Summary
协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。
Abstract
家庭
Protocol
第1部分：从RNA合成cDNA
- 使用Ambion公司氨基烯丙基MessageAmp II套件之前，建议量的100％的乙醇添加到洗缓冲区。
- 在PCR反应管中，加之间100ng的总RNA，以oligo（dT）引物的T7加入1μl5μg。把音量无核酸酶水至12μl。
- 孵育样品在70℃，在热循环10分钟。
- 删除从70℃，短暂离心的RNA样品。置于冰上。
- 准备的第一链合成预混，并保持在室温（10％的移液错误的盘盈）（见表 1）。
- 轻轻吸预混或轻弹混合，然后短暂离心。
- 将主结构8μl转移到每个RNA样品。混合移液器向上和向下的3-4倍。
- 在42 ° C孵育2小时在热循环。
- 离心机样本简要置于冰上。立即进行下一步的双链DNA合成。
- 准备在冰第二链的合成大师的组合（10％的移液错误的盘盈）（表 2）
- 轻轻吸预混或轻弹混合，然后短暂离心。
- 每个样品转移80μl，轻轻混匀移液器向上和向下的3-4倍。
- 在16℃孵育2小时在热循环。
- 经过2个小时的潜伏期，进行cDNA的清理步骤，或立即冻结在-20 ° C。
第2部分：双链cDNA清理
- 从冰箱中取出的cDNA纯，并允许它在使用前30分钟平衡至室温。摇动瓶子在使用前要充分重悬磁cDNA的约束力珠。
- 分装成1.5ml离心管，并在50-60 ° C孵育至少10分钟，在过去的2小时潜伏期无核酸酶水。
- 每个样品添加纯180μl的cDNA，并彻底混合向上和向下吹打。样品转移到一个96孔的圆底板。
- 继续混合样品至少2分钟，轻轻晃动轨道摇床板。
- 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。留在板约6分钟的立场，或直到混合物变得透明和结合珠颗粒。
- 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。
- 删除从磁立场板。
- 加入150μlcDNA的洗涤缓冲液，每孔摇动1分钟，速度适中的轨道摇床板。珠不会分散在这一步，由于洗涤缓冲液的表面张力低。
- 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。
- 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。
- 删除从磁立场板。
- 重复与150μlcDNA的洗涤缓冲液洗2 次的时间。
- 之后的第2 次洗，干燥摇晃以最快的速度为2分钟轨道摇床板的珠子。不要overdry！
- 每个样品加入18μl预热无核酸酶水洗脱珠的cDNA。
- 大力动摇盘3分钟轨道摇床，然后检查，以确保磁珠完全散去。如果没有，继续摇晃。
- 一旦磁珠完全散去，移动板磁性的立场，以捕获磁珠。
- 小心地转移到一个新的PCR板（或PCR管）洗脱的cDNA（〜16μl）。
- 直接进入下一步，或冻结在-20 ° C的cDNA
第3部分： 体外转录（IVT）
- 准备在室温下的IVT 预混（见表3 ）
- 轻轻吸液管硕士的组合或轻弹混合，并短暂离心。
- 每个样品中加入24μl，轻轻混匀移液器向上和向下的3-4倍。
- 在37 ° C孵育14小时的热循环，然后保持在4 ° C，直到为下一步做好准备。
第4部分：ARNA干净后IVT
- 旋涡RNA结合珠简要地获取，使用前均匀混合。
- （见表4）这是可以做到提前准备ARNA绑定混合，在室温下-可以在室温下储存长达一个星期的准备约束力混合。
- 由涡旋混合。
- 分装成1.5ml离心管，并在50-60℃孵育至少10分钟的ARNA洗脱缓冲液。
- 添加ARNA约束力混合70μl每个样品中，拌匀移液器向上和向下的3-4倍。
- 样品PCR板转移到一个96孔的圆底板。
- 100％异丙醇每个样品中加入50μL拌匀移液器向上和向下的3-4倍。
- 轻轻摇动至少2分钟，轨道摇床板，彻底混合样品。
- 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。离开盘上的立场，直到混合物变得透明和约束力珠颗粒。
- 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。
- 删除从磁立场板。
- 加入100μLARNA每口井的清洗液，摇动1分钟，速度适中的轨道摇床板。珠可能无法完全分散在这一步。
- 移动板磁性的立场，以捕获磁珠。
- 小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。
- 删除从磁立场板。
- 重复100μLARNA清洗液洗了第二 。
- 之后的第2 次洗，干燥摇晃以最快的速度为1分钟的轨道摇床板的珠子。不要overdry的样品！
- 每个样品加入40μl预热ARNA洗脱液洗脱珠ARNA。
- 大力动摇盘3分钟轨道摇床，然后检查，以确保磁珠完全散去。如果没有，继续摇晃。
- 一旦磁珠完全散去，移动板磁性的立场，以捕获磁珠。上清包含清理氨基烯丙基纳入ARNA。
- 洗脱ARNA小心地转移到一个新的PCR板（或PCR管）。
- （可选步骤）检查上NanoDrop分光光度计测量1.5μlRNA浓度的样品。
- 立即继续到下一个步骤，或存放于-80℃的ARNA ° C。
表1：cDNA的第一链合成预混
| 试剂 | 金额为1反应 |
| 10X第一链缓冲 | 2μL |
| dNTP混合液 | 4μL |
| 核糖核酸酶抑制因子 | 1μL |
| 阵列脚本 | 1μL |
表2：cDNA的第二链合成预混
| 试剂 | 金额为1反应 |
| 核酸免费水 | 63μL |
| 10X第二链缓冲 | 10μL |
| dNTP混合液 | 4μL |
| DNA聚合酶 | 2μL |
| 核糖核酸酶H | 1μL |
表3：IVT中的master mix
| 试剂 | 金额为1反应 |
| aaUTP解决方案（75毫米） | 2μL |
| ATP，CTP，GTP的组合（25毫米） | 12μL |
| T7 UTP解决方案（75毫米） | 2μL |
| T7 10X反应缓冲液 | 4μL |
| T7酶混合物 | 4μL |
表4：ARNA绑定混合
| 试剂 | 金额为1反应 |
| 核糖核酸*装订珠 | 10μL |
| 珠再悬浮解决方案* | 4μL |
| 100％的异丙醇** | 6μL |
| ARNA绑定缓冲液 | 50μL |
*混合RNA结合珠与珠再悬浮溶液。
**添加异丙醇和拌匀之前加入ARNA结合缓冲液。
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Discussion
关键步骤
一个放大的第二轮，是不是表示已经观察到数组中的数据的偏差。仔细搅拌在每个酶一步（ 第一和第二链cDNA合成，IVT），取得了良好的扩增产量的关键，是在适当的温度孵化每个酶一步。一个可调节的热盖的PCR基因扩增仪是首选 - 甚至偏差，在IVT中为2-3度，空气杂交烘箱或水浴杂交小，可以显着影响产量的扩增产物。
应用程序/意义
人类，病毒，或自定义芯片杂交标记的RNA可以从本议定书，以评估在文化感染的细胞的基因表达反应。微阵列平台各不相同，因此按照制造商的指示标记的探针杂交混合物的准备。
使用定制设计痘阵列1，我们可以分为“早”或“迟到”的基础上杂交信号的时间和病毒DNA的复制是否成绩单检测所需的一般分类的基因。我们观察到预期在每个颞类中的基因的功能类别（即，预计早期，中期和晚期基因）的转录的确切时间的变化。
在这项工作中利用该方法能够预测病毒的基因转录的早期或在复制周期的后期，但有更多的困难与早期和晚期启动子的基因，因为采用了双早/晚启动成绩单区分早期只可能坚持和检测到后期倍。此外，通过后期病毒基因的转录运行可能影响在一个给定的探头/阵列上的即期的信号，作为杂交到阵列的RNA可以从指定的ORF或上游的ORF来。平铺阵列曾试图解决这个问题，但挑战依然存在通过使用杂交2,3,4为基础的方法检测转录运行在。
主机转录模式，也可以使用这些方法进行评估。然而，牛痘编码多种机制抑制宿主反应，和主机转录反应可能会减少，比5,6,7,8等刺激。由于在参与宿主的防御许多基因的表达，感染后的改变，对抗宿主的免疫反应的病毒基因的贡献，因此考虑。
利用这些方法，可确定的所有病毒基因的转录时间图谱，并询问未知病毒基因的功能。此外，这些方法可以用来解剖病毒与宿主之间复杂的对话。这些方法被广泛适用于其他的宿主 - 病原体感染系统。如果感兴趣的病原体没有聚腺苷酸化的mRNA的，可供选择的方法可直接用于标签的总RNA，没有线性放大。通过在主机和同步感染病毒的基因表达分析，这些方法使我们能够获得的洞察力与宿主细胞环境，以及对病毒感染的主机反防御到病毒的相互作用。
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Acknowledgments
怀特黑德研究所的研究员基金
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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