КДНК микрочипов PtGen2 был разработан для изучения экспрессии генов в ладанной сосна,<em> П. taeda</em>, И других хвойных пород. Здесь мы покажем, пре-и пост-гибридизация обработки и мытья методов, которые могут быть использованы с этого массива для получения лучшей консистенции, снижение артефактов, и нижний фон.
PtGen2 это 26496 особенность кДНК микрочипов содержащие усиливается ЭБТ ладанной сосны. Массива производится в нашей лаборатории для исследователей изучения экспрессии генов в сосны и других хвойных пород. PtGen2 была разработана как результат наших генов открытие усилия в ладанной сосна, и состоит из последовательности определены в основном из ткани корней, но и от иглы и стебля. 1,2 PtGen2 была проверена путем гибридизации различных Су-красителя помечены кДНК хвойных целевой , используя как усиливается и без усилителей косвенных методов маркировки, а также протестированы с числом гибридизации и стиральные условиях. Это видео фокусируется на обработке и переработке слайды до и после предварительной гибридизации, а также после гибридизации, используя некоторые изменения в процедуры, разработанные ранее. 3,4 Также, в текстовом виде только в протоколах, используемых для производства, маркировки и очистки целевых кДНК с, а также информацию о программном обеспечении, используемом для последующей обработки данных.
PtGen2 печатается с собственной буфера печати, содержит высокую концентрацию солей, которые могут быть трудно удалить полностью. Слайды промывают сначала в теплом растворе SDS до предварительно гибридизации. После предварительного гибридизации, слайды моют энергично в нескольких сменах воды до полного удаления оставшихся солей. LifterSlips ™ затем очищается и устанавливается на слайды и помечены кДНК тщательно загружены на микрочипов путем капиллярного действия, который предусматривает равномерное распределение по всей образец слайдов, а также снижает шансы пузырь регистрации. Гибридизация целей для массива осуществляется на 48 ° C в условиях повышенной влажности. После гибридизации серии стандартных моет выполняются на 53 ° C и комнатной температуре в течение длительного времени. Обработка PtGen2 слайды с помощью этой техники уменьшает соль и SDS-производные артефакты часто видел, когда массив обрабатывается менее строго. Гибридизации цели основе нескольких различных хвойных источников РНК, эта обработка протокола дали меньше артефактов, снижение фона, и обеспечивает более полный согласованности между различными экспериментальными группами массивов.
PtGen2 является недавно разработанный, пользовательские кДНК микрочипов, который был предназначен для использования прежде всего научного сообщества сосны ладанной. Предварительные результаты, полученные к настоящему времени показали, массив будет ценным инструментом в оценке транск?…
Маркировки, гибридизации, и стиральная протоколов, содержат некоторые изменения, разработанные ранее д-ром Дж. Квакенбуш в то время как института геномных исследований (ТИГР), доктор Шон Леви в Вандербильта Microarray общему ресурсу (VMSR), и д-р Роб Альба в то Бойс Томпсон институт (БТИ) Корнельского университета.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma Aldrich | 34959-2.5L | |
50mL Conical Tubes | 其他 | Falcon™ | 352070 | |
15mL Conical Tubes | 其他 | Falcon™ | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
Coplin Jar | Wheaton™ | 900520 | ||
Staining Dish & Rack | 其他 | Wheaton™ | 900200 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | 其他 | Sigma™ | A-9418 | |
PolyA RNA | Invitrogen™ | POLYA.GF | ||
SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen™ | L1014-02 | |
Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
System | ||||
Cy-5 Dye | Reagent | GE™ | PA25001 | |
Cy-3 Dye | Reagent | GE™ | PA23001 | |
LifterSlips™ | 其他 | Erie Scientific Company™ | 25X601 | |
HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |