Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray
Summary
L'ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d'expression génique dans le pin taeda,<em> P. taeda</em>, Et d'autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.
Abstract
PtGen2 est une puce 26496 fonction d'ADNc contenant amplifié ESTs pin blanc. Le tableau est produit dans notre laboratoire pour une utilisation par les chercheurs qui étudient l'expression des gènes dans les espèces de conifères et d'autres pins. PtGen2 a été élaboré à la suite de nos efforts de découverte de gènes chez le pin taeda, et est composé de séquences identifiées principalement par les tissus des racines, mais aussi de l'aiguille et la tige. PtGen2 1,2 a été testé par hybridation différents Cy-dye étiquetés ADNc cible de conifères , utilisant à la fois amplifié et non amplifié méthodes indirectes d'étiquetage, et aussi testé avec un certain nombre de conditions d'hybridation et de lavage. Cette vidéo se concentre sur la manipulation et le traitement des diapositives avant et après pré-hybridation, ainsi que, après hybridation, en utilisant certaines modifications aux procédures développées précédemment. Sont également inclus 3,4, sous forme de texte uniquement, sont les protocoles utilisés pour la production, l'étiquetage et le nettoyage des s ADNc cible, ainsi que des informations sur le logiciel utilisé pour le traitement des données en aval.
PtGen2 est imprimé avec un tampon d'impression exclusive qui contient de fortes concentrations de sel qui peut être difficile à enlever complètement. Les lames sont d'abord lavé dans une solution tiède de SDS avant de pré-hybridation. Après pré-hybridation, les lames sont lavées vigoureusement dans plusieurs changements d'eau pour l'élimination complète des sels restants. LifterSlips ™ sont ensuite nettoyées et positionnés sur les lames et les ADNc marqué est soigneusement chargée sur la puce par voie d'action capillaire qui prévoit une répartition uniforme de l'échantillon à travers la lame, et réduit le risque de constitution de bulles. L'hybridation des cibles pour le tableau est fait à 48 ° C dans des conditions de forte humidité. Après l'hybridation, une série de lavages standards sont effectuées à 53 ° C et la température ambiante pendant des périodes prolongées. Traitement PtGen2 diapositives en utilisant cette technique réduit le sel et le SDS dérivés artefacts souvent vu lorsque le tableau est traité moins rigoureusement. Hybridation des cibles à partir de plusieurs sources différentes ARN conifères, ce protocole de traitement donné moins d'artefacts, de fond réduit, et a fourni une meilleure cohérence entre les différents groupes expérimentaux de tableaux.
Protocol
Discussion
PtGen2 a été récemment développée, microréseaux d'ADNc personnalisée qui a été conçu pour être utilisé principalement par la communauté de recherche à encens de pin. Les résultats préliminaires généré à ce jour ont montré que le tableau à être un outil précieux dans l'évaluation des événements transcriptionnels qui se produisent en réponse à la sécheresse, ainsi que dans la surveillance des changements qui surviennent au cours du développement embryonnaire dans le pin maritime, <em…
Acknowledgements
L'étiquetage, l'hybridation et protocoles de lavage ici contiennent des modifications à celles développées antérieurement par le Dr J. Quackenbush tout à l'Institute for Genomic Research (TIGR), le Dr Shawn Levy à la ressource partagée Microarray Vanderbilt (VMSR), et le Dr Rob Alba alors à l'Institut Boyce Thompson, (RTC) Université Cornell.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | 其他 | Falcon™ | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | 其他 | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | 其他 | Wheaton™ | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | 其他 | Sigma™ | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
| LifterSlips™ | 其他 | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. . unpublished data. , .
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
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