Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Abstract

Vollen Einblick in die Mechanismen der lebenden Zellen kann nur durch die Untersuchung der wichtigsten Prozesse, und entlocken direkte Ereignisse auf zellulärer Ebene erreicht werden. Bis heute ist die Scher-Komplexität biologischer Systeme ist präzise Einzel-Molekül-Experimente verursacht weit zu anspruchsvoll sein, anstatt sich auf Studien einzelner Systeme mit relativ groben Schüttgut Ensemble-gemittelten Messungen. Allerdings treten viele wichtige Prozesse in der lebenden Zelle auf der Ebene von nur einem oder einigen wenigen Molekülen, Ensemble-Messungen in der Regel Maske der stochastischen und heterogene Natur dieser Ereignisse. Hier, mit Hilfe modernster optischer Mikroskopie und analytische Bild-Analyse-Tools zeigen wir, wie Proteine ​​innerhalb einer einzelnen lebenden Bakterienzelle mit einer Genauigkeit von einzelnen Molekülen und wie können wir die Dynamik innerhalb molekulare Komplexe in funktionierenden biologischen Maschinen beobachten zu überwachen. Die Techniken sind direkt relevant physiologisch. Sie sind minimal-perturbative und nicht-invasive, um die biologische untersuchten Probe an und sind für Untersuchungen in lebenden Material abgestimmt, verfügt nicht ohne weiteres verfügbar zu anderen Einzel-Molekül-Ansätze der Biophysik. Darüber hinaus untersuchten die biologischen Proben alle produzieren Fluoreszenz-markierten Protein in Konzentrationen, die fast identisch mit den unveränderten Zellen Stämme ("genomische encoding"), im Gegensatz zu den häufigeren, aber weniger idealen Ansatz für die Erzeugung deutlich mehr Protein als würde natürlich vorkommen entgegengesetzt sind ("Plasmid Ausdruck"). So sind die tatsächlichen biologischen Proben, die untersucht werden soll deutlich näher an den natürlichen Organismen und damit die Beobachtungen mehr relevant echten physiologischen Prozessen.

Protocol

Zu Beginn dieses Verfahrens wurden 50 ul eingefroren Bestände fluoreszierendes Protein exprimieren Escherichia coli Bakterienzellen werden zunächst aufgetaut und aerob unter Schütteln in 5 ml LB Nährmedien über Nacht bei 37 Grad C. Am Morgen gewachsen ist 50 ul dieser gesättigten Kultur extrahiert und Subkultur in minimal M63 Glukose Kulturmedien, Inkubation bei 30 ° C für 4 bis 6 Stunden. Hier zeigen wir mit zwei verschiedenen Zell-Stämme, von denen ein Elektron-Transport drückt Cytochrom fusioniert an GFP, die ande…

Discussion

Es muss darauf geachtet nicht "über shear" Zelle für das Betrachten angebunden Bakterien, da dies die Funktionalität des Flagellen-Motoren beeinträchtigt werden. Es ist wichtig, um Zellen viel länger als eine Stunde einmal den Einsatz auf dem Objektträger, da sie sich möglicherweise Sauerstoff verbraucht. Erhebliche Optimierung erforderlich, um den besten Mikroskop Imaging Bedingungen gesorgt, spezifische biologische System untersucht werden. Es kann klug sein, um die Imaging unter Verwendung von gerein…