Summary
Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 2 из 3.
Abstract
Семья
Protocol
Часть 1: синтеза кДНК из РНК
- Перед использованием Амбион Amino Аллил MessageAmp II комплекта, добавьте рекомендуемый объем в размере 100% этанола, мыть буферов.
- В трубке реакции ПЦР, добавьте между 100ng к 5 мкг тотальной РНК и 1 мкл Т7 олиго (дТ) грунт. Довести объем до 12μl с нуклеазы без воды.
- Инкубируйте образцы при температуре 70 ° С в течение 10 мин в амплификаторе.
- Удалить РНК образцов от 70 ° С и центрифуги кратко. Место на льду.
- Подготовка 1-й Strand Синтез мастер перемешать и хранить при комнатной температуре (с 10% превышения для пипетирования ошибка). (Таблица 1)
- Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, а затем центрифуги кратко.
- Передача 8μl из Master Mix к каждой пробе РНК. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз по 3-4 раза.
- Инкубировать при 42 ° С в течение 2 часов в амплификаторе.
- Центрифуга образцы на короткое время и место на льду. Сразу же переходите к следующему шагу синтеза двухцепочечной ДНК.
- Подготовка 2-й Strand Синтез мастер смеси на льду (с 10% превышения для пипетирования ошибка). (Табл. 2)
- Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, а затем центрифуги кратко.
- Передача 80μl к каждому образцу и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
- Инкубировать при 16 ° С в течение 2 часов в амплификаторе.
- После 2 часов инкубации, приступить к кДНК очистке шаг или немедленно заморозить при -20 ° C.
Часть 2: двухцепочечной кДНК очистке
- Удалить кДНК Чистый из холодильника и дайте ему, чтобы уравновесить до комнатной температуры в течение 30 минут перед использованием. Встряхните бутылку, чтобы полностью ресуспендирования магнитного кДНК обязательным бисер перед использованием.
- Алиготе нуклеазы без воды в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение минимум 10 минут в течение предыдущего 2hr инкубации.
- Добавить 180μl кДНК Чистая для каждого образца, и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Передача образцов для 96-луночного круглым дном тарелку.
- Продолжайте смешивать образцы, осторожно покачивая пластину на орбитальном шейкере в течение 2 минут.
- Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде в течение приблизительно 6 минут, или пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
- Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
- Удалите пластину из магнитного стенда.
- Добавить 150 мкл кДНК промывочного буфера в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бисер НЕ разойдутся на этом этапе, в связи с низким поверхностным натяжением из промывочного буфера.
- Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
- Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
- Удалите пластину из магнитного стенда.
- Повторите мыть 2-й раз с 150 мкл кДНК промывочного буфера.
- После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 2 минут на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить!
- Элюировать кДНК из бисера, добавив 18μl из разогретой нуклеазы без воды каждого образца.
- Энергично встряхните пластине в течение 3 минут на орбитальном шейкере, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
- После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков.
- Тщательно передачи элюировали кДНК (~ 16μl) для новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
- Перейдем непосредственно к следующему шагу, или заморозить кДНК при температуре -20 ° C.
Часть 3: в пробирке транскрипции (ИВТ)
- Подготовьте смесь IVT мастер при комнатной температуре. (Табл. 3)
- Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, и центрифуга кратко.
- Добавить 24μl для каждого образца, и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 14 часов в амплификаторе, затем, удерживая при 4 ° С до готовности для следующего шага.
Часть 4: Арна очистке после IVT
- Vortex связывание РНК бисером кратко получить даже смесь перед использованием.
- Подготовка Арна Связывание Смешать при комнатной температуре (табл. 4) Это может быть сделано загодя -. Подготовлены обязательным смесь можно хранить при комнатной температуре на срок до одной недели.
- Хорошо перемешайте на вортексе.
- Алиготе буфера Арна Элюирование в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение не менее 10 минут.
- Добавить 70μl из Арна обязательным смесидля каждого образца и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 3-4 раза.
- Передача образца от пластины ПЦР для 96-луночного круглым дном тарелку.
- Добавить 50 мкл 100% изопропанола к каждому образцу и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза.
- Осторожно встряхните пластину на орбитальный шейкер, по крайней мере 2 минуты для тщательного перемешивания образцов.
- Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде, пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный.
- Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
- Удалите пластину из магнитного стенда.
- Добавить 100 мкл Арна промывочного раствора в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бусины могут не расходиться на этот шаг.
- Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус.
- Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант.
- Удалите пластину из магнитного стенда.
- Повторите мыть 2-й раз с 100 мкл промывочного раствора Арна.
- После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить образцы!
- Элюировать Арна из бисера, добавив 40μl разогретой Элюирование Арна буфера для каждого образца.
- Энергично встряхните пластину на орбитальном шейкере в течение 3 минут, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать.
- После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. Супернатант содержит очищенный амино-аллил включены Арна.
- Тщательно передачи элюировали Арна к новой пластинкой ПЦР (или ПЦР).
