Une méthode pour le 2-Photon Imaging du flux sanguin dans le néocortex travers une fenêtre crânienne

Summary

Cortical dynamique du flux sanguin peut être étudiée in vivo par imagerie colorants fluorescents dextran injecté dans la veine caudale de rongeurs avec 2 microscopie biphotonique. Cette vidéo montre comment la dynamique de l'image du flux sanguin dans le néocortex de souris à travers un verre recouvert de la préparation fenêtre crânienne.

Abstract

La capacité de l'image du système vasculaire cérébral (à partir de grands navires de capillaires) et la dynamique d'enregistrement du débit sanguin dans le cerveau intact de rongeurs vivants est une technique puissante. L'utilisation in vivo 2-microscopie biphotonique à travers une fenêtre crânienne il est possible de colorants image fluorescente injectée par voie intraveineuse. Cela permet un à l'image de la vascularisation corticale et aussi pour obtenir des mesures du flux sanguin. Cette technique a été initialement développé par David Kleinfeld et Winfried Denk. La méthode peut être utilisée pour étudier la dynamique des flux de sang pendant ou après une ischémie cérébrale, de maladies neurodégénératives, dans les tumeurs du cerveau, ou dans la physiologie du cerveau normal. Par exemple, il a été utilisé pour étudier comment un AVC provoque des changements dans la direction du flux sanguin et des changements dans la vitesse des globules rouges ou de flux dans et autour de l'infarctus. Ici, nous montrent comment utiliser deux microscopie biphotonique à la dynamique d'image du flux sanguin dans le néocortex de souris vivantes en utilisant des colorants fluorescents injectés dans la veine de la queue.

Protocol

Injections veine de la queue de colorants fluorescents dextranes

1. En vue de la vascularisation cérébrale l'image, les animaux doivent être injecté par voie intraveineuse avec un colorant fluorescent. Nous utilisons le dextran conjugué colorants parce que la fraction de dextran empêche le colorant de traverser la barrière hémato-encéphalique et la fuite des vaisseaux sanguins.
2. Les souris sont anesthésiés à l'isoflurane (4% pour l'induction, de 1,5-2% lors de l'injection).
3. La queue est désinfectée avec de l'alcool à 70%.
4. Avec une aiguille de calibre 26, 75-100 ul d'un 5% v / v de solution de rhodamine dextrane dissous dans une solution saline est injectée à travers la veine de la queue, à mi-chemin de l'arbre de la queue.
5. Les animaux peuvent être imagées immédiatement après l'injection veine de la queue jusqu'à ce que le colorant est excrétée dans l'urine, qui deviennent roses si vous utilisez un colorant rhodamine dans environ 2 heures.

L'imagerie du flux sanguin à l'aide microscopie à deux photons (durée totale 30-60 min par séance, en fonction du nombre de navires imagé)

1. Après l'injection de colorant fluorescent dextran, la souris est anesthésiés à l'isoflurane (4% pour l'induction de 1-1,5% pour l'imagerie).
2. La souris est fermement attaché à l'aide de la barre de titane pour la platine du microscope, qui contient un coussin chauffant thermo-régulée pour garder l'animal au chaud. Certains pommade est appliquée à garder les yeux humides.
3. Le couvercle en verre de la fenêtre crânienne est nettoyé avec de l'alcool à 70%.
4. La fenêtre est positionnée parallèlement au plan focal et centré dans le champ de vision sous l'objectif 4X.
5. Il est préférable de prendre une photographie de la surface du cerveau des navires avec un appareil photo numérique. Cette image sera utilisée comme image de référence dans la suite des séances d'imagerie pour trouver la région imagée reprises de jour en jour.
6. L'objectif 4X est remplacé par l'objectif à immersion d'eau 40X sans bouger la scène. Une image numérique du champ de vue est repris. Les coordonnées à l'étape de manipulateur sont mis à zéro.
7. Nous utilisons scanimage comme le logiciel d'acquisition d'image. Ceci a été écrit en Matlab par Tom Pologruto et Bernardo Sabatini dans le laboratoire de Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Nous passons ensuite sur tous les autres équipements: le laser, le compteur de puissance, les tubes photo multiplicateurs, les amplificateurs, etc
8. La zone de la fenêtre adaptée à imager est brièvement numérisés à faible grossissement de trouver les meilleures régions. Une fois ces points identifiés, une pile faible grossissement de la région choisie pour l'image est prise, et ses coordonnées XY sont annotées.
9. Pour enregistrer la dynamique du flux sanguin dans les petits vaisseaux capillaires ou de scans que nous utilisons la ligne le long d'au moins 40 um de la cuve d'intérêt. Ces simples "balaie" une durée d'une seconde sont fait en utilisant la puissance du laser en tant peu que possible et les coordonnées et l'angle de balayage sont écrites.
10. Une fois la séance d'imagerie est terminée, l'animal est déplacé d'une chambre chaude où il peut récupérer de l'anesthésie.

Discussion

Cortical dynamique du flux sanguin peut être étudiée in vivo par imagerie colorants fluorescents dextran injecté dans la veine caudale de rongeurs avec microscopie à deux photons. Cette vidéo montre une méthode pour savoir comment la dynamique de l'image du flux sanguin dans le néocortex de souris à travers un verre recouvert de la préparation fenêtre crânienne.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD500S	mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~70,000