופי התאלי האצות ואת המורפולוגיה הכוללת. Gracilaria gracilis הוא טקסון משובט, כלומר איבר ההתקשרות מייצר מספר צירים צמחיים. כך מושגת התפשטות על ידי פיצול (רבייה וגטטיבית), שכן כל אחד מהצירים הללו מסוגל לאמץ חיים עצמאיים מהתאלוס הראשי3. טקסה קלונלית יכולה להשתלב בהצלחה עם מתודולוגיות גידול פשוטות ומהירות בצעד אחד, שכן כמויות גדולות של ביומסה מתקבלות על ידי פיצול התאלוס למקטעים קטנים המתחדשים במהירות וגדלים לפרטים חדשים זהים גנטית. ניתן להשתמש הן בתאלי הפלונטי והן בתאלי הדיפלונטי בתהליך זה. אף על פי שהסוג מציג מחזור חיים משולש איזומורפי הפלו-דיפלונטי מורכב, רק לעתים רחוקות יש צורך בנבגים, למעט כאשר נדרשת התחדשות גנטית של המלאי כדי להשיג יבולים משופרים. במקרה זה, הן tetraspores (נבגים haplontic שנוצרו על ידי meiosis) ו carpospores (נבגים דיפלונטיים שנוצרו על ידי מיטוזה) ליצור thalli macroscopic כי אז ניתן לגדל ולהפיץ על ידי רבייה צמחית4. מחזורי הצמיחה מוכתבים על ידי התנאים הסביבתיים והמצב הפיזיולוגי של הפרטים, בין גורמים ביולוגיים אחרים כגון הופעתם של אפיפיטים והיצמדות של אורגניזמים אחרים. לכן, אופטימיזציה של תנאי הגידול חיונית כדי להבטיח פרודוקטיביות גבוהה ולייצר ביומסה באיכות טובה5.
מיצוי של תרכובות ביו-אקטיביות מאצות, כולל G. gracilis, יכול להיות מושג בשיטות שונות 6,7. בחירת שיטת המיצוי תלויה בתרכובות העניין הספציפיות, ביישום היעד ובמאפייני האצות. במחקר זה התמקדנו במיצוי ממסים, הכולל שימוש בממסים ירוקים, כגון מים או אתנול, כדי להמיס ולמצות תרכובות ביו-אקטיביות מהביומסה של האצות. המיצוי יכול להתבצע באמצעות maceration בצורה תכליתית ויעילה והוא יכול לשמש למגוון רחב של תרכובות. זוהי שיטה פשוטה ונפוצה הכוללת השריית ביומסה בממס לתקופה ממושכת, בדרך כלל בטמפרטורות החדר או מעט גבוהות. את הממס מערבבים כדי לשפר את תהליך המיצוי. לאחר זמן המיצוי הרצוי, הממס מופרד מהחומר המוצק על ידי סינון או צנטריפוגה.
מים הם ממס נפוץ ביישומי מזון בשל בטיחותם, זמינותם והתאמתם למגוון רחב של מוצרי מזון. מיצוי מים מתאים לתרכובות קוטביות כגון רב-סוכרים, פפטידים ופנולים מסוימים. עם זאת, ייתכן שהוא לא יחלץ ביעילות תרכובות שאינן קוטביות. אתנול הוא גם ממס בשימוש נרחב ביישומי מזון והוא יכול להיות יעיל למיצוי מגוון מולקולות ביו-אקטיביות, כולל תרכובות פנוליות, פלבנואידים ופיגמנטים מסוימים. אתנול מוכר בדרך כלל כבטוח לשימוש במזון וניתן להתאדות בקלות, תוך השארת התרכובות המחולצות מאחור. ראוי לציין כי הבחירה של שיטת מיצוי צריך לשקול גורמים כגון יעילות, סלקטיביות, עלות-תועלת, והשפעה על הסביבה. אופטימיזציה של פרמטרים של מיצוי, כגון ריכוז הממס, זמן המיצוי, הטמפרטורה והלחץ, חיונית להשגת יבולים אופטימליים של תרכובות ביו-אקטיביות מ- G. gracilis או מאצות אחרות.
נמצא כי אצות ים מפגינות פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים, כולל חיידקים, פטריות ונגיפים8. פעילות זו מיוחסת לרכיבים ביו-אקטיביים, כולל פנולים, רב-סוכרים, פפטידים וחומצות שומן. מספר מחקרים הוכיחו את יעילותם נגד פתוגנים כגון Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. ו – Pseudomonas aeruginosa, בין היתר9. הפעילות האנטי-בקטריאלית של אצות מיוחסת לנוכחות של תרכובות ביו-אקטיביות שיכולות להפריע לדפנות התאים המיקרוביאליים, לממברנות, לאנזימים ולמסלולי איתות10. תרכובות אלה עלולות לשבש את גדילת החיידקים, לעכב היווצרות ביופילם ולווסת תגובות חיסוניות.
אצות אדומות, הידועות גם בשם רודופיטים, הן קבוצה של אצות שיכולות להפגין פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד מגוון מיקרואורגניזמים. בתוך קבוצה זו, G. gracilis מכיל תרכובות ביו-אקטיביות שונות שעשויות לתרום לפעילות האנטי-מיקרוביאלית המדווחת שלו. בעוד שהמולקולות הספציפיות יכולות להשתנות, הסוגים הנפוצים שדווחו ב- G. gracilis ועשויים להיות בעלי תכונות מיקרוביאליות הם רב-סוכרים, פנולים, טרפנואידים ופיגמנטים11. עם זאת, חשוב לציין כי נוכחותם וכמותם של רכיבים אלה יכולה להשתנות בהתאם לגורמים כגון מיקום איסוף האצות, עונתיות, מצב פיזיולוגי של התאלי ותנאי הסביבה. לכן, הסוג והריכוז הספציפיים של תרכובות מיקרוביאליות ב- G. gracilis עשויים להשתנות בהתאם.