- (Необязательный шаг) Проверьте концентрацию РНК образцов путем измерения 1.5μl на NanoDrop спектрофотометр.
- Сразу же продолжать на следующий шаг, и не храните Арна при температуре -80 ° C.
Таблица 1: 1-й кДНК Strand Синтез Master Mix
| Реагент | Сумма за 1 реакция |
| 10X первый буфер Strand | 2 мкл |
| дНТФ Mix | 4 мкл |
| Ингибитор рибонуклеазы | 1 мкл |
| Массив сценарий | 1 мкл |
Таблица 2: 2-й кДНК Strand Синтез Master Mix
| Реагент | Сумма за 1 реакция |
| Нуклеазы свободной воды | 63 мкл |
| Второй 10X буфера Strand | 10 мкл |
| дНТФ Mix | 4 мкл |
| ДНК-полимераза | 2 мкл |
| РНКазы Н | 1 мкл |
Таблица 3: IVT Master Mix
| Реагент | Сумма за 1 реакция |
| aaUTP решение (75 мм) | 2 мкл |
| АТФ, CTP, GTP смеси (25 мМ) | 12 мкл |
| T7 UTP решение (75 мм) | 2 мкл |
| T7 10X буфера реакции | 4 мкл |
| T7 ферментов Mix | 4 мкл |
Таблица 4: Связывание Арна Mix
| Реагент | Сумма за 1 реакция |
| Связывание РНК бисер * | 10 мкл |
| Бусы ресуспендирования Решение * | 4 мкл |
| 100% изопропанола ** | 6 мкл |
| Арна Связывание Концентрат буфера | 50 мкл |
* Смешать связывание РНК бисер с борта решение ресуспендирования в первую очередь.
** Добавьте изопропанола и хорошо перемешать перед добавлением Арна обязательным концентрат буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические Шаги
Второй тур усиления не рекомендуется в качестве смещения в массиве данных не наблюдалось. Смешивание тщательно на каждом шагу ферментативной (1-й и 2-й цепи кДНК синтеза, IVT) имеет решающее значение для получения хороших урожаев усиления, как инкубационный каждого ферментативного шаг при соответствующей температуре. Циклер ПЦР с регулируемым подогревом крышкой предпочтительнее - даже отклонения как малые, как 2-3 градуса в течение IVT в печь воздуха гибридизации или гибридизации водяной бане могут существенно повлиять на выход продукта усиливается.
Применение / Значение
Меченой РНК в результате такой протокол может быть гибридизированных к человеку, вирусные, или пользовательские микрочипы, чтобы оценить реакцию экспрессии генов в инфицированных клетках в культуре. Microarray платформах меняются, поэтому следуйте инструкции производителя для приготовления смеси из гибридизации меченого зонда.
Использование специально созданных poxvirus массив 1, мы смогли классифицировать гены в общие категории "рано" или "поздно", основанный на сроках гибридизации сигнала и действительно ли вирусной репликации ДНК, необходимые для стенограммы обнаружения. Мы наблюдали ожидается функциональных категорий генов в каждой временной класса (то есть, ожидается в начале, промежуточных и поздних генов) изменения, чтобы точные сроки транскрипции.
Методы, используемые в этой работе, в состоянии предсказать транскрипции генов вируса рано или поздно в цикл репликации, но труднее отличительной раннего только против генов с ранней и поздней промоутер с стенограммы с двойным раннего / позднего промотора может сохраняться и быть обнаружено на поздних временах. Кроме того, прогон транскрипции поздних вирусных генов могут влиять на сигнал в данный зонд / пятна на линейке, а РНК-гибридизации с массивом может исходить из назначенных ORF или вверх по течению ORF. Черепица массивы пытались решить эту проблему, однако проблемы остаются в обнаружении пробегать транскрипции использованием гибридизации подходов 2,3,4.
Хост транскрипционной модели также может быть оценена с помощью этих методов. Тем не менее, вакцины кодирует различные механизмы для подавления хоста ответов, и принимающих транскрипционный ответ может быть уменьшена по сравнению с другими стимулами 5,6,7,8. Так как выражение многих генов, участвующих в защите организма меняется после заражения, вклад вирусных генов, которые противодействуют иммунного ответа должны быть приняты во внимание.
Используя эти методы, карта транскрипционной сроки все вирусные гены могут быть выявлены и использованы для допроса функций от неизвестных вирусных генов. Кроме того, эти методы могут быть использованы, чтобы вскрыть сложные диалога между вирусом и хозяином. Эти методы широко применимы для других хост-системами возбудителя инфекции. Если возбудитель интереса не указал полиаденилированной мРНК, альтернативные методы могут быть использованы непосредственно этикетке общей РНК, без линейного усиления. Анализируя хозяина и выражение гена вируса во время синхронного инфекции, эти методы позволяют получить представление о взаимодействии вируса с принимающей клеточного окружения, а также принимающих против защиты от вирусной инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Уайтхед Институт стипендиаты фондов
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