G. gracilis נמצא גם כבעל תכונות נוגדות חמצון, המכילות תרכובות פנוליות שונות, אשר הוכחו כמסלקות רדיקלים חופשיים ומפחיתות עקה חמצונית12.נוגדי חמצון עוזרים להגן על התאים מפני נזקים שנגרמים על-ידי מיני חמצן תגובתיים, ויש להם יתרונות בריאותיים פוטנציאליים. ניתן להעריך את יכולת נוגדי החמצון ישירות באמצעות שיטות שונות, כולל פעילות ניקוי רדיקלים חופשיים 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), ובעקיפין, באמצעות כימות התוכן הפוליפנולי הכולל (TPC)13.
למרות שמדווח שלמרכיב יש פעילות ביולוגית בולטת, הערכת ציטוטוקסיות שלו היא הכרחית בהערכת חומרים טבעיים וסינתטיים שישמשו במגע עם תאים או רקמות חיים. ישנן מספר שיטות למדידת ציטוטוקסיות, כל אחת עם יתרונות ומגבלות. בסך הכל, הם מציעים מגוון אפשרויות להעריך את ההשפעות המזיקות של חומרים רבים על תאים, ובו בזמן, לחקור את המנגנונים של נזק לתאים ומוות14.
בעבודה זו, אנו משתמשים 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, שיטה קולורימטרית שהוצגה על ידי Mosmann (1983)15. שיטה זו מודדת את הפחתת מלחי הטטרזוליום לתוצר פורמזן סגול על ידי תאים פעילים מטבולית. ככל שכמות גבישי הפורמזן גבוהה יותר, כך גדל מספר התאים בני הקיימא, ובכך ניתן מדד עקיף לציטוטוקסיות14. מכיוון שבעבודה זו, תמציות מים ואתנול של G. gracilis מיועדות להשתלב בפורמולציות דרמו-קוסמטיות, הערכת ציטוטוקסיות במבחנה מבוצעת בקו תאי קרטינוציטים (HaCaT).
לגבי יישום המזון, אצות ים בדרך כלל דלות קלוריות ועשירות מבחינה תזונתית בסיבים תזונתיים, יסודות חיוניים וחומצות אמינו, פוליסכרידים, חומצות שומן רב בלתי רוויות, פוליפנולים וויטמינים 2,16. G. gracilis אינו יוצא מן הכלל, בעל ערך תזונתי מעניין. Freitas et al. (2021)4 מצאו כי G. gracilis מתורבת היה בעל רמות גבוהות יותר של חלבון וויטמין C ושמר על רמת השומנים הכוללת בהשוואה לאצות בר. הדבר עשוי להוות יתרון כלכלי וסביבתי, שכן מבחינה תזונתית הייצור עדיף על ניצול משאבי הבר. בנוסף, הצרכנים מודאגים יותר ויותר מסוג המזון שהם אוכלים, ולכן חשוב להכניס מרכיבים חדשים להעשרת המזון ולהשתמש במשאבים חדשים כדי להשיג תמציות שיכולות להוסיף ערך למוצר ולטעון ל”תווית נקייה”. חוץ מזה, השוק הנוכחי הוא תחרותי מאוד, הדורש פיתוח של מוצרים חדשים ואסטרטגיות חדשניות כדי להבדיל יצרנים מן המתחרים שלהם17.
העשרת מוצרים בעלי ערך תזונתי ירוד, כגון פסטה, במשאבים ימיים, כולל אצות, היא אסטרטגיה להחדרת משאב זה כמזון חדש וכאסטרטגיית בידול שוק באמצעות מוצר בעל ערך תזונתי מובהק. מצד שני, G. gracilis הוא מקור של פיגמנטים אדומים טבעיים כגון phycobiliproteins18, בעל פוטנציאל גבוה ליישומים בתעשיית המזון. אצה זו הראתה עניין רב במספר תחומים, וניתן ליישם אותה באמצעות אצות שלמות, תמציות ו / או הביומסה שנותרה. בעבודה זו, אנו מדגימים כמה דוגמאות של יישומים כאלה.
בדיקות הפעילות האנטי-מיקרוביאלית בתווך נוזלי משמשות להערכת יעילותם של חומרים אנטי-מיקרוביאליים כנגד מיקרואורגניזמים המרחפים בתווך נוזלי ומבוצעות בדרך כלל כדי לקבוע את יכולתו של חומר לעכב גדילה או להרוג מיקרואורגניזמים 35,36,37,38<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT) באמצעות פרויקטים אסטרטגיים שהוענקו למרכז MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 ו- UIDB/04292/2020), ולמעבדה עמיתה ARNET (LA/P/0069/2020). FCT גם מימנה את מענקי הדוקטורט האישיים שהוענקו למרתה ו. פרייטס (UI/BD/150957/2021) וטטיאנה פריירה (2021. 07791. ב”ד). עבודה זו נתמכה כספית גם על ידי פרויקט HP4A – פסטה בריאה לכולם (קידום משותף מס ‘039952), במימון משותף של ERDF – הקרן האירופית לפיתוח אזורי, במסגרת תוכנית פורטוגל 2020, באמצעות COMPETE 2020 – תחרותיות ובינאום תוכנית תפעולית.
Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
Microplates | Greiner | 738-0168 | |
Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |